Articolo metodologico

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

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DOI:

10.3791/50951

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19 settembre 2013

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1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

In questo articolo

Sommario

Dettagli Questo protocollo un metodo per isolare le cellule presentanti l'antigene da timo umano attraverso diverse fasi di digestione enzimatica del tessuto seguita dalla densità centrifugazione della sospensione di cellule singole e smistamento finalmente magnetico e / o FACS delle popolazioni cellulari di interesse.

Abstract

In questo protocollo forniamo un metodo per isolare le cellule dendritiche (DC) e cellule epiteliali (TEC) dal timo umano. DC e TEC sono i principali cellule presentanti l'antigene (APC) tipi trovato in un timo normale ed è ben stabilito che essi svolgono ruoli distinti durante la selezione del timo. Queste cellule sono localizzate in microambienti distinti nel timo e ogni tipo APC rappresenta soltanto una frazione minore di cellule. Per capire meglio la biologia di questi tipi cellulari, caratterizzazione di queste popolazioni cellulari è altamente auspicabile, ma a causa della loro bassa frequenza, l'isolamento di uno qualsiasi di questi tipi cellulari richiede una procedura efficiente e riproducibile. Dettagli Questo protocollo un metodo per ottenere cellule adatte per la caratterizzazione di diverse proprietà cellulari. Tessuto timico è interrotta meccanicamente e dopo diverse fasi di digestione enzimatica, la sospensione cellulare risultante è arricchito con un passo centrifugazione densità Percoll. Per l'isolamento di DC mieloidi (CD11c <sup> +), le cellule della frazione a bassa densità (LDF) sono immunoselected da cell sorting magnetico. Arricchimento delle popolazioni TEC (MTEC, CTEC) si ottiene l'esaurimento delle emopoietiche (CD45 hi), le cellule dalla frazione di cellule Percoll a bassa densità che consente loro successivo isolamento tramite fluorescenza delle cellule attivate (FACS) utilizzando marcatori cellulari specifici. Le cellule isolate possono essere utilizzati per diverse applicazioni a valle.

Introduzione

Il timo è l'organo in cui avviene lo sviluppo delle cellule T. La sua dimensione relativa e assoluta diminuisce con l'età, quando viene successivamente sostituito da grasso, anche se l'attività del timo può ancora essere rilevata in età avanzata. La sua importanza per la risposta immunitaria è stata dimostrata nei primi anni del 1960 1.

Il repertorio di cellule T è sagomata attraverso l'interazione di recettori delle cellule T con complessi peptide-MHC su diversi tipi di timica APC, che forniscono sopravvivenza o morte spunti per sviluppare cellule T, risultando in un repertorio di cellule T e funzionale gran parte auto-tolerant 2.

Circa il 98% delle cellule nel timo umano stanno sviluppando cellule T denominate timociti. Il restante 2% è costituito da un certo numero di diversi tipi di cellule, tra cui una varietà di TEC (corticale, midollare, sottocapsulare), mieloidi e DC plasmacitoidi (MDC, PDC), macrofagi, cellule B, cellule T a ricircolo maturi, granulociti, fibroblasts, cellule endoteliali e cellule epiteliali molto rare attraverso una espressione fenotipo simile a quello di cellule di altri tessuti come i muscoli, neuroni e epitelio respiratorio (Figura 1). Di questi, TEC e DC sono i principali tipi APC trovato in un timo normale. Negli ultimi anni, la purificazione di questi tipi di APC per la cultura e profiling molecolare ha guadagnato sempre più interesse. A causa della loro bassa frequenza, l'isolamento di uno qualsiasi di questi tipi di cellule per l'analisi dettagliata richiede una procedura efficiente, riproducibile e conveniente. Il metodo qui presentato è una modifica da studi pubblicati in precedenza 3,4.

Come con qualsiasi altro tessuto, estrazione cella dal timo può essere ottenuto enzimaticamente disaggregando cellula-cellula e reti di interazione cellula-matrice, in modo da ottenere una sospensione di cellule singole. Ci sono alcuni parametri come la buona efficienza di dissociazione, il rendimento delle cellule, vitalità cellulare e la conservazione delle cellule smarcatori urface che sono cruciali e devono essere ottimizzati per l'isolamento di successo di queste popolazioni di cellule rare.

