High-throughput fluorometrica misura del potenziale di suolo extracellulari enzimi Attività

Sommario

Per misurare i potenziali tassi di suolo attività enzimatiche extracellulari, supporti sintetici che sono destinate a un colorante fluorescente sono aggiunte a campioni di terreno. L'attività enzimatica è misurata come il colorante fluorescente viene rilasciato dal substrato mediante una reazione enzimatica catalizzata, se superiore fluorescenza indica più la degradazione del substrato.

Abstract

Microbi nel suolo e altri ambienti producono enzimi extracellulari di depolimerizzano e idrolizzare macromolecole organiche in modo che possano essere assimilate di energia e sostanze nutritive. Misurazione del suolo microbica attività dell'enzima è fondamentale per capire l'ecosistema del suolo dinamiche funzionali. Il concetto generale del saggio di fluorescenza enzima che è sintetico C-, N-, o substrati ricchi di P legato con un colorante fluorescente vengono aggiunte a campioni di terreno. Quando intatto, i substrati marcati non reagiscono. L'attività enzimatica è misurata come aumento della fluorescenza come i coloranti fluorescenti vengono scissi dalla loro substrati, che consente loro di fluorescenza. Misurazioni enzimatici possono essere espressi in unità di molarità o attività. Per eseguire questo test, fanghi di terreno vengono preparate combinando terreno con un tampone pH. Il tampone pH (tipicamente un acetato di sodio 50 mM o 50 mM di tampone Tris), viene scelto per particolare costante del tampone acido dissociazione (pKa) per abbinare meglio il sa suolomple pH. I fanghi di terreno vengono inoculati con una quantità non limitante di fluorescente (cioè C-, N-, o ricco-P) substrato. Utilizzo di fanghi sul suolo nel saggio serve a minimizzare limitazioni enzima e substrato diffusione. Pertanto, questo controlli del saggio per le differenze di limitazione del substrato, i tassi di diffusione, e le condizioni di pH del suolo; rilevamento così potenziali tassi di attività enzimatica in funzione della differenza di concentrazioni enzimatiche (per esempio).

Saggi di fluorescenza enzimatici sono in genere più sensibili di spettrofotometriche (cioè colorimetrici) saggi, ma possono soffrire di disturbi causati da impurità e l'instabilità di molti composti fluorescenti se esposti alla luce, in modo cautela è necessaria nel maneggiare substrati fluorescenti. Allo stesso modo, questo metodo valuta solo potenziali attività enzimatiche in condizioni di laboratorio, quando i substrati non sono limitanti. Deve essere usata cautela quando si interpretano i dati che rappresentano croceconfronto-sito con temperature diverse o tipi di suolo, come nel tipo di suolo in situ e la temperatura possono influenzare la cinetica enzimatica.

Introduzione

Enzimi extracellulari (SEO) prodotte dai batteri del suolo, funghi, e di archeobatteri sono coinvolti in processi biogeochimici innumerevoli, e sono al centro della trasformazione, stabilizzazione e destabilizzazione di materia organica del suolo e il ciclo dei nutrienti negli ecosistemi terrestri ^1. Producendo Straordinari, microbi del suolo decompongono e trasformano la materia organica polimerica in molecole solubili più piccole, liberando in tal modo precedentemente legati micro e macronutrienti, che permette alle piante e microbi per assimilare nutrienti disponibili dal suolo. VE sono stati studiati per decenni, principalmente misurando le loro attività in saggi di laboratorio ^2-4, dato che è molto difficile da rilevare e quantificare direttamente enzimi.

Attività enzimatica extracellulare (EEA) è più fortemente controllata dalla concentrazione di enzimi e substrati corrispondenti. L'abbondanza di diversi C-, N-, e gli enzimi P di degradazione nei suoli sono controllati da numerosi fattori including biomassa microbica, composizione della comunità, la disponibilità di substrato, microclima, e le richieste stechiometrico ^5,6. Tuttavia, in EEA situ all'interno dell'ambiente suolo sono anche influenzata dalla temperatura ^7,8, l'associazione di enzimi per argille suolo e dalle proprietà umici ^2, e vincoli di diffusione ^9, che in ultima analisi regolano la piscina enzima attivo, in termini di dimensioni, disponibilità substrato e tassi di turnover ^10-12. Pertanto, riconoscendo in condizioni di terreno in situ è fondamentale quando si utilizzano dosaggi enzimatici laboratorio di interpretare la funzione microbica del terreno in diversi siti ambientali.

Molte classi diverse di SEE possono essere quantificabili in test di laboratorio utilizzando una varietà di substrati sintetici (fare riferimento a "Elenco dei reagenti Table" per maggiori dettagli). Alcuni protocolli utilizzano substrati in saggi che sono accoppiati ad una reazione colorimetrica che può essere rilevato con uno spettrofotometro, wentre gli altri, compreso il protocollo che descriviamo qui, utilizzare substrati che sono destinate a una frazione fluorescente. Saggi fluorescenza EE sono tipicamente più sensibili (da un ordine di grandezza) di test colorimetrici (che usa una frazione cromogenico collegato con un substrato sintetico) ^12-14. Sensibilità nella rilevazione SEE comprende due aspetti: uno è legato alla quantità del composto di interesse identificati e l'altra correlate al minimo rilevabile potenziale attività enzimatica. Metodi per colorimetrico P-nitrofenolo saggi basati (PNP) possono essere trovati in passato fabbrica ^15,16. In breve, il suolo (tipicamente setacciata a <2 mm ed essiccati) viene incubata a ottimale o campo rilevanti temperatura e pH. La velocità con cui il prodotto di reazione rilasciato è determinato colorimetricamente con uno spettrofotometro ^14. La maggiore sensibilità dei saggi enzimatici fluorescenza è dovuto in parte al rilevamento più sensibile della separazione porzione fluorogenico associato substrate degradazione piuttosto che assorbanza registrazione dopo la separazione di una specifica porzione cromogenico ad una lunghezza d'onda specifica. I due indicatori fluorescenti sintetici più comunemente utilizzati sono 4-metilumbelliferone (MUB) ¹⁷ e 7-ammino-4-metil (MUC) ^18,19. Substrati MUC-legati sono comunemente associati con N-ricchi substrati sintetici quali proteine ​​e / o amminoacidi. Tecniche di fluorescenza sono stati sviluppati per i campioni acquatici ^20,21, e la loro applicazione ai terreni richiede controlli per la tempra segnale e le interferenze ^22,23. I saggi possono essere condotti con i tradizionali "da banco" la chimica con grandi volumi, o possono essere impiegati nei protocolli basato sulle micropiastre, con maggiore velocità, ma forse errore di misura superiore. Mentre ci sono diversi protocolli ampiamente citati per il rilevamento fluorescente EEA nei suoli ^24, molti laboratori utilizzano sottili variazioni su questi protocolli, spesso involontariamente o per differenzas in attrezzature di laboratorio e reagenti. Apparentemente piccole differenze nei dettagli di protocolli possono fortemente incidere misurato EEA ^25,26 e la mancanza di enzimi standardizzati rende difficile calibrare saggi tra laboratori diversi. Quindi, vi è un bisogno importante per la diffusione di protocolli dettagliati per favorire la standardizzazione dei test SEE.

