Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Sommario

Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questo protocollo fornisce la procedura dettagliata su come utilizzare il sistema per una vasta gamma di applicazioni.

Abstract

Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questa tecnologia ha dimostrato il potenziale per affrontare applicazioni precedentemente impegnative, tra cui, la consegna alle cellule immunitarie primarie, riprogrammazione cellulare, nanotubi di carbonio, e la consegna quantum dot. Questa piattaforma microfluidica libero da vettori deduce rottura meccanica della membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico del materiale bersaglio. Qui, si descrive il metodo dettagliato di uso per questi dispositivi microfluidici compresi, montaggio del dispositivo, preparazione cellulare, e il funzionamento del sistema. Questo approccio consegna richiede una breve ottimizzazione di tipo di dispositivo e le condizioni operative per le applicazioni precedentemente rimanere sconosciuti. Le istruzioni fornite sono generalizzabili alla maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna in quanto questo sistema non richiede buffer specializzati o passi modificazione chimica / coniugazione. Questo lavoro fornisce anches raccomandazioni su come migliorare le prestazioni del dispositivo e problemi-shoot potenziali problematiche relative a intasamento, l'efficienza di consegna bassi, e la vitalità cellulare.

Introduzione

Consegna delle macromolecole nel citoplasma delle cellule è un passo fondamentale in applicazioni terapeutiche e di ricerca. Nanoparticelle mediata consegna, per esempio, ha dimostrato una potenziale nella terapia genica ^1,2, mentre la consegna proteina è un mezzo promettente di influenzare la funzione cellulare sia clinico ³ e ⁴ impostazioni di laboratorio. Altri materiali, come ad esempio farmaci a piccole molecole, i punti quantici, o nanoparticelle d'oro, sono di interesse in applicazioni che vanno dal cancro terapeutica ^5,6 all'etichettatura intracellulare ^7,8 e singola molecola di monitoraggio ^9.

La membrana cellulare è sostanzialmente impermeabile alle macromolecole. Molte tecniche esistenti utilizzano nanoparticelle polimeriche ^10,11, liposomi ¹² o modificazioni chimiche ¹³ per facilitare rottura della membrana o la consegna intracellulare. In questi metodi, la vitalità efficienza consegna e cellulari sono spesso dipendente dalla struttura del secoloe molecola target e il tipo di cella. Questi metodi possono essere efficaci nella fornitura di materiali di struttura uniforme, come acidi nucleici, ma spesso sono poco adatti per la consegna dei materiali più strutturalmente diverse, come le proteine ^​​14,15 e nanomateriali ^7. Inoltre, il meccanismo di interruzione endosome che la maggior parte di questi metodi si basano su è spesso inefficiente, lasciando quindi molto materiale intrappolato in strutture vescicole ^16. Infine, i metodi che sono spesso sviluppati per essere utilizzati con linee cellulari stabilizzate non si traducono bene alle cellule primarie.

Metodi di membrana all'incorporazione, come elettroporazione ^17,18 e sonoporazione ^19, sono una valida alternativa in alcune applicazioni, tuttavia, sono noti per causare la vitalità cellulare bassi e possono essere limitate dal responsabile del materiale consegna bersaglio.

Rapida deformazione meccanica delle cellule, un approccio microfluidica alla consegna, ha recentemente demonstrated suoi vantaggi rispetto alle tecniche attuali nel contesto di riprogrammazione cellulare ²⁰ e consegna nanomaterial ^21. Questo metodo si basa sulla distruzione meccanica o la membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico dei materiali presenti nel buffer circostante. Il sistema ha dimostrato che consenta potenziale in precedenza sfidare tipi di cellule (ad esempio cellule immunitarie primarie e cellule staminali) e materiali (ad esempio anticorpi e nanotubi di carbonio). Qui, la procedura generale di utilizzare questi dispositivi per la consegna intracellulare di macromolecole bersaglio è descritto. La procedura è generalizzabile a maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna, tuttavia, è consigliabile una condurre una breve ottimizzazione delle condizioni, come descritto nelle nostre linee guida progettuali precedentemente segnalati ^20, per tutte le applicazioni precedentemente non. Ad oggi, il sistema è stato usato con successo per la consegna di RNA, DNA, nanoparticelle di oro, punti quantici, i nanotubi di carbonio, proteines, e polimeri destrano ^20,21.