In questo protocollo, isolamento di DC e sottoinsiemi TEC viene eseguita facendo una cella singola sospensione del tessuto tramite rottura meccanica e digestione enzimatica. Usiamo Collagenase A da Clostridium histolyticum, che ha un rapporto equilibrato di diverse attività enzimatiche, per abbattere il collagene nativo che tiene il tessuto insieme. DNasi I è incluso nella soluzione enzimatica di ridurre l'aggregazione delle cellule a causa di DNA libero da cellule morte (timociti sono molto sensibili). Forniamo anche un approccio alternativo al tipico tessuto digestione enzimatica comporta il trattamento dei tessuti meccanica ed enzimatica assistito da un dissociatore tessuto. La sospensione singola cella viene quindi sottoposto ad una singola densità centrifugazione Percoll per l'arricchimento della frazione a bassa densità (LDF) di cellule. Da questa frazione di cellule, DC può essere isolato mediante colorazione fo marcatori DC-superficie (cioè CD11c +) e usando la separazione magnetica o cella fluorescenza-attivato (FACS). A differenza delle cellule linfoidi comprendenti la stragrande maggioranza delle cellule nel timo, TEC non esprimono CD45 ad alti livelli, ma sono positivi per l'adesione delle cellule epiteliali molecola EpCAM. CTEC può essere distinto dal TEC midollare mediante l'espressione di un antigene ancora indefinito riconosciuto dalla CDR-2 (corticale dendritico reticolociti-2) anticorpo 4,5 e espressione EpCAM leggermente inferiore. Il differenziale co-espressione di EpCAM e CDR2 permette l'isolamento efficiente di questi sottoinsiemi TEC via cellulare ad alta velocità smistamento 6.

Il protocollo qui presentato è ottimizzato per tessuto timico umano. La durata della procedura dipende dalla quantità di tessuto e la capacità dello sperimentatore così come la velocità del cell sorter, se viene utilizzato FACS ordinamento. Normalmente, il protocollo per l'isolamento di CC può essere completato entro 5-6 Hr e per l'isolamento di TCE in 8-10 ore. L'isolamento della DC e sottoinsiemi TEC dal tessuto timico è momento delicato. Il più veloce la procedura di isolamento, migliore la condizione delle cellule. Infine, le cellule isolate possono essere utilizzati per ulteriori indagini come studi comparativi di mRNA e l'espressione della proteina, esperimenti di PCR, isolamento delle proteine, profiling molecolare (cioè transcriptomics, analisi micro RNA) e coltura cellulare 6.

Dichiarazione Etica

Al fine di poter lavorare con il tessuto del timo umano il ricercatore deve ottenere l'approvazione del comitato etico locale o autorità responsabili, nonché un consenso informato scritto del donatore (o di solito i suoi genitori, poiché il tessuto è di solito ottenuto da minorenni bambini). Inoltre, tutti i tessuti umani devono essere trattati come dovrebbero essere adottate misure potenzialmente infettivi ed appropriate, come ad esempio lavorare con i guanti, ecc.

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Protocollo

1. Preparazione di strumenti, enzimatici Solutions, e tamponi

Effettuare le seguenti operazioni di preparazione prima di iniziare la procedura.

  1. Strumenti
    Pulito, asciutto e sterilizzare in autoclave i seguenti strumenti e li mantiene in confezione sterile fino al momento dell'uso.
    1. Piccole forbici affilate punte né curve o diritte per tagliare il tessuto del timo. Piccole pinze curve con punte zigrinate per la manipolazione del tessuto.
    2. 50 ml Oak Ridge centrifuga Tubi, PC, per la centrifugazione passo Percoll densità.
  2. Soluzioni enzimatiche
    Preparare la collagenasi / DNasi I Enzyme mescolare (2 mg collagenasi / ml e 0,1 mg DNasi I / ml) come segue:
    1. Sciogliere 500 mg di liofilizzato collagenasi A (Roche) in 250 ml di RPMI 1640 normale (senza FCS) per ottenere una soluzione di 2 mg / ml collagenasi. Collagenase è abbastanza difficile da sciogliere, per cui si consiglia di lasciare un po 'di tempo su un rullo-shaker a RT.
    2. Sciogliere 100 mg DNasi I (Roche) in10 ml di acqua distillata sterile. 2,5 ml aliquote possono essere conservati a -20 ° C. Aggiungere 2,5 ml della soluzione di DNasi I 10 mg nella soluzione di 2 mg collagenasi A.
    3. Filtro sterile il mix Collagenase / DNasi utilizzando un'unità filtrante Stericup (0,22 micron). Conservare in 10-20 ml aliquote a -20 ° C fino all'utilizzo.
  3. Tamponi e soluzioni
    1. 1.5 soluzione stock M NaCl: Sciogliere NaCl in acqua distillata sterile ad una concentrazione finale di 1,5 M. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
    2. Tampone 10x MACS: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-free) contenente il 5% di BSA e 20 mM EDTA. Filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron e conservare a 4 ° C. Prima di usare preparare una soluzione 1x diluendo lo stock 10x a 1x a freddo sterile 1x PBS.
    3. FACS tampone: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-free) contenente BSA 1% e il 0,02% NaN 3.
    4. FACS tampone per l'ordinamento delle cellule: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-free) contenente il 2% di BSA. Sterilizzare utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micron e conservare a 4 ° C.