Nel nostro protocollo, campioni di terreno vengono preparate combinando campioni di suolo con un tampone pH e omogeneizzando con un frullatore. I fanghi vengono poi inoculate con una quantità non limitante di fluorescente C-, N-, o substrato ricco-P, scelto in funzione della domanda di ricerca specifica di interesse. Utilizzo di fanghi suolo nei saggi enzimatici serve da controllo per minimizzare limitazioni substrato di diffusione. Le frazioni fluorescenti sono state spente finchè sono spaccati dai rispettivi substrati, e quindi l'attività enzimatica può essere rilevato come il colorante fluorescente viene rilasciato dal substrato by una reazione enzimatica catalizzata. L'intensità di fluorescenza crescente nel tempo riflette la velocità della reazione enzimatica catalizzata.

Il concetto generale del saggio di fluorescenza enzima è che substrati sintetici legati con una porzione fluorogenica (colorante fluorescente), vengono aggiunte a campioni di terreno ^27. Durante enzima-substrato catalizzata degradazione, rompe il legame tra il colorante fluorescente ed il substrato. Il colorante fluorescente liberato dal substrato viene quindi utilizzato come valutazione indiretta dell'attività enzimatica, e può essere quantificato utilizzando un lettore di micropiastre a rilevare l'intensità di fluorescenza del colorante. In breve, la fluorescenza quantificazione si attua come colorante liberato emette luce di una lunghezza d'onda dopo l'assorbimento luce di una lunghezza d'onda diversa. L'intensità di fluorescenza è registrata da un lettore di piastre in grado sia di eccitazione e rilevamento. L'attività enzimatica può essere poi quantificato sulla base della nota conce fluorescente-dyentrations del substrato (ovvero quantità note di substrato sintetico aggiunte a campioni di terreno) con riferimento a una curva di diluizione standard di intensità di fluorescenza per la frazione fluorogenico specifico del substrato usato nel saggio (cioè 4-metilumbelliferone (MUB) o 7-ammino -4-metilcumarina (MUC)). (Si prega di fare riferimento alla sezione protocollo per dettagli specifici sulle attività enzimatica quantificazione).

Suolo Laboratorio saggi enzimatici sono utili per valutare la funzione della comunità microbica, ma ci sono diverse limitazioni tecniche che gli utenti dovrebbero riconoscere ^10. Saggi di fluorescenza possono soffrire di disturbi causati da impurità e / o instabilità di molti composti fluorescenti se esposti alla luce, quindi è necessaria cautela nel maneggiare substrati fluorescenti ^25. Particelle del terreno e / o materiale organico nei fanghi del suolo possono anche interferire con intensità di fluorescenza, noto come l'effetto quenching ^26.Inoltre, saggi enzimatici laboratorio ne valuta solo potenziali EEA in condizioni di laboratorio. Saggi in vitro misurano EEA in condizioni in cui la diffusione del substrato e abbondanza è limitativo. Pertanto, i dati forniti da questi test non può essere una buona proxy EEA sotto condizioni del terreno in situ ^10. Nel complesso, l'attività enzimatica è molto utile per i confronti relativi a quali tipi di suolo sono simili. Tuttavia, quando si utilizza questo metodo per confrontare le attività tra i terreni che si differenziano per caratteristiche fisiche o chimiche, deve essere usata cautela. Ciò è dovuto al fatto che le differenze di tipo di suolo e la temperatura possono drasticamente alterare lo stato di cinetica enzimatica in situ. Un'altra limitazione è che relativamente pochi substrati sono disponibili in commercio (rispetto all'ambiente naturale). Inoltre, i substrati sintetici utilizzati per saggi enzimatici sono relativamente semplici (facilmente solubile) può non rappresentare esattamente i substrati presenti o disponi suoloe in situ. Un altro fattore da considerare è che l'utilizzo di fanghi di terreno di integrare l'attività di alcuni enzimi stabilizzati (cioè immobilizzati da materia organica o argille) che non possono essere attivi in condizioni in situ ^2. Saggi di laboratorio enzimatici inoltre non forniscono informazioni per quanto riguarda la persistenza degli enzimi nel suolo (tassi di turnover enzima) o informazioni riguardanti le specie microbiche specifiche che producono gli enzimi del suolo.

Protocollo

1. Assay Set-up

1. Label 3 piatti e profondi: "esempio", "standard MUB", e "standard MUC".
2. Versare ogni standard (MUB di 0, 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100 micron) e supporto (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) in serbatoi, prelabeled pulite separati (orientato in righe) .
3. Pipettare l'appropriato livello MUB nei pozzetti corrispondenti della piastra standard MUB (Tabella 1).
   1. Dispensare 200 ml di 0 micron MUB nella riga A della piastra standard MUB.
   2. Dispensare 200 ml di 2,5 micron MUB nella riga B della piastra standard MUB.
   3. Dispensare 200 ml di 5 micron MUB in fila C di piastra standard MUB.
   4. Pipettare 200 ml di 10 micron MUB in fila D della piastra standard MUB.
   5. Pipettare 200 ml di 25 micron MUB in fila E di piastra standard MUB.
   6. Pipettare 200 ml di 50 micron MUB in fila F della piastra standard MUB.
   7. Pipettare 200 ml di 100 μM MUB in fila G della piastra standard MUB.
   8. Ripetere i punti 1.3.1 - 1.3.8 delle norme MUC nei corrispondenti pozzetti della piastra standard MUC.
4. Fanghi suolo Prep per ogni campione di suolo.
   1. Pesare 2,75 g di campo terreno umido nel frullatore.
   2. Aggiungere 91 ml di tampone 50 mM. Frullare in alto per 1 min.
   3. Versare il contenuto frullatore in una ciotola di vetro pulito, almeno così ampia come pipette a 8 canali con ancoretta.
   4. Mettere sul piatto mescolare, mescolare liquami suolo su bassa.
   5. Pipettare 800 ml di liquame nel terreno prima colonna del piatto del campione (Tabella 2).
   6. Ripetere in 1 ^° colonna della norma MUB e piastre standard MUC (Tabella 1).
   7. Sciacquare frullatore, piastra di agitazione e mescolare con bar DI H ₂ O o buffer tra campioni di terreno.
   8. Ripetere i punti 1.4.1 - 1.4.7) per ogni campione, passare alla colonna successiva ad ogni campione di suolo successiva (Tabelle 1 e2).
5. Pipettare il substrato (in questo esempio, 200 pM concentrazioni) in corrispondenti pozzetti della piastra campione (Tabella 2).
   1. Pipettare 200 ml di substrato BG nella riga A della piastra campione.
   2. Pipettare 200 ml di CB substrato nella riga B della piastra del campione.
   3. Pipettare 200 ml di substrato NAG in fila C della piastra del campione.
   4. Pipettare 200 ml di substrato PHOS in fila D della piastra del campione.
   5. Pipettare 200 ml di substrato XYL in fila e della piastra del campione.
   6. Pipettare 200 ml di AG substrato in fila F della piastra del campione.
   7. Pipettare 200 ml di substrato LAP in fila G della piastra del campione.
   8. Ripetere i punti 1.5.1 - 1.5.7 per ogni piastra del campione temperatura di incubazione.

