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Articolo metodologico

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

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DOI:

10.3791/50985

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18 febbraio 2014

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

In questo articolo

Sommario

Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l'effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.

Abstract

I lipidi e proteine ​​in cellule eucariotiche sono continuamente scambiati tra compartimenti cellulari, anche se questi mantengono la loro composizione distintivo e funzioni nonostante il traffico intenso interorganelle molecolare. Le tecniche descritte in questo documento sono potenti mezzi di studiare proteine ​​e lipidi mobilità e il traffico in vivo e nel loro ambiente fisiologico. Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) sono ampiamente utilizzati tecniche di live-cell imaging per studiare traffico intracellulare attraverso la via eso-endocitosi, la continuità tra organelli o sottocompartimenti, la formazione di complessi proteici, proteine ​​e localizzazione in microdomini lipidici, ognuno dei quali può essere osservato in condizioni fisiologiche e patologiche. I limiti di questi approcci sono principalmente dovute all'uso di proteine ​​di fusione fluorescenti, e loro potenziali svantaggi includono artefatta over-esprimonoione nelle cellule e la possibilità di differenze nella piegatura e localizzazione delle proteine ​​marcate e native. Infine, come il limite di risoluzione della microscopia ottica (200 nm) non consente di indagine della struttura fine del ER o le sottocompartimenti specifici che possono provenire cellule sotto stress (cioè ipossia, la somministrazione del farmaco, l'espressione eccessiva di transmembrana proteine ​​ER residenti) o in condizioni patologiche, uniamo live-cell imaging di cellule trasfettate coltivate con ultrastrutturali analisi sulla base di microscopia elettronica a trasmissione.

Introduzione

La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti spettrali, e lo sviluppo parallelo di microscopia a fluorescenza, hanno aperto completamente nuove strade per lo studio del comportamento delle proteine ​​nelle cellule. Tecniche come recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP), che sono possibili per la capacità intrinseca di fluorofori per estinguere la loro fluorescenza sotto illuminazione intensa, si basano su confocale live-cell imaging e l'uso di trasfettati proteine ​​di fusione fluorescenti 1-3. Essi sono ampiamente utilizzati per valutare non solo la localizzazione delle proteine, ma anche la loro mobilità e del trasporto vescicolare, che può rivelare indizi importanti riguardanti la loro funzione 4.

La caratteristica unica di cellule eucariotiche è la presenza di compartimenti intracellulari con specifici composizioni lipidiche e proteiche. Anche se organelli sono fisicamente isolatEd, hanno bisogno di comunicare tra loro e condividere componenti molecolari al fine di mantenere l'omeostasi cellulare. La via secretoria garantisce che le proteine ​​e lipidi sintetizzati in ER raggiungere la destinazione finale corretto in cui esercitano la loro funzione. Organelli intracellulari possono anche essere collegati da siti di contatto dinamici che permettono molecole (lipidi) da scambiare direttamente tra compartimenti. Inoltre, molte proteine ​​devono assemblati in grandi complessi eteromerici o associati a determinate specie di lipidi (zattere lipidiche / microdomini) per diventare funzionalmente attivo o ad essere trasportati alla loro destinazione finale. Tutti questi aspetti biologici influenzare fortemente le proprietà cinetiche di proteine, e possono quindi essere opportunamente studiato mediante tecniche di seguito descritte.

Il nostro gruppo ha ampiamente utilizzato FRAP e FLIP combinato con microscopia elettronica per studiare l'architettura del ER e la sua diversa subdomini. La ER è la prima stazione della via secretoria e svolge un ruolo chiave nel proteine ​​e lipidi ordinamento 5. Si tratta di un organello altamente dinamica la cui sottodomini distinti riflettere le sue diverse funzioni (ad esempio proteine ​​e lipidi biosintesi e il traffico, proteine ​​pieghevoli, Ca 2 + stoccaggio e il rilascio, e il metabolismo xenobiotici). Tuttavia, anche se sono morfologicamente, spazialmente e funzionalmente distinte, questi domini sono continue tra loro, e la loro numerosità possono essere cambiate in cellule in condizioni fisiologiche e patologiche. Il più conosciuto e domini di solito spazialmente separate della ER sono la membrana nucleare, e la ER liscio e ruvido, tuttavia, noi ed altri abbiamo dimostrato che non ci sono strutture ER con un'architettura più elaborata e l'organizzazione tridimensionale in vari tipi di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche che può anche essere indotta mediante stimoli stressanti quali ipossia, farmacoamministrazione, o l'over-espressione di ER-residente proteine ​​transmembrana 2,6 (e riferimenti).