2. Preparazione del tessuto

Il trattamento del tessuto deve essere eseguita utilizzando reagenti sterili e lavorare in una cappa a flusso laminare. Prima dell'inizio della procedura, preparare i seguenti reagenti e attrezzature:

    1. Riscaldare la seguente per RT: terreno RPMI 1640 completo (RPMI 1640, il 10% di siero di feto di vitello, 1% pen / strep), RPMI 1640 pianura, Ca 2 + / Mg 2 + privo di PBS e 2x soluzione enzimatica Collagenase / DNasi.
    2. Incubatore termico caldo con unità di rotazione a 37 ° C e fresco angolo fisso rotore della centrifuga a 4 ° C.
    3. Preparare una scatola con ghiaccio.

Nota: la durata di questa fase dipende dalle condizioni e dimensioni del tessuto. Circa 20-30 minuti è il tempo ragionevole necessario per un pezzo di medie dimensioni di tissue in buone condizioni (~ 5 cm di larghezza).

  1. Collocare il tessuto in una capsula di Petri contenente PBS sterile e risciacquare eventuali residui di sangue.
    1. Aggiungi PBS fresco per evitare che il tessuto di essiccazione e con pinze e forbici pulire il tessuto da coaguli di sangue, il tessuto connettivo e grasso e qualsiasi parte che non sembra in buona salute.
    2. Fare attenzione a rimuovere il tessuto necrotico che aumenterà la quantità di detriti.
    3. Dopo la pulizia, pesare tessuto per riferimento.
    4. Tagliare il tessuto in circa 1 cm 3 parti / blocchi. Aggiungere abbastanza PBS per coprire il tessuto.

Nota: Per la riproducibilità dei risultati, il tessuto deve essere tagliato in pezzi di dimensioni uniformi.

  1. Utilizzando il retro di una siringa sterile (10-20 ml) applicare pressione (non troppo intensa o prolungata) sui pezzi tessuto timico. Questa procedura rimuoverà la maggior parte dei timociti, riducendo così il volume del tessuto per essere digerito tardi. Eseguire questo passaggio su ghiaccio e lavorare velocemente.
  2. La soluzione diventerà visibilmente nuvoloso come timociti vengono rilasciati. Mescolare il piatto delicatamente e poi con l'aiuto di una pipetta da 5 ml o un aspiratore vetro rimuovere il supernatante contenente i timociti facendo attenzione a non aspirare accidentalmente i pezzi di tessuto.

Tip: Una sterile coltura cellulare raschietto può essere utilizzato per concentrare tutti i pezzi di tessuto su un lato del piatto muovere il piatto (45 ° angolo) e aspirare il surnatante. Sostituire con PBS fresco e ripetere la procedura fino a quando il surnatante è relativamente trasparente. Eseguire ultimo lavaggio con RPMI pianura.

  1. Tritare pezzi di tessuto con forbici affilate (il più finemente possibile, i frammenti dovrebbero essere di almeno 2-4 mm). I frammenti dovrebbero essere abbastanza piccolo da entrare in una pipetta da 5 ml.

3. Preparazione della sospensione singola cellula da Timo Tissue

Qui,sono descritti due approcci alternativi per questo passaggio. Il primo approccio descrive un tipico digestione enzimatica di tessuto (sezione 3.1), mentre la seconda prevede il trattamento del tessuto meccanica ed enzimatica assistito da un dissociatore tessuto (sezione 3.2).

Questo protocollo è ottimizzato per il trattamento di campioni di tessuto pesano 5 g. Per i campioni di tessuto grandi o più piccoli, regolare i volumi degli enzimi di conseguenza.

3.1 Tipica digestione enzimatica del tessuto per ottenere una sospensione di cellule singole

  1. Mettere purè di tessuto in provette da 50 ml con soluzione di 10 ml di collagenasi / DNasi per 5 g di tessuto. Aggiungi RPMI semplice per ottenere un volume totale di 20 ml.

Nota: in una provetta da 50 ml digerire fino a 10 g di tessuto. Regolare il volume enzima di conseguenza.