2. L'incubazione delle piastre di saggio

1. Sigillare le piastre deep-e ("esempio", "standard MUB", e "standard MUC4 ;) con placca stuoie.
2. Capovolgere ciascuno (sigillato) piastra a mano fino a che la soluzione sia ben mescolata (~ 10x).
3. Posizionare le piastre in incubatore adeguato per richieste periodo di incubazione (Tabella 3).
4. Registrare il tempo iniziale 0 Tempo. Registrare anche i tempi di incubazione adeguati in modo da sapere quando rimuovere la piastra dall'incubatore (tabella 3).
5. Alla fine di ogni periodo di incubazione, centrifugare le piastre sigillate per 3 min a ~ 2.900 x g.
6. Dopo certificazione, trasferire 250 microlitri da ciascun pozzetto delle piastre e profonde incubate in corrispondenti pozzi neri in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto (una piastra nera verrà utilizzato per ogni piastra pozzo profondo incubate). E 'importante per trasferire campioni dai pozzetti profondi incubati nelle stesse pozzetti (cioè A1 ... A12, ecc) in piastre a fondo piatto da 96 pozzetti neri (Tabella 1, 2).

3. Misure fluorescenti suun Fluorometro micropiastre

1. Seguendo le istruzioni del produttore per il lettore di piastre fluorimetrico utilizzato, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 365 nm e lunghezza d'onda di emissione a 450 nm (o utilizzare appositi filtri).
2. Leggere le tre piastre sul fluorimetro. Importante: campioni e piastre standard (cioè MUB o MUC) devono essere lette con lo stesso guadagno.
   1. Impostare lo spettrofotometro di guadagno automatico e leggere le piastre MUC e MUB standard.
   2. Set guadagno manuale, e diminuire il valore ottimale per il prossimo numero più basso, arrotondati alle cinque, per ciascuna piastra standard. Ripetere 2 volte per ogni piatto.
   3. Impostare il guadagno automatico ed eseguire la piastra di esempio. Eseguire nuovamente la piastra di esempio manualmente in modo che corrisponda il più alto guadagno per ciascuna delle piastre standard (cioè MUB e MUC).

4. Analisi dei dati

1. Inserire i dati della curva di fluorescenza standard nei foglio di calcolo per MUB (Tabella 4a) E dello standard MUC (Tabella 4b)
   1. Convertire (micron) concentrazioni (mmol) (tabelle 4a e 4b).
2. Per i dati della curva di fluorescenza standard di ciascun campione, calcolare la pendenza, intercetta y, e R ² valori per MUB e MUC (mmol) concentrazioni standard. Accettabile R ² valori devono superare i 0,98 per ogni campione (tabelle 4a e 4b). Può essere utile per visualizzare le curve standard in un grafico a dispersione, con fluorescenza si legge tracciata come variabile dipendente (asse y) e la concentrazione standard (mol), tracciata come variabile indipendente (asse x) (Figura 1).
3. Si utilizzerà la pendenza della curva standard di MUB e MUC ei valori y-intercetta per calcolare il substrato dati grezzi di fluorescenza del campione + in potenziali EEA. È necessario prima inserire i + substrato dati grezzi di fluorescenza del campione in un nuovo foglio di calcolo (Tabella 5a ). Sarà inoltre necessario inserire il tempo di incubazione (hr) e nel suolo peso secco per ogni campione (Tabella 5b). Nota, i termini valori immessi in questo esempio sono 3 ore, perché i campioni sono stati incubati a 25 ° C (Tabella 3).
   1. Sottrarre i valori dell'intercetta della curva standard dai corrispondenti valori di fluorescenza del campione e poi dividere per la pendenza della curva standard corrispondente (Tabella 5c). Per fare questo, riorganizzare equazione linea standard per risolvere per esempio la concentrazione dell'enzima (x), x = (yb) / m dove: [y = campione fluorescenza lettura crudo; b = intercetta da MUB o curva MUC standard; m = pendenza da MUB o MUC curva standard].
   2. Moltiplicare campione micromol, a partire dal punto 4.3.1, da 91 ml (volume di buffer utilizzato in slurry suolo) (Tabella 5d).
   3. Divide il valore ottenuto nel passo 4.3.2 il tempo di incubazione specifico del campione e massa secca del suolo (Tabella 5e): [amt enzima. (& #956, mol) x 91 ml x incubazione (h) x suolo secco (g) x 0,8 ml x 1.000]
      Nota: 0,8 ml è il volume di liquami utilizzato in ciascun pozzetto, e 1.000 corregge la quantità effettiva suolo in ciascun pozzetto.
   4. Moltiplicare il valore ottenuto nel passo 4.3.3 per 1000 per ottenere le unità desiderate (attività nmol / g terreno asciutto / hr) (Tabella 5f).

Risultati

Saggi enzimatici possono essere utilizzati per quantificare potenziali EEA e di confrontare attività tra campioni simili. Qui vi presentiamo i risultati rappresentativi di uno studio clima di sperimentazione a confronto terreni che hanno subito le condizioni climatiche ambientali (ACN) per i terreni che sono stati esposti a livelli elevati di CO ₂ ed i trattamenti termici (EHN) (Figure 2-6). Copertura vegetale in tutte le trame erano caratteristici di un nord prateria di erba mista dominato dall'erba C4 Bouteloua gracile (HBK) Lag. e due C3 erbe, Hesperostipa Comata Trin e Rupr. e Pascopyrum smithii (Rydb.), circa il 20% della vegetazione è composta da carici e forbs. Ulteriori informazioni riguardanti la descrizione del sito e campo del design sperimentale in cui si trovano i riferimenti ^28-30. I suoli sono stati raccolti da due diverse profondità (0-5 cm e 5-15 cm) all'interno di ciascuna delle piazzole di trattamento con un nucleo cm di diametro 1,5 per valutare EEA suolo in risposta al clima alterato condizioni. Nei nostri esempi (cioè Figure 2-6), la dimensione del campione è (N = 3). Indipendentemente da questo campione minimo, la variazione è relativamente piccolo in molti casi (come dimostrato dalle barre di errore) e riflette robustamente variabilità potenziali EEA tra piazzole di trattamento. Analisi della varianza (ANOVA) e Tukey post hoc confronti multipli sono stati utilizzati per identificare cambiamenti significativi dell'attività enzimatica tra trame di trattamento e profondità del suolo.

