Dettagli Questo protocollo un metodo per isolare le cellule presentanti l'antigene da timo umano attraverso diverse fasi di digestione enzimatica del tessuto seguita dalla densità centrifugazione della sospensione di cellule singole e smistamento finalmente magnetico e / o FACS delle popolazioni cellulari di interesse.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo protocollo forniamo un metodo per isolare le cellule dendritiche (DC) e cellule epiteliali (TEC) dal timo umano. DC e TEC sono i principali cellule presentanti l'antigene (APC) tipi trovato in un timo normale ed è ben stabilito che essi svolgono ruoli distinti durante la selezione del timo. Queste cellule sono localizzate in microambienti distinti nel timo e ogni tipo APC rappresenta soltanto una frazione minore di cellule. Per capire meglio la biologia di questi tipi cellulari, caratterizzazione di queste popolazioni cellulari è altamente auspicabile, ma a causa della loro bassa frequenza, l'isolamento di uno qualsiasi di questi tipi cellulari richiede una procedura efficiente e riproducibile. Dettagli Questo protocollo un metodo per ottenere cellule adatte per la caratterizzazione di diverse proprietà cellulari. Tessuto timico è interrotta meccanicamente e dopo diverse fasi di digestione enzimatica, la sospensione cellulare risultante è arricchito con un passo centrifugazione densità Percoll. Per l'isolamento di DC mieloidi (CD11c <sup> +), le cellule della frazione a bassa densità (LDF) sono immunoselected da cell sorting magnetico. Arricchimento delle popolazioni TEC (MTEC, CTEC) si ottiene l'esaurimento delle emopoietiche (CD45 hi), le cellule dalla frazione di cellule Percoll a bassa densità che consente loro successivo isolamento tramite fluorescenza delle cellule attivate (FACS) utilizzando marcatori cellulari specifici. Le cellule isolate possono essere utilizzati per diverse applicazioni a valle.
Introduzione
Il timo è l'organo in cui avviene lo sviluppo delle cellule T. La sua dimensione relativa e assoluta diminuisce con l'età, quando viene successivamente sostituito da grasso, anche se l'attività del timo può ancora essere rilevata in età avanzata. La sua importanza per la risposta immunitaria è stata dimostrata nei primi anni del 1960 1.
Il repertorio di cellule T è sagomata attraverso l'interazione di recettori delle cellule T con complessi peptide-MHC su diversi tipi di timica APC, che forniscono sopravvivenza o morte spunti per sviluppare cellule T, risultando in un repertorio di cellule T e funzionale gran pa....
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Protocollo
1. Preparazione di strumenti, enzimatici Solutions, e tamponi
Effettuare le seguenti operazioni di preparazione prima di iniziare la procedura.
- Strumenti
Pulito, asciutto e sterilizzare in autoclave i seguenti strumenti e li mantiene in confezione sterile fino al momento dell'uso.- Piccole forbici affilate punte né curve o diritte per tagliare il tessuto del timo. Piccole pinze curve con punte zigrinate per la manipolazione del tessuto.
- 50 ml Oak Ridge centrifuga Tubi, PC, per la centrifugazione passo Percoll densità.
- Soluzioni enzimatiche
Preparare la collagenasi / DNasi ....
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Risultati
Come materiale di partenza in questo protocollo usiamo tessuto del timo rimosso dalla portata dei bambini sottoposti a chirurgia cardiovascolare correttiva (Dipartimento di Chirurgia Toracica e Cardiovascolare, Clinica universitaria di Tubinga) ottenuti dopo consenso informato e secondo le linee guida istituzionali. Questo materiale di scarto può variare notevolmente di dimensioni 2-30 grammi. Il numero di MDC e sottoinsiemi TEC (CTEC e Mtec) che si ottengono dipende dalla dimensione e l'età del campione di tessuto .......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è una modifica del protocollo pubblicato da Gotter et al 4. Fasi critiche nel protocollo sono la condizione e la preparazione iniziale del tessuto e la separazione densità Percoll. Si consiglia vivamente di trattare il tessuto il più presto possibile dopo la raccolta. È importante lavorare velocemente ma accuratamente durante la pulizia e il taglio del tessuto. Durante il lavaggio timociti descritto al punto 2.3, è fondamentale trovare il giusto equilibrio quando si applic.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo grati ai chirurghi del Dipartimento di Chirurgia Toracica e Cardiovascolare, Clinica universitaria di Tubinga per averci fornito i campioni di timo e Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Germania) per fornire l'anticorpo CDR2. Vorremmo anche ringraziare Hans-Jörg Bühring e Sabrina Grimm dalla struttura di smistamento (Università di Tubinga). Questo lavoro è stato supportato dal SFB 685 e la Fondazione Hertie.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti e Materiali | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| PBS PAA | H15-002 | Dulbecco | |
| Siero fetale bovino-Oro | PAA | A15-151 | |
| Albumina sierica bovina | PAA | K41-001 | |
| Collagenasi A Roche | 10 103 586 001 | ||
| DNasi I, grado II pancreas bovino Roche | 10 104 159 001 | ||
| Tripsina-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Kit di etichettatura delle proteine | Sonde molecolari | A-10235 | |
| anti-umano CDR2 (purificato) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germania | etichettato con Alexa Fluor 488 | |
| anti-umano CD45 (blu del Pacifico) | Biolegend | 304022 | |
| anti-umano EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-umano CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| microsfere anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| microsfere anti-CD45, umano | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| Colonne LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | per dissociatore tissutale |
| Percoll (densità 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Acqua distillata sterile (senza DNAsi/RNAsi) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-diluizione, utilizzare 20 μ l/1 x 106celle |
| 0,22 μ m filter | Millex GS | SLGS033SS | azionata da siringa |
| Millipore | SCGPU05RE | Pompata | |
| 50 ml PC oak ridge provette da centrifuga | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP provette coniche | Becton Dickinson | 352070 | |
| Provette da 12 mm x 75 mm da 5 ml | Becton Dickinson | 352058 | Colorazione FACS |
| Filtro cellulare 70 μ m | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotore) | Kendro | ||
| Rotatore REAX 2 | Heidolph | ||
| dissociatore delicatoMACS | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | dissociatore tissutale |
Riferimenti
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and c....
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Ristampe e permessi