  1. Incubare la sospensione tessuto per 40 min a 37 ° C sotto lenta rotazione in un incubatore termica.

Nota: le fasi di incubazione possono essere eseguite in un incubatore termico con una unità di rotazione, o in un incubatore batterica 37 ° C con un agitatore.

  1. La soluzione enzimatica diventerà nuvoloso come cellule vengono rilasciati in esso. Al termine della digestione, tubo centrifugare a 110 xg per 2 minuti per sedimentare frammenti di tessuto.
  2. Raccogliere il surnatante da questo round digestione. Sedimentare la sospensione cellulare per 10 min a 400 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10-50 ml di RPMI completo a seconda delle dimensioni del pellet.
  3. Tenere sospensione di cellule in 37 ° C incubatore con il tappo allentato.
  4. Se si desiderano numero di cellule più grandi, la fase di digestione può essere ripetuta con i frammenti di tessuto rimanenti e la prima e la seconda digerire pool. Inoltre, se TEC deve essere isolato, due turni di digestione devono essere eseguiti.
  5. Diluire una aliquota della sospensione di cellule in blu trypan (1:10-1:100) e contare le cellule vitali mediante un emocitometro.
  6. Mantenere le cellule a 37 ° C in incubatore fino al momento di procedere alla centrifugazione densità Percoll (sezione 4). Isolamento successivo di sottoinsiemi DC (sezione 5) verrà effettuata da tali cellule.

Nota: tessuti timici possono variare nella loro composizione, in particolare con l'età, che influisce sull'efficienza digestione e la generazione di una cella singola sospensione.

  1. Per il successivo isolamento delle cellule epiteliali del timo (TCE) è necessario un terzo round di digestione enzimatica. Risospendere residui di tessuto in 10 ml di soluzione di Collagenase / DNasi fresco più 10 ml di RPMI pianura e aggiungere tripsina / EDTA (1:50 dal 2,5% stock) nella soluzione.
  2. Incubare a 37 ° C per 40 min con lieve rotazione. Durante gli ultimi 10 - 15 min di incubazione aggiungere FCS (1:5) per neutralizzare l'attività della tripsina.
  3. Centrifugare a 110 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per sedimentare i frammenti di tessuto.

Nota: Il tessuto non può essere completamente digerito dopo questi tre turni di digestioni. Età e condizioni generali del tessuto sono due parametri che influenzano l'efficienza di dissociazione del tessuto del timo.

  1. Raccogliere il surnatante cellulare ed eliminare i frammenti di tessuto sedimentate.
  2. Centrifugare il surnatante cellulare a 400 xg per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in RPMI completo.

Suggerimento: pellet cellulari sono abbastanza sciolto, quindi fare attenzione quando scartando / aspirazione surnatante.

  1. Contare le cellule vitali mediante un emocitometro. Mettere le cellule in un incubatore a 37 ° C fino procedere al Percoll separazione (sezione 4). Successivamente pre-arricchimento di cellule TEC da deplezione delle cellule CD45 hi verrà effettuata da tali cellule (sezione 6).

3.2 trattamento del tessuto meccanica ed enzimatica assistito da un dissociatore tessuto

Utilizzo del tessuto dissociatore avvicinano le fasi di digestione del tessuto può essere ridotto alla metà del tempo necessario con l'approccio descritto in precedenza (punto 3.1). Il protocollo che segue è una versione modificata di quella utilizzata per dissociare timo tessuto del mouse per l'isolamento di TEC 7,8.

  1. Trasferimento 5 g di pezzi di tessuto macinate (passo 2.5) in una provetta C contenente 10 ml di soluzione Collagenase / DNasi.
  2. Adattare il tubo C sul dissociatore tessuti e m_spleen_02 esecuzione del programma (10 sec). Ripetere questo programma 4-5x (40-50 sec).
  3. Incubare con lieve rotazione per 20 min a 37 ° C.
  4. Centrifugare a 110 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
  5. Raccogliere il surnatante e procedere come al punto 3.1.4. Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi / DNasi fresca.
  6. Adattare il tubo C sul dissociatore tessuti e m_spleen_01 esecuzione del programma (56 sec).
  7. Incubare a 37 ° C per 20 min con lieve rotazione.
  8. Centrifugare a 110 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
  9. Raccoltesupernatante delle cellule T e sedimentare la sospensione cellulare per 10 min a 400 x g. Procedere come al punto 3.1.4.
  10. Come descritto in 3.1.9 è necessario un terzo round di digestione per il successivo isolamento di cellule epiteliali del timo (TEC). Per questo, risospendere residui di tessuto in 10 ml di soluzione Collagenase / DNasi fresco, più tripsina / EDTA (1:50 diluizione del magazzino 2,5%)
  11. Incubare a 37 ° C per altri 20 minuti con lieve rotazione. Aggiungi FCS (1,5) e incubare per altri 10 min.