I seguenti risultati rappresentativi sono stati forniti per dimostrare come questa alta velocità, saggio fluorimetrico può essere utilizzato per testare (1) SEE complessivo suoli, (2) come stechiometria SEE può essere indicativo di processi a livello di ecosistema e (3) il rapporto tra la temperatura di incubazione e del SEE. Terreno dell'AEA sono comunemente studiate per raccontare cambiamenti di funzione microbica nel suolo di sostanze nutritive ciclismo; indicatori utili per valutare le esigenze nutrizionali microbiche in risposta ai cambiamenti climatici, comunità vegetale shifts, e più in generale il funzionamento dell'ecosistema ^31-33. Stechiometria SEE è stato più recentemente adottato come indice per valutare suolo biochimica ciclo dei nutrienti intersecando teoria stechiometrica ecologica e la teoria metabolica dell'ecologia per valutare potenziali squilibri nutrizionali microbica corrispondenti alle condizioni ambientali ^5. Numerosi studi hanno suggerito che i rapporti stechiometrici larghi sono indicativi dei limiti di crescita nutrienti ^34-36, e come nutrienti del suolo diventano limitati, microbi rispondere assegnando risorse metabolici per produrre enzimi specifici per acquisire nutrienti carenti ^37. Ecoenzymatic C: N: P coefficienti stechiometrici sono quindi utili per identificare relativi spostamenti potenziali esigenze nutrizionali comunità microbiche in risposta a varie perturbazioni ambientali ^5. Infine, sensibilità di temperatura EEA possono essere utili per valutare come terreno comunità microbica diversità funzionale è probabilmente influenzato da variazioni di temperatura ^{7,38. Sensibilità di temperatura enzimatici possono variare ampiamente tra suoli per una sola classe di enzimi, e le comunità microbiche che producono enzimi hanno dimostrato spostamenti di attività enzimatica corrispondenti ai cambiamenti climatici da condizioni storiche 7. Così domande attività enzimatica relative all'ecologia termica della SEO può essere un modo utile per valutare le dinamiche funzionali microbiche e processi ecosistemici ipogea in risposta al clima cambia 39,40.}

In questo esempio, il potenziale C-, N-, e attività di acquisizione P-enzimatici saggiati a 0-5 cm profondità del suolo non differivano dal trattamento sperimentale (Figura 2a). Tuttavia, a 5-15 cm di profondità del terreno, diversi potenziali EEA hanno mostrato differenze significative (Figura 2b). Per esempio, gli enzimi di degradazione C β-1 ,4-glucosidasi e β-D-cellobioidrolasi erano inferiori nelle trame EHN (p ≤ 0,038; Figura 2b) rispetto alle trame ACN. Il minatore N e Palizing enzimi (β-1 ,4-N-acetilglucosaminidasi e fosfatasi, rispettivamente) erano anche inferiori nelle trame Ehn (p ≤ 0,012; Figura 2b) rispetto ad ACS a 5-15 cm di profondità del terreno.

Calcolo e tracciare la somma di tutte le C-, N-, o potenziali EEA P-bicicletta può essere un approccio utile per osservare i modelli più ampi per quanto riguarda il potenziale del terreno C-, N-, e / o P-cicli (Figura 3). In questo esempio, la somma di β-1 ,4-glucosidasi, β-D-cellobioidrolasi, β-Xylosidase, e α-1 ,4-glucosidasi potenziali EEA è stato calcolato per rappresentare potenziali attività C ciclismo. La somma di β-1 ,4-N-acetilglucosaminidasi e L-leucina aminopeptidasi stato calcolato per rappresentare potenziali attività bicicletta N. Fosfatasi è stato utilizzato per rappresentare potenziali attività P bicicletta. In questo esempio, i potenziali EEA per totale C-, N-e P-ciclismo mossi al più basso nel EHN trame rispetto alle trame ACN ai 5-15 cm di profondità del suolo (Figure 3). Tuttavia, questa tendenza è stato significativo solo per il totale delle attività in bicicletta N e P (p ≤ 0,046; Figura 3). EEA terreno non differivano significativamente tra le trame di trattamento a 0-5 cm di profondità del suolo (Figura 3). I risultati di questo esempio indicano tendenze contrastanti in enzima attività di gruppo funzionale (cioè C-, N-, o P-enzimi degradanti) tra le trame di trattamento (ACN vs EHN) in risposta alla profondità del suolo. Ad esempio, C-, N-e EEA suolo P-degradanti nelle trame ambientali (ACN) hanno teso superiore a profondità inferiori rispetto ai terreni esposti a livelli elevati di CO ₂ e riscaldamento (EHN), che ha dimostrato un pattern inverso (Figura 3a-c ).

Stechiometria enzima è un altro metodo utile per valutare potenziali attività enzimatiche nell'ambiente (Figura 4). La domanda microbica di sostanze nutritive è determinata dalla stechiometria elementare della biomassa microbica in relazione ambientaledisponibilità di nutrienti ^32. Allo stesso modo, i microbi producono enzimi specifici (ad esempio C, N-, o enzimi P-degradanti) per soddisfare le esigenze nutrizionali nei loro ambienti di terreno, di cui anche come stechiometria ecologica ^41. Il rapporto tra potenziali EEA è un modo per valutare le esigenze nutrizionali microbiche. Ad esempio, un rapporto di 1:1 tra i due enzimi gruppi funzionali (ad esempio in C: N acquisizione di nutrienti) suggerisce che la domanda di N è elevato rispetto alla domanda di C quando si considera la biomassa microbica C: N rapporti a livello di comunità è tipicamente 08:01 ^42. In questo esempio, enzima suolo stechiometria C: N, C: P, o N: P attività differiscono significativamente tra le trame di trattamento di 0-5 cm profondità del suolo (figure 4a-c). Tuttavia, il potenziale enzima C: P e N: rapporti P erano più alti nel EHN trame rispetto alle trame ACN ai 5-15 cm di profondità del suolo (p = 0.05; figure 4b e 4c). Questa osservazione suggerisce che viè relativamente più elevati EEA P mineralizzazione rispetto a C e N SEE le trame ACN (rispetto al EHN) ai 5-15 cm di profondità del terreno. Enzima C: N rapporti di attività di acquisizione hanno dimostrato un andamento simile a quello dimostrato da C EEA totali con maggiore C: N a causa di maggiori potenziali C SEAE trame ACN alla profondità inferiore rispetto a EHN (Figura 4a).

