Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questo protocollo fornisce la procedura dettagliata su come utilizzare il sistema per una vasta gamma di applicazioni.
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Articolo metodologico
Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform
In questo articolo
Sommario
Abstract
Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questa tecnologia ha dimostrato il potenziale per affrontare applicazioni precedentemente impegnative, tra cui, la consegna alle cellule immunitarie primarie, riprogrammazione cellulare, nanotubi di carbonio, e la consegna quantum dot. Questa piattaforma microfluidica libero da vettori deduce rottura meccanica della membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico del materiale bersaglio. Qui, si descrive il metodo dettagliato di uso per questi dispositivi microfluidici compresi, montaggio del dispositivo, preparazione cellulare, e il funzionamento del sistema. Questo approccio consegna richiede una breve ottimizzazione di tipo di dispositivo e le condizioni operative per le applicazioni precedentemente rimanere sconosciuti. Le istruzioni fornite sono generalizzabili alla maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna in quanto questo sistema non richiede buffer specializzati o passi modificazione chimica / coniugazione. Questo lavoro fornisce anches raccomandazioni su come migliorare le prestazioni del dispositivo e problemi-shoot potenziali problematiche relative a intasamento, l'efficienza di consegna bassi, e la vitalità cellulare.
Introduzione
Consegna delle macromolecole nel citoplasma delle cellule è un passo fondamentale in applicazioni terapeutiche e di ricerca. Nanoparticelle mediata consegna, per esempio, ha dimostrato una potenziale nella terapia genica 1,2, mentre la consegna proteina è un mezzo promettente di influenzare la funzione cellulare sia clinico 3 e 4 impostazioni di laboratorio. Altri materiali, come ad esempio farmaci a piccole molecole, i punti quantici, o nanoparticelle d'oro, sono di interesse in applicazioni che vanno dal cancro terapeutica 5,6 all'etichettatura intracellulare 7,8 e singola molecola di monitoraggio ....
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Protocollo
1. Conservazione
- Conservare i serbatoi, i titolari, O-ring e dispositivi microfluidici in etanolo al 70%. Utilizzare un contenitore (ad esempio vaso o bicchiere) che ha un coperchio per evitare l'evaporazione e la contaminazione da particelle di polvere o all'esterno. Posizionare i dispositivi in un contenitore (1), serbatoi e O-ring in un secondo contenitore (2), e titolari nel terzo (3).
Nota: L'uso di etanolo al 70% per il rimessaggio è di mantenere la sterilità. Se gli unici componenti della soluzione sono etanolo e acqua (cioè senza denaturanti), tutti i componenti di sistema dovrebbe ....
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Risultati
Figura 1 contiene uno schema descrittivo del sistema di erogazione microfluidica. Figure 2a-b illustrano i risultati tipici della trattando le cellule HeLa con disegni diversi dispositivi in presenza di coniugato fluorescente 3 kDa destrano 20. Se la procedura viene seguita correttamente, le prestazioni del sistema sarà sensibile al tipo di dispositivo e velocità operativa. Pertanto, si dovrebbe ottimizzare queste condizioni per una data applicazione prima di procedere a espe.......
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Discussione
Taluni aspetti della procedura sperimentale descritta (cioè fattori diversi progettazione di chip e velocità operativa) possono avere bisogno di essere ottimizzato a seconda del tipo di cellula e materiale consegna il sistema viene applicato. La discussione che segue indirizzi alcuni dei fattori più comuni da considerare quando si progetta esperimenti.
Per migliorare il segnale di consegna per i composti fluorescente, si ha la necessità di affrontare le fonti di fluorescenza di fond.......
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Dichiarazioni
Gli autori Armon Azionei, Robert Langer, e Klavs F. Jensen sono azionisti di SQZ Biotecnologie Società che produce i dispositivi microfluidici utilizzati in questo articolo.
Ringraziamenti
Ringraziamo T. Shatova per l'utile discussione sul design sperimentale e analisi dei dati. L'assistenza e la competenza di G. Paradis, il personale della citometria a flusso principale presso l'Istituto Koch, e il personale della Microsystems Technology Laboratory presso il Massachusetts Institute of Technology sono riconosciuti con gratitudine. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, e in parte dal National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) concede P30-CA14051 e MPP-09Call-Langer-60.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Supporto del dispositivo & Serbatoio in plastica | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A Macchina | citometria a flusso utilizzata presso il Koch Institute Core Facilities |
| Dispositivo microfluidico | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Ring | McMaster | 9452K311 | |
| Sistema di pressione per azionare il dispositivo | SQZ Biotechnologies | Pinzetta a pressione | |
| Bagno | |||
| ad ultrasuoni |
Riferimenti
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-....
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Ristampe e permessi