Nota: Usando questo approccio, dopo questo ultimo digestione passo il tessuto è di solito completamente dissociato e non frammenti di tessuto non digerite vengono osservati.

  1. Procedere come nei passaggi 3.1.11-3.1.14.

4. Arricchimento della LDF di Cellule con separazione Percoll densità

Dopo digestione enzimatica del tessuto, in totale timici sospensioni di cellule singole sono sottoposti ad una singola densità centrifugat Percollion passo per arricchire le cellule LDF. La LDF di cellule altamente arricchito per APC. Sia DC e TEC vengono rilevati in questa frazione di cellule.

  1. Utilizzare sospensione singola cella ottenuta dal 1 ° e 2 ° digerisce per isolamento mDC (cellule pool, vedere il punto 3.1.8) o 3 ° digest (per l'isolamento TEC) (3.1.14). Sospensione singola cella centrifuga ottenuta da ciascuna fase di digestione a 400 xg per 10 min.
  2. Preparare una soluzione di Percoll con una densità finale di 1,07 g / ml durante questa fase di lavaggio (vedi esempio nella tabella di seguito).
    Preparazione della soluzione Percoll ad una densità finale di 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
    Tubo No. 1 2 3 4
    Diluito Percoll (ρ = 1.130) (ml) 2.96 5.92 8.88 11.84
    1.5 M NaCl (ml) 0.6 1.20 1.8 2.4
    H 2 O distillata (ml) 2.44 4.88 7.32 9.76
    Volume di diluizione di lavoro finale 6 ml 12 ml 18 ml 24 ml
  3. Il numero di tubi Percoll dipende dai numeri cellulari determinate nelle fasi 3.1.8 e / o 3.1.14. Unire le soluzioni sterili e mescolare accuratamente. Per l'isolamento ottimale, 0,6-1 x 10 9 celle possono essere caricati per provetta di Percoll. Unire le soluzioni sterili e mescolare accuratamente.

Tip: Percoll è fotosensibile ed inoltre deve essere mantenuto freddo. Preparare prima la miscela contenente NaCl e H 2 O (RT) e aggiungere diluito Percoll ultimo, appena prima di risospendere le cellule in soluzione Percoll.

tenda "> Nota: densità di Percoll può variare tra i diversi fornitori e lotti Se la densità della soluzione diluita Percoll non è uguale a 1,130 g / ml, utilizzare le istruzioni fornite dal produttore per calcolare gli importi esatti di Percoll e H 2 O necessaria per ottenere una densità finale di 1,07 g / ml.

  1. Risospendere fino a 1 x 10 9 cellule in 6 ml di soluzione Percoll preparata (ρ = 1,07), mescolare quanto basta per ottenere una sospensione omogenea, e il trasferimento di un tappo a vite in policarbonato provetta da centrifuga da 50 ml Oak Ridge.
  2. Strato accuratamente 30 ml di RPMI completi al tubo con una pipetta in cima alla soluzione sospensione Percoll / cella. Caricare il supporto lentamente, in modo che rimanga in cima alla sospensione e fare attenzione a non disturbare lo strato.
  3. Pesare i tubi per assicurarsi che essi hanno pesi uguali in modo che siano bilanciata durante la centrifugazione. Se non lo sono, aggiungere più accuratamente mezzo al tubo più leggero (sotto stcondizioni erile).
  4. Trasferire accuratamente le provette per centrifuga pre-raffreddato con un rotore ad angolo fisso, e centrifugare a 3500 xg per 35 min, a 4 ° C con il freno off. Assicurarsi che la temperatura della centrifuga in non superiore a 4 ° C.
  5. Rimuovere provette dalla centrifuga e accuratamente raccogliere l'arricchito APC, trovato all'interfase tra Percoll e medio (frazione a bassa densità) da ciascuna provetta sterile utilizzando una pipetta Pasteur. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml contenente freddo RPMI completo. Riempire il tubo in modo da diluire la restante Percoll.
  6. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 300 xg a 4 ° C. Gettare il surnatante e lavare ripetere.
  7. Risospendere il pellet di cellule in terreno e determinare il numero di cellule (utilizzando trypan blu e un emocitometro). Nella nostra esperienza, la percentuale delle cellule LDF è circa 2-20% della sospensione di cellule singole totale ottenuto dopo digestione enzimatica. Un tipico yield di cellule arricchite a bassa densità (da un giovane del timo, range anni 1 giorno-2) è 1x10 8 cellule per 1 x 10 9, che rappresenta un 10% del totale delle singole cellule sospensione cellulare.

