Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l'effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.
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Articolo metodologico
Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura
In questo articolo
Sommario
Abstract
I lipidi e proteine in cellule eucariotiche sono continuamente scambiati tra compartimenti cellulari, anche se questi mantengono la loro composizione distintivo e funzioni nonostante il traffico intenso interorganelle molecolare. Le tecniche descritte in questo documento sono potenti mezzi di studiare proteine e lipidi mobilità e il traffico in vivo e nel loro ambiente fisiologico. Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) sono ampiamente utilizzati tecniche di live-cell imaging per studiare traffico intracellulare attraverso la via eso-endocitosi, la continuità tra organelli o sottocompartimenti, la formazione di complessi proteici, proteine e localizzazione in microdomini lipidici, ognuno dei quali può essere osservato in condizioni fisiologiche e patologiche. I limiti di questi approcci sono principalmente dovute all'uso di proteine di fusione fluorescenti, e loro potenziali svantaggi includono artefatta over-esprimonoione nelle cellule e la possibilità di differenze nella piegatura e localizzazione delle proteine marcate e native. Infine, come il limite di risoluzione della microscopia ottica (200 nm) non consente di indagine della struttura fine del ER o le sottocompartimenti specifici che possono provenire cellule sotto stress (cioè ipossia, la somministrazione del farmaco, l'espressione eccessiva di transmembrana proteine ER residenti) o in condizioni patologiche, uniamo live-cell imaging di cellule trasfettate coltivate con ultrastrutturali analisi sulla base di microscopia elettronica a trasmissione.
Introduzione
La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti spettrali, e lo sviluppo parallelo di microscopia a fluorescenza, hanno aperto completamente nuove strade per lo studio del comportamento delle proteine nelle cellule. Tecniche come recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP), che sono possibili per la capacità intrinseca di fluorofori per estinguere la loro fluorescenza sotto illuminazione intensa, si basano su confocale live-cell imaging e l'uso di trasfettati proteine di fusione fluorescenti 1-3. Essi sono ampiamente utilizzati per valutare non solo la localizzazione d....
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Protocollo
1. Plasmide, coltura cellulare, e Transfezione con ER proteine fluorescenti
- Il plasmide utilizzato in questo studio consiste di una versione migliorata del GFP fusa al suo C-terminale della regione di coda della isoforma di ER ratto citocromo b (5) (abbreviato qui come b (5)) tramite una sequenza linker. La regione coda contiene l'intera sequenza (Pro94-Asp134) che rimane membrana associato dopo la scissione di tripsina nativo b (5), compreso il TMD 17 residui (dominio transmembrana), fiancheggiata da sequenze polari a monte ea valle (UPS e DPS) . Il linker consiste nella epitopo myc seguito da [(Gly) 4 Ser] 3, e l'intero cD....
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Risultati
La Figura 2 mostra un esempio di studio FRAP mobilità proteina. La mobilità dei d proteina EGFP-ER è dimostrata dal rapido recupero di fluorescenza dopo photobleaching in OSERs sbiancato. Per l'analisi quantitativa, il primo tempo e la frazione cellulare risultano dai dati misurati sperimentalmente inserendo la seguente equazione monoesponenziale:
F (t) = F postale + (F rec-F post) (1-e-t / τ)
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Discussione
I protocolli e approcci di imaging descritti in questo documento sono stati utilizzati per studiare la distribuzione e la mobilità delle proteine fluorescenti TA trasfettate residenti nel ER di cellule viventi. Abbiamo anche analizzato l'effetto dell'espressione eccessiva di queste proteine sull'architettura di questo compartimento subcellulare mediante analisi ultrastrutturali.
La combinazione di live-cell imaging confocale e microscopia elettronica rappresenta è un potente .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati alla Fondazione Filarete per il suo aiuto e il sostegno nella pubblicazione di questo articolo. Vorremmo anche ringraziare Centro Europeo di Nanomedicina per l'uso del microscopio elettronico a trasmissione Tecnai G2.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM) senza rosso fenolo | Invitrogen | 31053028 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Soluzione di L-Glutammina 200 mM | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor OxyRase | Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldeide Grado I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Cacodilato di sodio Triidrato | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Tetrossido di osmio 4% soluzione | Microscopia elettronica Scienza | 19150 | |
| Acetato di uranile diidrato | Sigma Aldrich | 73943 | |
| Ossido di propilene | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| Kit di terreno di inclusione EPON | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Microscopia elettronica | citrato di piombo | 17800 | |
| Centrifuga da banco | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscopio confocale spettrale | Leica Microsystems TCS | SP5 | |
| CO2 Sistema di incubazione a gabbia per microscopio | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Coltello diamantato | Diatome | Ultra 45 gradi | |
| Microscopio elettronico a trasmissione | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software GraphPad | Software, Inc | ||
| Camera cellulare di coltura in acciaio per vetrino coprioggetti da 24 mm | Strumenti | Bioscience CSC-25 | |
| Griglie per microscopia elettronica Microscopia | elettronica Science | G300Cu |
Riferimenti
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum....
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Ristampe e permessi