La temperatura può influenzare fortemente EEA suolo. Tuttavia, in saggi tipici laboratorio, enzimi suolo sono misurati a una singola temperatura che potrebbe non corrispondere in condizioni di temperatura in situ. Il nostro metodo di analisi di fluorescenza enzima permette di considerare in effetti di temperatura in situ, integrando molteplici temperature di incubazione di laboratorio per il confronto. Utilizzando incubazione di laboratorio a più temperature ci permette di analizzare dipendenti dalla temperatura dati di cinetica enzimatica utilizzando Arrhenius trama e Q ₁₀ calcoli. Arrhenius plot vengono utilizzati per visualizzare energia di attivazione, e ci stanno tracciatizione del logaritmo dell'attività enzimatica (asse y variabile dipendente) in funzione della temperatura inversa convertito in gradi Kelvin (1 / K) su l'asse x (ossia la variabile indipendente; figure 5a-c). Energia di attivazione è comunemente definita come la minima energia necessaria per catalizzare una reazione chimica (cioè degradare un determinato substrato in prodotti più piccoli). Per i nostri scopi, energia di attivazione funge da proxy per la sensibilità alla temperatura di reazioni enzimatiche catalizzate. Maggiore energia di attivazione indica la sensibilità alla temperatura enzima. Allo stesso modo, energie di attivazione (cioè figure 5d-F) corrispondono direttamente a Q ₁₀ valori (cioè figure 6a-c). Una ulteriore spiegazione di formule utilizzate per calcolare l'energia di attivazione e applicazione pratica può essere trovato in molti passato opere ^40,43-45. Trame Arrhenius, energia di attivazione, e Q ₁₀ piazzole forniscono informazioni ridondanti e non devetutti essere utilizzato nello stesso manoscritto per presentare i dati per la pubblicazione (figure 5 e 6). Pertanto, quando si utilizzano queste tecniche, è necessario scegliere il tipo di grafico più appropriato per la vostra temperatura enzima - cinetica dati ^10. Tutti i tipi di grafico (Arrhenius e Q ₁₀₎ sono stati presentati qui a scopo dimostrativo, per fornire esempi visivi di come presentare i risultati degli enzimi.

Nei nostri esempi, abbiamo valutato i potenziali cinetica enzimatica per il potenziale C-, N-e P-EEA sia tra gli appezzamenti di trattamento alle due profondità del suolo (Figura 5, Figura 6). La scoperta ha dimostrato che la sensibilità alla temperatura del SEAE non era significativamente differente tra appezzamenti di trattamento sia a profondità di terreno per l'energia di attivazione, come dimostrato nelle trame Arrhenius (figure 5a-c) e corrispondenti energie di attivazione (Figura df) e (non sorprendentemente) per Q ₁₀ plots (in questo esempio tra i 15 ° C e 25 ° C incubazioni laboratorio; figure 6a-c). Ciò suggerisce che la cinetica enzimatica non sono stati influenzati dal campo di trattamenti sperimentali in questo studio particolare.

Tabella 1. Il design piastra ben profondo per concentrazioni standard di fluorescenza con campioni di terreno. Template per l'organizzazione e gli standard di carico fluorescenza (MUB o MUC) con campioni di suolo nella piastra pozzo profondo prima di incubazione. Nota: Le colonne rappresentano gli stessi campioni di terreno (800 microlitri di terreno aggiunte liquami). Un gradiente di concentrazioni standard fluorescenza viene caricato per ogni riga (200 microlitri aggiunte). Ogni cella rappresenta concentrazione standard di fluorescenza più terreno integrazioni dei fanghi. Ad esempio, S1 - S12 rappresentano campioni di suolo (800 microlitri di liquame suolo); MUB 0-100 micron = 4 Methylumbelliferone concentrazioni (200 aggiunte microlitri). In questo esempio, riga H è aperto, ed è quindi disponibile per includere una maggiore concentrazione standard fluorescenza se necessario. La decisione di aumentare le concentrazioni di curva standard può essere necessario per maggiore potenziale di attività enzimatica (e / o le concentrazioni di substrato utilizzati) per i vostri campioni specifici di suolo. Il potenziale attività enzimatica per i vostri campioni dovrebbe rientrare nel range dei valori di curva standard. Clicca qui per vedere tabella più grande .

Tabella 2. Il design piastra pozzo profondo per i campioni di suolo con substrato. Template per l'organizzazione e il caricamento di campioni di suolo e substrati nella piastra pozzo profondo prima di incubazione. Nota: Le colonne rappresentano gli stessi campioni di terreno (800 microlitri di cosìIL aggiunte in sospensione). Diversi substrati vengono caricati su ogni riga (200 microlitri integrazioni). Ogni cella rappresenta campioni di terreno più l'aggiunta del substrato. Ad esempio, S1 - S12 rappresentano campioni di terreno unici (800 microlitri di liquame suolo). Substrati (200 microlitri) aggiunte le seguenti: BG = 4 metilumbelliferil β-D-glucopyranoside; CB = 4 Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; NAG = 4 Methylumbelliferyl N-acetil-β-D-glucosaminide; PHOS = 4 Methylumbelliferyl fosfato: XYL = 4 Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside; AG = 4 Methylumbelliferyl α-D-glucopiranoside e LAP = L-Leucina-7-amido-4-metil cloridrato. In questo esempio, fila H è aperto, ed è quindi disponibile per includere un altro substrato per valutare un altro potenziale attività enzimatica, se lo desideri. Clicca qui per vedere tabella più grande .

Temperatura	Tempo
4 ° C	~ 23 hr
15 ° C	6 ore
25 ° C	3 ore
35 ° C	1.5 hr

Tabella 3. Le temperature Incubatore richiesto per corrispondenti periodi di incubazione. Temperature di incubazione e periodi di tempo corrispondenti per la procedura del test enzimatico.

Tabella 4. MUB e calcoli della curva standard MUC. Viene illustrato come organizzare a) MUB e b) i dati grezzi di fluorescenza MUC (mol) per calcolare successivamente pendenza, intercetta y, e valori di R-squared. Per calcolare la pendenza, intercetta y, e valori di R-squared ai tuoi curve concentrazione standard, selezionare (o plot) l'MUB e / o dati di fluorescenza MUC greggio come variabile dipendente (y) e la concentrazione standard (mmol) come variabile indipendente (asse x). Nota:. MUB = 4 metilumbelliferone; MUC = 7-Amino-4-metilcumarina Clicca qui per vedere tabella più grande .

Tabella 5. . Calcoli attività enzimatica illustrato come a) organizzare i dati grezzi di fluorescenza del campione e, successivamente, eseguire i passaggi necessari (bf) per calcolare EEA in: attività mmol / g di terreno asciutto / h. Nota: S1 - S12 rappresentano esemplari unici di terreno. Substrati includono: BG = 4 metilumbelliferil β-D-glucopyranoside; CB = 4 Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; NAG = 4 Methylumbelliferyl N-acetil-β-D-glucosaminide; PHOS = 4 Methylumbelliferyl phosphate: XYL = 4 Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside; AG = 4 Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside e LAP = L-leucina-7-amido-4-metil cloridrato. Clicca qui per vedere tabella più grande .

Figura 1. MUB trama curva standard. Visualizzazione dispersione di curve standard con dati di fluorescenza prime come la variabile dipendente (asse y) e la concentrazione standard (mol) come variabile indipendente (asse x).