Nota: In questa fase, è possibile osservare che le cellule aggregate in sospensione (soprattutto con campioni provenienti da bambini di età più avanzata). Grumi di cellule sono un'indicazione di morte cellulare e di conseguenza dal rilascio di DNA dalle cellule morenti che possono attaccare le cellule insieme. In tal caso, aggiungere DNasi I nel campione (50 mcg / ml) e incubare per un massimo di 20 min a temperatura ambiente (capovolgere delicatamente ogni 5 min) per digerire le molecole di DNA libero.

5. Isolamento di timica mDC

Dopo arricchimento APC (tramite separazione Percoll), MDC può essere efficacemente isolato dal LDF seguito del primo e secondo ciclo di digestioni enzimatiche. Il protocollo che segue è una versione modificata di separazione cellulare magnetica per l'isolamento di mDC (CD11c +).

  1. Centrifugare APC arricchito cellule isolate dalla sospensione singola cella ottenuta dal pooled prima e seconda digestione enzimatica a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in tampone MACS 100 microlitri per 10 7 cellule.
  2. Aggiungere 5 ml di anticorpo CD11c-PE per 10 7 cellule.

Nota: esperimenti di titolazione sono raccomandati per ottenere risultati ottimali.

  1. Mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C, al riparo dalla luce.
  2. Lavare le cellule aggiungendo 1-2 ml di tampone MACS per 10 7 cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min.
  3. Aspirare il surnatante e risospendere completamente fino a 10 7 cellule in 80 ml ​​di tampone MACS.
  4. Aggiungere 20 microlitri anti-PE microsfere per 10 7 cellule.
  5. Mescolare bene (non Vortex) e incubare per 15 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce.
  6. Ripetere come al punto 5.4.
  7. Risospendere fino a 10 8 cellule in 500 microlitri di tampone.
  8. Se necessario, sospensione cellulare filtro con un filtro 40 micron cella per rimuovere i detriti cellulari e aggregati che possono ostruire il flusso della colonna.
  9. Utilizzare una colonna LS poiché sospensioni di cellule del timo fluire meglio attraverso le colonne LS. Preparare colonna LS seguendo le istruzioni del produttore. Sospensione cellulare Pipettare lentamente nella colonna evitando bolle generazione. Utilizzare una colonna per ogni 1 x 10 8 cellule.
  10. Lavare colonna seguendo le istruzioni del produttore. Rimuovere colonna da magnete e metterlo in una sterile 12 ml tondi tubo di polipropilene fondo. Aggiungere 3 ml MACS tampone nella colonna e raccogliere le cellule marcate magneticamente inserendo e saldamente spingendo lo stantuffo nella colonna.
  11. Raccogliere la frazione eluita rappresenta il CD11c + MDC e centrifugare a 400 xg per 6 min.
  12. Determinare il numero di cellulare e confermare la purezza del populati cella selezionatail da citometria a flusso. Indicatori suggeriti includono CD45, CD11c, e HLA-DR.

Nota: CD11c + mDC può anche essere isolato con un sorter FACS.

6. Arricchimento di CD45 Cells lo neg / per l'ordinamento delle cellule di TEC

Per l'isolamento di TEC, le cellule possono essere pre-arricchiti da deplezione delle cellule CD45 hi utilizzando microsfere CD45, al fine di accelerare il loro isolamento attraverso l'ordinamento delle cellule.

Utilizzare sospensione singola cella ottenuta dalla digestione 3 ° gradino (3.1.14) e successivamente separati da Percoll centrifugazione.

  1. Sospensione cellulare centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in 80 MACS microlitri di buffer per 10 7 cellule.
  2. Utilizzare microsfere CD45 a 1/3 della quantità raccomandata (6,7 ml) per 10 7 cellule.

Nota: Utilizzando un importo inferioredelle microsfere che pre-arricchiamo cellule sia per lo CD45 e CD45 delle cellule neg. La titolazione è raccomandato per ottenere risultati ottimali.

