Drosophila è famosa per la sua manipolazione genetica potente, ma non per la sua idoneità di analisi biochimica in profondità. Qui vi presentiamo una procedura basata TAP-per identificare interagiscono partner di qualsiasi proteina di interesse da parte del cervello della mosca. Questa procedura può potenzialmente portare a nuove vie di ricerca.
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Articolo metodologico
Identificare proteina-proteina interazione in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Schermi genetici condotti utilizzando Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) hanno fatto numerose scoperte pietra miliare nel progresso delle scienze biologiche. Tuttavia, l'uso di schermi biochimiche finalizzate ad estendere le conoscenze acquisite da analisi genetica è stata esplorata solo di recente. Qui si descrive un metodo per purificare il complesso proteico che si associa con qualsiasi proteina di interesse da teste di mosca adulta. Questo metodo sfrutta il sistema Drosophila GAL4/UAS per esprimere una proteina esca fuso con un Tandem Affinity Purification (TAP) tag in neuroni di topo in vivo e quindi implementa due cicli di purificazione utilizzando una procedura TAP simile a quello inizialmente stabilito in lievito 1 per purificare il complesso proteina interagente. Al termine di questa procedura, una miscela di diversi complessi proteici si ottiene la cui identità molecolare può essere determinato mediante spettrometria di massa. Validazione delle proteine candidati beneficeranno del reSource e facilità di esecuzione di perdita-di-funzione studi di mosche. Approcci simili possono essere applicati ad altri tessuti mosca. Crediamo che la combinazione di manipolazioni genetiche e questo approccio proteomico nel sistema modello fly detiene un enorme potenziale per affrontare i problemi fondamentali nel campo della neurobiologia e oltre.
Introduzione
Definizione dei meccanismi molecolari o reti che mediano un particolare processo biologico è uno degli obiettivi finali della ricerca biomedica. Fly genetisti hanno dipendeva pesantemente sulla genetica in avanti, soprattutto modificatore schermi genetici (sia enhancer e schermi soppressori), per identificare i fattori che lavorano insieme, in parallelo, o monte oa valle di un gene di interesse. Tuttavia, gli schermi genetica in avanti spesso non riescono a identificare i geni essenziali che, se mutato, causa letalità nelle fasi precoci dello sviluppo, oi geni con ridondanza funzionale e compensazione la cui perdita di funzione solo causare difetti sottili che sono d....
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Protocollo
1. Generare UAS-TAP-tag mosche transgeniche
- Generare pUAST-TAP-tagged costrutti di DNA.
- Decidere quale lato (N-o C-terminale) della proteina esca il tag TAP deve essere fuso a, sulla base della struttura / funzione della proteina. Si veda la discussione per ulteriori dettagli.
- Subclone la regione codificante del cDNA del gene di interesse nei siti di clonazione multipla (MCS) dei vettori pUAST-NTAP o pUAST-CTAP per generare N-o C-terminale con targhetta transgeni UAS-TAP, rispettivamente. Vedere la Figura 1 per le mappe dettagliate e siti di restrizione utilizzabili e cornici di lettura.
- Generare UAS-....
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Risultati
Qui mostriamo il nostro sforzo per identificare le proteine Highwire interagenti nel cervello della mosca. Highwire (HIW) e le sue vertebrati e invertebrati omologhi sono enormi ubiquitina ligasi che regolano lo sviluppo e la riparazione del sistema nervoso 14. Essi condividono un certo numero di domini funzionali altamente conservate. Tuttavia, le loro azioni molecolari non sono del tutto chiare. Lavoro fatto in verme, vola e mouse hanno portato a modello di lavoro corrente che funzioni hiw come ligasi E3 .......
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Discussione
Metodo Tandem purificazione per affinità (TAP) offre un protocollo dual purificazione che permette l'isolamento e l'arricchimento di complessi proteici attraverso due passaggi di purificazione di affinità indipendenti. Il design del tag TAP non è limitata a ciò che viene presentato in questo protocollo, le altre proteine domini di legame e motivi sono applicabili anche se le condizioni del buffer vengono adeguati di conseguenza. Un buon esempio di altri tag TAP è il tag GS-TAP, una combinazione di una proteina.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo EUROSARF per averci inviato il lievito TAP plasmidi di espressione. Siamo anche grati per l'aiuto editoriale da Ryan Labadens. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa NIH / NINDS (R01NS070962) per CW
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Setaccio analitico standard U.S.A. n. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| Setaccio analitico standard U.S.A. n. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| Perline di sefarosio IgG | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-colonna 0,7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-colonna 0,5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Perline di calmodulina | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortaio e pestello | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Proteasi | Invitrogen | 12575-015 | |
| Inibitore della proteasi Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Inibitore della proteasi Mix | Sigma | P8340 |
Riferimenti
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive....
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Ristampe e permessi