Figura 2. C, N e P attività enzimatiche ciclismo. Potenziali SEAE di prateria di riscaldamento e Veduta di CO ₂ Enarricchimento (PHACE) sito in appezzamenti di controllo (ACS: esposto a condizioni climatiche ambientali) e le trame di trattamento (EHN: esposti a un aumento della temperatura ed elevata CO _2). Enzimi del suolo sono stati analizzati in a) 0-5 cm di suolo profondità e b) profondità di 5-15 cm di suolo. Le barre verticali rappresentano media ± SE Nota: ACN = ambientali - piazzole sul clima; EHN = elevata di CO ₂ e trame di riscaldamento. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Totale C, N e P ciclismo enzima rapporti stechiometrici La somma dei potenziali EEA coinvolti nell'acquisizione di a) C, b) N, e c) P-per entrambi i gruppi di trattamento nell'esperimento PHACE a 0-5 cm e 5. - 15 centimetri suolo profondità. Vbar ertical rappresentano media ± SE Nota: ACN = ambientali - piazzole sul clima; EHN = elevata di CO ₂ e trame di riscaldamento. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Enzima stechiometria per un totale C, N, P e le attività enzimatiche ciclismo attività di acquisizione Enzyme rapporti stechiometrici alla prateria di riscaldamento e Veduta di CO ₂ Enrichment (PHACE) sito in appezzamenti di controllo. (ACN: esposto a condizioni ambientali climatiche) e le trame di trattamento (EHN: esposti a un aumento di temperatura elevata e CO _2). Terreno Totale a) C: N, b) C: P e c) N: P è stata tracciata per entrambi i gruppi di trattamento a 0-5 cm e 5-15 cm di profondità del terreno. Le barre verticali rappresentano media ± SE Nota: ACN= Ambiente - terreni clima; EHN = elevata di CO ₂ e trame di riscaldamento. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. . Totale C, N e P in bicicletta energie di attivazione enzimatica sensibilità Temperatura di potenziali EEA visualizzato utilizzando trame Arrhenius per un totale a) C, b) N, ec) P enzimi degradanti, nonché i corrispondenti valori di energia di attivazione per un totale d) C , e) N, ed f) P enzimi degradanti tra trame di trattamento e profondità del suolo presso la prateria di riscaldamento e Veduta di CO ₂ Enrichment (PHACE) del sito. Le barre verticali per l'energia di attivazione (cioè df) rappresentano media ± SE Nota: ACN = ambient - terreni clima; EHN = elevata di CO ₂ e le trame di riscaldamento. Per la pubblicazione, è importante notare che l'autore in genere scegliere di presentare sia trame Arrhenius (cioè ac) o valori di energia di attivazione (cioè DF), ma non entrambi i tipi di trama. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6. Totale C, N e P ciclismo enzima Q10 sensibilità (15-25 ° C). Temperatura di potenziali EEA misurati come Q _10, sulla base incubazioni laboratorio a 15 ° C e 25 ° C per un totale) C, b) N, e c) P enzimi degradanti tra trame di trattamento e profondità del suolo al Prairie riscaldamento e Veduta di CO _{2 <}/ Sub> Enrichment (PHACE) del sito. Le barre verticali per Q10 rappresentano media ± SE Nota: ACN = ambientali - piazzole sul clima; EHN = elevata di CO ₂ e trame di riscaldamento. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussione

La misurazione in laboratorio di potenziali EEA suolo può fornire importanti intuizioni risposte microbiche al loro ambiente abiotico, e le loro conseguenze per il funzionamento degli ecosistemi. I risultati di questo insieme di dati esempio suggeriscono che esistono differenze minime nella attività enzimatica del suolo o cinetiche tra trame trattamento clima. Tuttavia, le tendenze inverse tra trame incoraggiare ulteriori indagini di covariate che possono influenzare la produzione di EEA microbici quali umidità del suolo, pH del terreno o la crescita delle piante. Nel complesso, valutando EEA in termini di (1) SEE complessiva nei terreni, (2) stechiometria SEE (3) energia trame Arrhenius / attivazione, e (4) Q ₁₀ fornisce un ampio spettro di approcci che possono essere indicativi di processi a livello di ecosistema da cui caratterizzare robusto ecosistema del suolo dinamiche funzionali.

High-throughput basato sulla fluorescenza saggi SEE sono un utile strumento che è ampiamente utilizzato per esaminare i potenziali EEA nei suoli ealtri ambienti. Importante, potenziali attività riflettono la dimensione del pool enzima, ma non da soli quantificano i tassi di produzione o fatturato enzimi ^46. Anche se la tecnica è relativamente semplice, differenze apparentemente minori tra i protocolli di laboratorio possono ostacolare la comparabilità dei risultati ^13. Sfortunatamente, al momento non abbiamo controlli positivi standardizzati adatti per SEAE. L'uso di rapporti stechiometrici è un approccio per superare queste sfide. Altrimenti, l'avvento di tecniche high-throughput ha avanzato lo studio degli enzimi nell'ambiente ^4. Interpretazione attenta dei dati generati da questi test potrebbe chiarire importanti tendenze in attività microbica.

La robustezza del protocollo deriva dalla capacità di selezionare per condizioni specifiche di singoli campioni, ma questo può anche causare limitazioni. Sarà necessaria una serie di modifiche per garantire campioni paragonando i siti singoli campi:

Buffer

Il buffer selezionato dipenderà dal pH del terreno. Buffering stabilizza anche l'intensità di fluorescenza delle norme fluorescenti, che è altamente dipendente dal pH ^27,47. Il buffer pH che di solito usiamo per fare l'impasto suolo è un acetato 50 mM di sodio o di tampone Tris che viene scelto per la particolare acido costante di dissociazione del tampone (pKa) per terreno migliore partita - i livelli di pH del campione. Acetato di sodio ha un pKa di 4,76, e Tris ha un pKa di 8,06 quindi le quantità di questi due buffer varia per raggiungere il pKa desiderata del campione individuale. Tampone fosfato (pKa = 7.2) è stato suggerito per terreni neutri / leggermente basica. Tuttavia, si avverte per verificare la variabilità analitica in studi preliminari prima di utilizzare questo buffer, come alte concentrazioni di fosfato possono interferire con l'attività enzimatica.

Manipolazione e stoccaggio dei substrati fluorescenti

jove_content "> test di fluorescenza possono soffrire di disturbi causati da impurità e / o instabilità di molti composti fluorescenti se esposti alla luce, quindi è necessaria cautela nel maneggiare substrati fluorescenti. Consigliamo vivamente di ridurre al minimo l'esposizione alla luce di etichetta fluorescente substrati e MUB e norme MUC . Utilizzando bottiglie di vetro ambra o copre il vetro e contenitori utilizzati per la preparazione ed il deposito substrati e standard fluorescenti è altamente raccomandato, fogli di alluminio per avvolgere oggetti in vetro e contenitori funziona bene Analogamente, inoculando in modo efficiente piatti e il trasferimento di incubatori scuro è migliore prassi Vi consigliamo.. memorizzazione substrati e gli standard (-20 ° C) per non più di due mesi (mentre li protegge dalla luce) e substrati scongelamento (5 ° C) ~ 24-48 ore prima di iniziare il dosaggio enzimatico (s).