Protocollo

1. Conservazione

1. Conservare i serbatoi, i titolari, O-ring e dispositivi microfluidici in etanolo al 70%. Utilizzare un contenitore (ad esempio vaso o bicchiere) che ha un coperchio per evitare l'evaporazione e la contaminazione da particelle di polvere o all'esterno. Posizionare i dispositivi in ​​un contenitore (1), serbatoi e O-ring in un secondo contenitore (2), e titolari nel terzo (3).

Nota: L'uso di etanolo al 70% per il rimessaggio è di mantenere la sterilità. Se gli unici componenti della soluzione sono etanolo e acqua (cioè senza denaturanti), tutti i componenti di sistema dovrebbe essere pienamente compatibile e non si degrada nel tempo.

2. Cambiare soluzione etanolica in contenitori (2) e (3) prima di ogni uso per evitare la contaminazione incrociata di tutti gli esperimenti e minimizzare la presenza di particelle indesiderate che possono causare l'intasamento.

2. Esperimento Preparazione

1. Contenitori Consiglio (2) e (3) in un bagno ad ultrasuoni for 5-10 minuti prima di ogni utilizzo. Questo aiuta a rimuovere eventuali particelle contaminanti da esperimenti precedenti.
2. Pulire lavoro in armadio biosicurezza con una soluzione di etanolo al 70%.
3. Spruzzare tutti i materiali (3 contenitori e pinzette) con una soluzione di etanolo al 70% prima di collocarli all'interno dell'armadio biosicurezza.

3. Montaggio

1. Deporre 2-3 salviette low-lint nell'area di lavoro.
2. Rimuovere i serbatoi di plastica dal loro contenitore con le pinzette e metterli sulle salviettine per favorire l'evaporazione della soluzione di etanolo da superfici interne. Battere delicatamente i serbatoi in superficie o soffiare aria attraverso di loro per facilitare la rimozione della soluzione di etanolo.
3. Inserire gli O-ring nel loro alloggiamento del serbatoi.
4. Rimuovere il supporto e patatine da rispettivi contenitori e lasciare evaporare l'etanolo (~ 1-2 min).
5. Utilizzare le pinzette per posizionare il chip faccia-up desiderato (ad esempio fori di accesso su) nel supporto. Sollevare il titolarecon il chip di visione orizzontale per assicurarsi che il chip sia posizionato orizzontalmente nel supporto e regolare, se necessario, con le pinzette. IMPORTANTE: Se il dispositivo non si inserisce correttamente nel suo supporto, c'è il rischio che si romperà durante le fasi successive.
6. Quindi, posizionare delicatamente i serbatoi sul supporto e allinearle con le clip. Fare attenzione che O-ring non cadono fuori dai loro alloggiamenti durante questo processo.
7. Premere delicatamente verso il basso i serbatoi finché non scattano in posizione. Assicurarsi che entrambi i lati dei serbatoi siano sicure e che il chip sembra essere nella posizione corretta.

4. Preparazione cellulare

1. Per cellule aderenti (linee primarie o creare): cellule piastra 1-2 giorni prima dell'esperimento tale che essi non sono confluenti più del 80% il giorno dell'esperimento.
2. Posizionare cellule in sospensione (in PBS o supporto rilevante) e puntare ad una concentrazione operativa di 1,0 x 10 ⁶ cellule / ml a 1,0 x 10 ⁷ cells / ml. NOTA: Non abbiamo osservato cambiamenti significativi nelle prestazioni di consegna a causa di concentrazione cellulare.
3. Mescolare cellule e la consegna materiale desiderato in un tubo separato per ottenere la concentrazione desiderata materiale per l'esperimento. IMPORTANTE: Poiché il metodo di consegna descritto si basa sulla diffusione per facilitare la consegna, una concentrazione di materiale superiore produrrà consegna superiore. Se possibile, si raccomanda di utilizzare una soluzione 1 mM del materiale desiderato per prove iniziali. Questa concentrazione può essere titolato al esperimenti futuri come necessario. La concentrazione più bassa segnalato utilizzato con questo dispositivo è 10 nM ^21.