  1. Mescolare bene muovendo delicatamente il tubo (non Vortex) e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
  2. Lavare le microsfere non associate con l'aggiunta di 10 ml di tampone MACS e centrifugare per 10 minuti a 300 xg a 4 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
  3. Risospendere fino a 10 8 cellule in 500 microlitri di tampone.
  4. Se necessario, sospensione cellulare filtro con un filtro 70 micron cella per rimuovere i detriti cellulari e aggregati che possono ostruire il flusso della colonna.
  5. Utilizzare una colonna LS poiché sospensioni di cellule del timo fluire meglio attraverso le colonne LS. Preparare colonna LS seguendo le istruzioni del produttore. Sospensione cellulare Pipettare lentamente nella colonna evitando bolle generazione. Utilizzare una colonna per ogni 10 8 celle.
  6. Raccogliere le cellule senza etichetta (flow-through e lavaggi) contenentila frazione di cellule lo / neg CD45 e lavare colonna seguendo le istruzioni del produttore.
  7. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere il pellet di cellule in tampone FACS sterile per determinare il numero di cellule e procedere alle macchie per selezione cellulare.

7. Celle macchia per l'ordinamento delle cellule Fluorescence Activated

  1. Esegui FcR bloccando prima della colorazione delle cellule, al fine di ridurre legame di anticorpi non specifico. Incubare sospensione cellulare con pool soluzione di immunoglobuline umane per 15 minuti a RT. Questi reagenti sono disponibili in commercio (ad esempio Gammunex soluzione al 10%).
  2. Lavare le cellule aggiungendo freddo buffer di FACS sterile. Centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C.
  3. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in freddo buffer di FACS sterile. Preparare 5 campioni secondo il seguente esempio:
    Campione Tipo di campione Anticorpo Numero di cellulare Volume totale
    1. senza macchia controllo 1 x 10 6 50 microlitri
    2.scc *-Pacific Blue controllo CD45-Pacific Blue 1 x 10 6 50 microlitri
    3. SCC-APC controllo CD3-APC 1 x 10 6 50 microlitri
    4.scc-Alexa 488 controllo CD8-Alexa 488 1 x 10 6 50 microlitri
    5. Ordinamento delle cellule analita CD45-Pacific Blue
    EpCAM-APC
    CDR2-Alexa 488     		10 x 10 6 - 50 x 10 6 500 microlitri
    10 x 10 6 microlitri cells/100

    * Scc; controllo del singolo colore

  4. Incubare le cellule con anticorpi per 30 min, su ghiaccio al buio.
  5. Lavare due volte con tampone FACS delle cellule mediante centrifugazione a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C.
  6. Regolare la concentrazione cellulare del campione da ordinare a 1 x10 7 cellule / ml (o alla concentrazione consigliata dal stabilimento di selezione cella) mediante FACS sterili buffer per cell sorting (cioè senza NaN 3).
  7. Passare campione cellulare attraverso un colino 70 micron cella per eliminare eventuali grumi di cellule che potrebbero ostruire il citometro di cernita.
  8. Risospendere campioni di controllo in 200-400 ml di tampone. Tenere le provette su ghiaccio e al riparo dalla luce.
  9. Preparare le provette di raccolta con il mezzo.

Note:

  • Eseguire titolazione degli anticorpi per la colorazione ottimale.
  • In un campione selezionare, fino a 50 x 10 6 cellule possono essere colorati in un volume totale di reazione di500 microlitri.
  • Eseguire la colorazione del campione da ordinare in 5 ml Falcon polistirolo tubi circolari. I singoli controlli colore possono essere colorati in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti.
  • Poiché sottoinsiemi TEC sono popolazioni rare, è consigliabile utilizzare un altro indicatore positivo (ad alta frequenza) per ogni fluorocromo per facilitare la determinazione delle impostazioni FACS corretta e per assicurarsi di avere un adeguato risarcimento se la scelta di fluorocromi richiede un risarcimento. Cellule dalla frazione CD45 + possono essere colorati con marcatori quali CD45, CD3 o CD8 per i diversi fluorocromi e dopo colorazione CD45 + cellule non colorate possono essere aggiunte al campione.

8. Isolamento dei TEC da Fluorescence ordinamento cellulare Attivato

Sottoinsiemi TEC possono essere ordinati dalla frazione lo / neg CD45 come EpCAM hi CDR2 - (MTEC) o carcinomi lo CDR2 + (CTEC).

  1. Eseguire l'arguzia del campioneh le cellule non colorate e regolare l'avanti e scatter laterale in modo da mettere la popolazione di interesse in scala. Regolare la tensione su ogni rivelatore in modo che le cellule sono visibili ma situato nella porzione mano sinistra dell'istogramma.
  2. Eseguire ogni campione macchiato singolo e regolare la compensazione per ogni colore.
  3. Dopo aver regolato la tensione e il risarcimento per i controlli colorate senza macchia e singole eseguire l'esempio da ordinare e strumenti di uso gating per definire la popolazione di interesse. Utilizzare una vasta avanti e cancello scatter laterale per garantire l'inclusione di tutte le dimensioni di cellule stromali, escludendo detriti cellulari.
  4. Sul terreno dot con CD45-Pacific Blue contro cancello Forward Scatter sulle cellule CD45 e CD45 basse neg.
  5. Applicare questo porta ad un EpCAM contro CDR2 dot plot e determinare di gating popolazioni da ordinare.
  6. Una volta che cancelli sono stati determinati, selezionare le porte che contengono le popolazioni di interesse e iniziare ordinamento.
  7. Una volta che le cellule filtrate sono state raccolte, centrifugare la sospensione cellulare e risospendere le cellule in terreno o tampone scelta a seconda dell'applicazione valle previsto.