Progettazione e replica

Per meglio conto per bene alle variazioni del campione e, di attuazione negative controlli per analisi e (se possibile) saggio replica è raccomandato. Variazione verifica in genere a causa di differenze nella quantità di particelle di suolo in ciascun pozzetto ed errori di pipettaggio. Pertanto, forte di miscelazione e buona tecnica di pipettaggio saranno sostanzialmente minimizzare bene a variazione bene. Inoltre, si consiglia vivamente l'implementazione di un controllo test negativo (soluzione tampone del substrato +) per monitorare le incongruenze del substrato nel corso del tempo. Questo può essere facilmente monitorato durante la lettura delle piastre di enzimi confrontando pozzetti di controllo negativo (si utilizzano in genere l'ultima colonna delle piastre a 96 pozzetti). Controlli substrato negativi sono generalmente stabili, quindi il segnale aumenta notevolmente superiori limite di rivelazione, è indicativo di contaminazione o substrato instabilità, richiedendo la sostituzione del substrato e / o soluzioni standard.

Per massimizzare il throughput, il nostro protocollo prevede diversi potenziali EEA in una singola micropiastra pozzo profondo, anche se altri protocolli svolgono un tipo ditest per piastra (cioè un substrato per piastra) in quanto diversi EEA avviene a velocità diverse. Indipendentemente da ciò, l'ottimizzazione enzima deve essere eseguita su terreni prima di eseguire questo alto per tutto l'approccio o il metodo piatto unico. Substrati multipli possono essere utilizzati su una singola piastra se le velocità di reazione sono relativamente coerente per ciascun enzima entro il periodo di incubazione.

Il nostro protocollo raccomanda ~ 2,75 g di terreno per rendere la soluzione liquami, mentre ~ 1 grammo è raccomandato in altri protocolli ^24. Ti consigliamo di utilizzare più suolo (se possibile) è un approccio efficace per una migliore cattura all'interno del campione la variazione del suolo nei livelli di attività enzimatica. In questo protocollo, abbiamo incubare 800 ml di liquame terreno con 200 ml di substrato, mentre altri incubare solo 200 ml di liquame terreno con 50 ml di substrati. Questa è semplicemente una funzione di scaling up che alla fine non cambia l'attività misurata. Ci sono anche vantaggi praticiper l'utilizzo di volumi maggiori. Uno, è più facile evitare particolato soil durante il pipettaggio in corrispondenti lastre nere a 96 pozzetti a fondo piatto prima di registrare intensità sul fluorometro. In secondo luogo, il volume supplementare è utile in caso di perdite accidentali durante il trasferimento delle piastre a 96 pozzetti a fondo piatto nero al fluorimetro prima di registrare intensità di fluorescenza enzimi correlati. Anche lievi scostamenti in termini di volume diminuiranno in modo significativo fluorescenza tra i pozzetti. Infine, a causa della elevata velocità natura di questo protocollo, che comunemente eleggiamo a fare affidamento sulla replica sperimentale per rappresentare la variazione dei livelli di attività enzimatica, invece di effettuare test replica. E 'sempre consigliabile inserire repliche analitiche, ma in pratica, ci sentiamo il nostro protocollo prevede un compromesso equilibrato tra le repliche analitici e sperimentali date le risorse limitate. Allo stesso modo, il nostro approccio utilizza suolo relativamente più ben omogeneizzato (2,75 g) per dosaggio ^25, che inerirediminuisce nte all'interno del suolo variazioni. La decisione di utilizzare repliche di analisi deve essere attentamente considerato da test per errore analitico in studi preliminari ^48. Tuttavia, si consiglia di disegni sperimentali con meno di 4 repliche di trattamento del gruppo dovrebbe fortemente considerare l'utilizzo di analisi di repliche.

Suolo, volumi buffer, e ottimizzazione concentrazione del substrato

Il tampone del suolo: substrato tasso di concentrazione è una variabile importante che influenza fortemente la fluorescenza misurata durante l'esecuzione di saggi enzimatici. La quantità di suolo nello slurry aggiunto per eseguire il test o la concentrazione di substrato può essere necessario regolare a seconda dell'attività degli enzimi nel campione di suolo. Gli importi scelti per questo esempio si basavano su precedenti test di questi terreni al fine di garantire che la disponibilità di substrato è stato limitativo, e che stavamo misurando i tassi massimi possibili nelle condizioni di saggio (V _max) ^44,45. Tuttavia, per i campioni di terreno che hanno alte concentrazioni di enzimi, il grado di sporco o concentrazione del substrato deve essere aumentata. Abbiamo trovato che l'aumento concentrazioni di substrato (e regolando la curva standard conseguenza) può influenzare linearità della curva. Pertanto, si consiglia di ridurre gli importi del suolo e / o adeguamenti proporzionali al buffer volumi, se necessario. Indipendentemente da ciò, è importante ottimizzare la concentrazione del substrato per ogni tipo di terreno analizzati perché EEA misurate possono differire da un ordine di grandezza maggiore tra le concentrazioni di substrato saturi e sub-saturi ^26. Pertanto, le differenze tra i trattamenti sperimentali (ecc) sono suscettibili di tipo II errore statistico e meno probabilità di essere rilevato in condizioni sub-saturazione, e l'errore statistico ^27,35. Per ottimizzare concentrazioni di substrato, saggi preliminari enzimi dovrebbero eseguite su campioni rappresentativi di terreno utilizzando una vasta gamma di concentrazioni di substrato. Doporegistrazione della fluorescenza, è sufficiente tracciare i dati (analogamente all'esempio curva standard; la figura 1) per identificare la concentrazione del substrato (asse x) che corrisponde ad attività enzimatica (asse y) dove i livelli di pendenza OFF (~ 0). Analogamente, la concentrazione del substrato corrispondente al punto in cui i livelli di pendenza OFF (~ 0) è una buona indicazione della concentrazione del substrato ottimale per quel particolare terreno.

Questo saggio misura definitiva fluorescenza in un dato tempo prodotta dalla porzione fluorogenico che viene scisso dal substrato per effetto di enzima-substrato mediata depolimerizzazione. Pertanto, il passaggio 5 (aggiunta del substrato) è critica e deve essere eseguita nel modo più efficiente possibile al fine di minimizzare il tempo tra quando il substrato viene aggiunto ai terreni e quando i saggi vengono incubati. Analogamente, quando il substrato viene a contatto con il campione, reazioni enzimatiche inizieranno a verificarsi. Si consiglia di utilizzare un multi-canalepipetta per questo motivo. E 'fortemente consigliato a diventare efficiente utilizzando la pipetta multicanale prima del giorno si sta eseguendo i vostri saggi enzimatici. Per fare questo, si può praticare pipettaggio con l'acqua fino a quando si può facilmente trasferire volumi nelle piastre a 96 pozzetti con la pipetta.