5. Funzionamento

1. Pipettare miscela di cellule e la consegna materiale in un serbatoio (disegno corrente ha un max 150 microlitri). NOTA: La maggior parte dei disegni di periferica sono completamente reversibili, pertanto la direzione del flusso attraverso i canali non importa. I campioni possono essere caricati in uno dei due serbatoi.
2. Collegare il tubo di pressione al serbatoio riempito e serrare il dado per garantire la corretta tenuta (dito stretto è spesso sufficiente).
3. Regolare la pressione al livello desiderato sul regolatore. Questo controlla la velocità con cui le cellule attraverso il dispositivo. Si noti che il flusso delle cellule non inizia fino a quando si preme il pulsante.

NOTA: Nel lavoro precedente, azoto o aria compressa hanno lavorato altrettanto bene come gas di trasporto.

4. Sollevare dispositivo all'altezza degli occhi e orientarlo in modo che il liquido nel serbatoio è facilmente visibile. NOTA: Traccia colonna di liquido per spegnere il sistema prima che il serbatoio si svuota.
5. Premere il pulsante per pressurizzare il serbatoio e iniziare il flusso delle cellule.
6. Quando il livello del liquido è circa 2 mm dal fondo del serbatoio, girare rapidamente il regolatore a 0 psi per arrestare il flusso. IMPORTANTE: Se uno non riesce a fermare il flusso prima che il serbatoio si svuota, si rischia l'espulsione del campione dal collection serbatoio. Si noti inoltre che se la colonna di fluido non si muove ad un ritmo apprezzabile, o ha rallentato notevolmente rispetto alla sua portata iniziale (ad esempio 3x lento), il dispositivo montato è probabilmente sporco e deve essere sostituito. La gestione di un dispositivo intasato può portare alla morte delle cellule superiore.
7. Raccogliere le cellule trattate dal serbatoio appropriato e metterli nel tubo di raccolta / piastra desideri. IMPORTANTE: Non diluire le cellule raccolte in tutti i buffer in questa fase, le cellule porati continueranno ad assorbimento di materiale per un massimo di 10 min ^20. Dopo questa finestra è passato, diluire le cellule nel desiderato media / buffer.
8. Per raccogliere le cellule trattate più o provare condizioni sperimentali alternativi, ripetere i passaggi 5,1-5,7 come necessario. Ricordiamo che i chip sono reversibili, quindi i campioni possono essere montati in uno dei serbatoi. Assicurati di scambiare i chip come necessario se si intasano. Eliminare i dispositivi ostruiti.

6. Smontaggio

1. Staccare delicatamente i serbatoi del titolare principale, mettendo da parte le armi della clip.
2. Collocare ogni parte nel contenitore di archiviazione appropriato (descritto nel paragrafo 1).
3. Posizionare chip utilizzati in un contenitore separato per lo smaltimento.

Risultati

Figura 1 contiene uno schema descrittivo del sistema di erogazione microfluidica. Figure 2a-b illustrano i risultati tipici della trattando le cellule HeLa con disegni diversi dispositivi in presenza di coniugato fluorescente 3 kDa destrano ^20. Se la procedura viene seguita correttamente, le prestazioni del sistema sarà sensibile al tipo di dispositivo e velocità operativa. Pertanto, si dovrebbe ottimizzare queste condizioni per una data applicazione prima di procedere a espe...

Discussione

Taluni aspetti della procedura sperimentale descritta (cioè fattori diversi progettazione di chip e velocità operativa) possono avere bisogno di essere ottimizzato a seconda del tipo di cellula e materiale consegna il sistema viene applicato. La discussione che segue indirizzi alcuni dei fattori più comuni da considerare quando si progetta esperimenti.

Per migliorare il segnale di consegna per i composti fluorescente, si ha la necessità di affrontare le fonti di fluorescenza di fond...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supporto del dispositivo & Serbatoio in plastica	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A Macchina	citometria a flusso utilizzata presso il Koch Institute Core Facilities
Dispositivo microfluidico	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Ring	McMaster	9452K311
Sistema di pressione per azionare il dispositivo	SQZ Biotechnologies	Pinzetta a pressione
Bagno
			ad ultrasuoni