Nota: durante l'ordinamento per impedire alle cellule di attaccarsi alle pareti del tubo di raccolta, il tubo può essere pre-rivestito riempiendola con 50% FCS in PBS e incubate a temperatura ambiente per 30 min. Scartare la soluzione di rivestimento prima di aggiungere il supporto di raccolta.

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Risultati

Come materiale di partenza in questo protocollo usiamo tessuto del timo rimosso dalla portata dei bambini sottoposti a chirurgia cardiovascolare correttiva (Dipartimento di Chirurgia Toracica e Cardiovascolare, Clinica universitaria di Tubinga) ottenuti dopo consenso informato e secondo le linee guida istituzionali. Questo materiale di scarto può variare notevolmente di dimensioni 2-30 grammi. Il numero di MDC e sottoinsiemi TEC (CTEC e Mtec) che si ottengono dipende dalla dimensione e l'età del campione di tessuto ...

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Discussione

Il protocollo qui descritto è una modifica del protocollo pubblicato da Gotter et al 4. Fasi critiche nel protocollo sono la condizione e la preparazione iniziale del tessuto e la separazione densità Percoll. Si consiglia vivamente di trattare il tessuto il più presto possibile dopo la raccolta. È importante lavorare velocemente ma accuratamente durante la pulizia e il taglio del tessuto. Durante il lavaggio timociti descritto al punto 2.3, è fondamentale trovare il giusto equilibrio quando si applic...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Siamo grati ai chirurghi del Dipartimento di Chirurgia Toracica e Cardiovascolare, Clinica universitaria di Tubinga per averci fornito i campioni di timo e Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Germania) per fornire l'anticorpo CDR2. Vorremmo anche ringraziare Hans-Jörg Bühring e Sabrina Grimm dalla struttura di smistamento (Università di Tubinga). Questo lavoro è stato supportato dal SFB 685 e la Fondazione Hertie.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti e Materiali
RPMI 1640PAAE15-842 
PBS PAAH15-002Dulbecco 
Siero fetale bovino-OroPAAA15-151 
Albumina sierica bovinaPAAK41-001 
Collagenasi A Roche10 103 586 001 
DNasi I, grado II pancreas bovino Roche10 104 159 001 
Tripsina-EDTA 10x in PBSPAAL11-001stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Kit di etichettatura delle proteineSonde molecolariA-10235 
anti-umano CDR2 (purificato)Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germaniaetichettato con Alexa Fluor 488
anti-umano CD45 (blu del Pacifico)Biolegend304022 
anti-umano EpCAM (APC)Miltenyi Biotec130-091-254 
anti-umano CD11c (PE)Miltenyi Biotec130-092-411 
microsfere anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801 
microsfere anti-CD45, umanoMiltenyi Biotec130-045-801 
Colonne LSMiltenyi Biotec130-042-401 
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237per dissociatore tissutale
Percoll (densità 1.130 g/ml)GE Healthcare, Life Sciences17-0891-01 
Acqua distillata sterile (senza DNAsi/RNAsi)GIBCO10977-035 
Gamunex 10%Tajecris-BiotherapeuticsG1200521:10 pre-diluizione, utilizzare 20 μ l/1 x 106celle
0,22 μ m filterMillex GSSLGS033SSazionata da siringa
MilliporeSCGPU05REPompata
50 ml PC oak ridge provette da centrifugaNalgene3118-005050 ml
50 ml PP provette conicheBecton Dickinson352070 
Provette da 12 mm x 75 mm da 5 mlBecton Dickinson352058Colorazione FACS
Filtro cellulare 70 μ mBecton Dickinson352350 
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)Becton Dickinson 
Sorvall Evolution R6 (rotore)Kendro 
Rotatore REAX 2Heidolph 
dissociatore delicatoMACSMiltenyi Biotec130-093 235dissociatore tissutale
di Unità filtrante Stericup

Riferimenti

  1. Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
  2. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
  9. Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
  10. Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
  11. Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
  12. Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
  13. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
  14. Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).

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