Suolo Tempra

Tempra si riferisce a diminuire l'intensità di fluorescenza causata da particelle e / o materiale organico nel suolo fanghi-incubazione ^26. Tempra può essere influenzata regolando il terreno: rapporti di buffer ^25. A causa fluorescenza di fondo da singoli campioni, è fondamentale eseguire standard con campioni per tenere conto di sfondo (quenching) fluorescenza. Anche se alcuni protocolli utilizzano un'unica concentrazione dopo la prova che il segnale è lineare, si consiglia vivamente di attuare un controllo tempra standard per ogni campione al meglio il controllo per gli effetti della tempra. In caso contrario, si tradurrà in uno standcurva ard non applicabile al campione, e una stima errata di attività enzimatica. L'aggiunta di standard per boiacche suolo non è time-sensitive, come l'aggiunta dello standard non influisce sulla fluorescenza di fondo di campione.

NaOH aggiunta

L'aggiunta di NaOH viene utilizzato in alcuni protocolli per ottimizzare fluorimetrica misurazione dell'attività enzimatica perché il colorante fluorescente rilasciato dai substrati sintetici presenta picco di fluorescenza a pH> 9.0 ^26,49. Quando si considera questo suggerimento, la concentrazione di NaOH necessaria per il pH slurry terreno (cioè a pH> 9) varierà a seconda del terreno particolare e il tampone pH utilizzato ^26. Tuttavia, altri sostengono che NaOH non potrebbe essere indispensabile perché l'intensità del segnale è generalmente molto elevata anche a basso pH, e perché introduce un'ulteriore fonte di errore di misura. Per esempio, l'effetto di aggiunte di NaOH in slurry pH e fluore quindi MUB o MUCcambia scence nel tempo ^25. Substrati MUB collegati hanno dimostrato di dimostrare maggiore fluorescenza costante per 20 min seguito aggiunte di NaOH prima livelli cono, mentre MUC ha dimostrato costante diminuzione fluorescenza fino a 60 min ^26. Pertanto, è importante standardizzare il tempo tra NaOH aggiunta e la misurazione della fluorescenza. In alternativa, se i livelli di fluorescenza sono sufficientemente rilevabili senza Inoltre, condurre i saggi senza aggiungere NaOH è stata suggerita come alternativa ugualmente accettabili ^26.

Temperatura

Sensibilità alla temperatura dovrebbe essere preso in considerazione al momento di decidere temperatura di incubazione. Se l'interesse primario è la comprensione cinetica enzimatica, con tre o più temperature come illustrato utilizzando trame Arrhenius (nella sezione risultati) è un approccio robusto. Se il sito di esempio presenta caratteristicamente bassa temperatura, come terreno permafrost, poi il duration di incubazione può dover essere estesa per consentire gli enzimi di reagire nelle temperature di incubazione più fredde. Mentre cinetica enzimatica tradizionali suggerisce che un aumento della temperatura, deve aumentare l'attività enzimatica, abbiamo trovato che gli enzimi possono essere luogo specifico in termini di sensibilità alla temperatura ^50. Quindi per capire il potenziale attività enzimatica sito-specifica è fondamentale che la temperatura di incubazione e la durata essere regolati per riflettere i valori del sito campo.

Conclusione

Straordinari sono i motori fondamentali processi biogeochimici dei suoli, e quindi abbiamo bisogno di essere in grado di misurare le loro attività. Ci sono molte sfide per EEA nei suoli, comprese le interferenze e l'inibizione di misurazione. Nonostante queste sfide, protocolli standardizzati (come quello qui descritto) possono essere applicate universalmente per misurare EEA per una vasta gamma di enzimi. Mentre è abbastanza facile da generare dati di qualità seguendo questi protocolli, l'ininterpretazione di questi dati in un contesto ecologico richiede un'attenta considerazione di ciò che questi test siano realmente misurando, e come EEA in condizioni di saggio possono differire da quelli in condizioni in situ.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG)	Sigma Aldrich	M9766	Degradazione dello zucchero
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG)	Sigma Aldrich	M3633	Degradazione dello zucchero
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB)	Sigma Aldrich	M6018	Degradazione della cellulosa
L-leucina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato (LAP)	Sigma Aldrich	L2145	Degradazione delle proteine
4-metilumbelliferile N-acetil-β-D-glucosaminide (NAG)	Sigma Aldrich	M2133	Degradazione della chitina
4-metilumbelliferil fosfato (PHOS)	Sigma Aldrich	M8883	Mineralizzazione
del fosforo4-metilumbelliferil-β-D-xilopiranoside (XYL)	Sigma Aldrich	M7008	Degradazione dell'emicellulosa
4-metilumbelliferone (MUB)	Sigma Aldrich	M1381
7-ammino-4-metilcumarina (MUC)	Sigma Aldrich	A9891
50 mM tampone anidro acetato di sodio	Fisher	Scientific S210-500	terreni acidi e neutri
50 mM Tris tampone base	Fisher Scientific	BP154-1	terreni basici
Equipment
Bel-Art Scienceware serbatoi di pipettaggio monouso	Fisher Scientific	14-512-65	serbatoio di pipettaggio
Elettronico; Eppendorf Xplorer; Pipetta	Fisher Scientific	13-684-265	8 canali a 8 canali, intervallo: 50-1.200 μ l
TipOne 101-1.250 μ l punte naturali di lunghezza estesa	USA Scientific	1112 - 1720	10 rack da 96 punte (960 punte)
Piastra riscaldante; superficie riscaldante: 10 pollici x 10 pollici.	Fisher Scientific	11-100-100SH	Piastra di agitazione magnetica a disco da laboratorio
Frullatore Waring	Fisher Scientific	14-509-7P	Contenitore in acciaio inossidabile da 1 L (34 oz)
MARCA Dispensette III dispenser per flaconi	Fisher Scientific	13-688-231	Dispenser; gamma: 5-50 ml
Wheaton Unispense μ Pompe peristaltiche P	Fisher Scientific	13-683-7	Dispenser opzionale Agitatore
magnetico Fisherbrand	Fisher Scientific	1451363SIX	Utilizzato per mescolare i liquami di terreno dopo la miscelazione
Ciotole in vetro Pyrex World	Kitchen	5304218	Pyrex 10 oz tazza per crema pasticcera
bordata Costar 96 pozzetti piastre solide nere	Fisher Scientific	07-200-590	Utilizzato per il passaggio del lettore di piastre
Blocchi per saggi Costar a 96 pozzetti	Fisher Scientific	07-200-700	V-bottom; 2 ml; sterili
Thermo Scientific Nunc Tappetini con tappo a 96 pozzetti	Fisher Scientific	14-387-93	Tappetino sterile con tappo a 96 pozzetti per pozzetti quadrati
Centrifuga dotata di supporti per piastre a pozzetti profondi	Thermo Scientific	3121	Centra-GP8 (questo modello non è più disponibile)
Lettore di micropiastre multifunzione Tecan Infinite serie 200	Tecan	30016058	Lettore di piastre (questo modello non è più disponibile)