Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

Sommario

Qui riportiamo un'applicazione della tecnica deflessione del fascio photothermal in combinazione con un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, per monitorare microsecondi e millisecondi dinamica ed energetica di cambiamenti strutturali connessi con l'associazione calcio per un sensore calcio neuronale, Downstream elemento di regolazione Antagonista Modulator .

Abstract

Deflessione del fascio Photothermal insieme con la foto-acustica calorimetria e griglia termica appartiene alla famiglia dei metodi fototermiche che controllano il volume e il tempo di entalpia profilo cambiamenti di luce indotti cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​sulla microsecondo per millisecondo scale temporali che non sono accessibili con fermata tradizionale -flow strumenti. Inoltre, poiché le variazioni complessiva del volume e / o entalpia vengono sondati, queste tecniche possono essere applicate a proteine ​​e altre biomacromolecole che mancano di un fluoroforo e o un'etichetta cromoforo. Per monitorare la dinamica ed energetica dei cambiamenti strutturali connessi con Ca ^{2 +} vincolante ai trasduttori di calcio, tali sensori di calcio neuronali, un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, è impiegato per foto-trigger un facile (τ <20 msec) aumento del calcio libero variazioni di concentrazione e il volume associato e entalpia vengono sondati con fascio fototermica tecnica di deflessione.

Introduzione

Photo-thermal metodi come la calorimetria fotoacustica, deflessione del fascio fototermica (PDB), e griglia transitoria accoppiato con eccitazione laser nanosecondo rappresentano una potente alternativa a transitori spettroscopie ottiche per gli studi risolta in tempo di breve durata intermedi ^1,2. Contrariamente alle tecniche ottiche, come l'assorbimento transiente e spettroscopia IR, che monitorano il profilo temporale delle variazioni di assorbimento nella cromoforo circostante; tecniche fototermiche rilevano la dipendenza dal tempo delle variazioni di calore / volume e quindi sono strumenti preziosi per lo studio di profili temporali otticamente pr....

Protocollo

1. Preparazioni di esempio

1. Eseguire la preparazione dei campioni e tutte le manipolazioni del campione in una stanza buia per evitare un uncaging indesiderato.
2. Solubilizzare DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetossifenil) - N, N, N ', N'-tetrakis [(ossi-carbonile) metil] -1,2-ethanediamine) in HEPES 50 mM tampone, KCl 100 mM, pH 7,0 ad una concentrazione finale di 400 pM (ε = _350nm 4330 m ^-1 cm ^{-1 9).}
3. Aggiungere CaCl ₂ dalla soluzione stock 0,1 M per ottenere un rapporto desiderabile di [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. Per le proteine ​​con la K _d per Ca ^2....

Risultati

Un esempio rappresentativo di PBD tracce di Ca ^{2 +} photo-release di Ca ^{2 +} DM-nitrophen è mostrata in figura 3. La fase veloce corrisponde alla foto-scissione di Ca ^{2 +} DM-nitrophen e Ca ^{2 +} liberazione, mentre la fase lenta riflette Ca ^{2 +} legame alla gabbia nonphotolysed. La trama del PBD ampiezza campione per la fase veloce e lento scalato all'ampiezza del composto di riferimento in funzione del fattore dipendeva temperatura [C _p ρ.......

Discussione

Il principio fisico dietro metodi fototermiche è che una molecola fotoeccitati dissipa l'energia in eccesso tramite vibrazionale rilassamento allo stato fondamentale, con conseguente riscaldamento termico del ^1,12 solvente circostante. Per solventi come acqua, questo produce una rapida espansione del volume (ΔV _th). Molecole Eccitato statali possono anche subire processi fotochimici che si traducono in variazioni di volume non termici (ΔV _nonth) a causa di legame scissione / formazio.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-(4,5-dimetossi-2-nitrofenil)-1,2-diamminoetano-N,N,N',N' Acido -tetraacetico	Life Technologies	D-6814	DM-nitrofene, composto di calcio a gabbia, mantiene le soluzioni madre al buio per prevenire la fotodissociazione
Acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico, N-(2-idrossietil)piperazina-N′ -(acido 2-etansolfonico)	Tampone HEPES Sigma Adrich	0909C
Ferricianuro di potassio (III)	Sigma Aldrich	702587	per misure PBD
Cromato di sodio	Sigma Aldrich	307831	per misure PBD
Diodo laser He-Ne 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	utilizzabile come fascio di sonda per misure PBD
Oscilloscopio,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz banda con
laser Nd:YAG	Fascio pompa Continuum	ML II	per misure PBD
M355; Specchio laser Nd:YAG	Edmund Optics	47-324	per linee laser a 355 nm
M1 e M2; Specchio a diodi laser	Edmund Optics	43-532	visilbe laser a specchio piatto, gamma di lunghezze d'onda 300-700 nm
P1 e P2; Diaframma a iride	Edmund Optics	62-649	foro per modellare la sonda e i fasci di pum
L1; lente bi-convessa	Thorlabs	LB1844	una lente per focalizzare il fascio della sonda sul rivelatore, EFL 50 mm, gamma di lunghezze d'onda 350-2.000 nm
DM, specchio dicroico	Thorlabs	DMLP505	uno specchio dicroico passa-lungo con una lunghezza d'onda di taglio di 505 nm
F1; Filtro perimetrale	Andower	500FH90-25	un filtro passa lungo con una lunghezza d'onda di taglio di 500 nm
Porta cuvette a temperatura controllata	Quantum Northwest	FLASH 300

Composto di riferimento Composto di riferimento