Abbiamo recentemente dimostrato la presenza di tali strutture in modelli cellulari di malattie umane 1,7. Provenienti dalla cisterne pila di ER liscio, sono stati dati il nome collettivo di reticolo endoplasmatico liscio organizzata (OSER) nel 2003 6, anche se sono noti anche come karmellae, lamelle, e cristalloide ER sulla base della loro architettura che, come loro dimensione, può variare. Dopo che le cellule sono trasfettate con GFP fusa alla regione citosolica di coda ancorata (TA) proteine ​​ER-residente (d EGFP-ER), la tendenza debolmente dimerizing di GFP in trans altera drasticamente l'organizzazione e la struttura del ER. FRAP e FLIP esperimenti hanno mostrato che d EGFP-ER è libero di diffondere all'interno OSERs, e il fatto che si muove dal ER reticolare alla OSER e viceversa </ Em> indica che gli aggregati sono continui con il reticolare circostante ER. Analisi ultrastrutturale ha permesso di correlare i dati di fluorescenza con una descrizione dettagliata di architettura OSER e di organizzazione a livello di nanoscala: OSERs sono sempre costituito da pile di cisterne abbinato di ER liscia, ma possono avere diverse forme di organizzazione spaziale, come regolarmente organizzato sinusoidale matrici o spirali, o esagonali "cristalloidi" matrici tubolari. Questi riarrangiamenti portano a morfologie cubi 8 che, così come sono stati trovati in cellule in condizioni fisiologiche 9 e seguenti sollecitazioni quali ipossia 10, il trattamento farmacologico 11, e cancro 9, possono avere un potenziale significativo come marcatori ultrastrutturali.

Dopo questa prima dimostrazione utilizzando proteine ​​di fusione GFP, abbiamo usato esperimenti di imaging per analizzare la proliferazione di domini ER in risposta a trattamenti farmacologici 12, assess la tendenza delle proteine ​​fluorescenti a oligomerise in celle 13, e per studiare il ruolo di un mutante proteina TA ALS-linked nella formazione di aggregati intracellulari di origine ER che possono essere rilevanti per la sua 1,8 patogenicità. È stato suggerito che la formazione di aggregati intracellulari (che si verifica in molte malattie neurodegenerative 14) può essere un meccanismo protettivo progettato per prevenire le interazioni tra proteine ​​mutanti tossiche e le componenti cellulari circostanti 15.

Quello che segue è una descrizione di una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica per lo studio costrutti cui C-terminale domini idrofobici sono inseriti nella membrana del ER, e l'analisi del loro comportamento dinamico e gli effetti della loro iper-espressione di dominio ER architettura in cellule in coltura (vedere la Figura 1 per un diagramma di flusso del protocollo sperimentale).

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Protocollo

1. Plasmide, coltura cellulare, e Transfezione con ER proteine ​​fluorescenti

  1. Il plasmide utilizzato in questo studio consiste di una versione migliorata del GFP fusa al suo C-terminale della regione di coda della isoforma di ER ratto citocromo b (5) (abbreviato qui come b (5)) tramite una sequenza linker. La regione coda contiene l'intera sequenza (Pro94-Asp134) che rimane membrana associato dopo la scissione di tripsina nativo b (5), compreso il TMD 17 residui (dominio transmembrana), fiancheggiata da sequenze polari a monte ea valle (UPS e DPS) . Il linker consiste nella epitopo myc seguito da [(Gly) 4 Ser] 3, e l'intero cDNA viene inserito nei siti Hind3-Xba1 del vettore di espressione di mammifero pCDNA3. I dettagli della costruzione di questo plasmide sono stati descritti in una precedente pubblicazione in cui è indicato come GFP-ER 16.
  2. Grow COS-7 cellule di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% fetasiero bovino l, 2 mM L-glutammina, 1% di penicillina / streptomicina in un incubatore a 37 ° C e 10% di CO 2.
  3. Trasfezione. Piastra 3 x 10 5 cellule su un vetrino di vetro rotondo in una piastra da 6 pozzetti e, il giorno seguente, trasfezione con il sistema JetPEI come descritto dal produttore. Si noti che il rapporto ottimale JetPEI / DNA è stato testato per stabilire la massima efficienza di trasfezione seconda del plasmide e linea cellulare utilizzata: nel nostro caso, un JetPEI: DNA rapporto di 2:1 conduce al 70-80% efficienza di trasfezione.

2. Diretta a fluorescenza Microscopia confocale a scansione

  1. Live-cell imaging. Mettere il vetrino in cui le cellule transfettate sono state seminate in una camera di coltura cellulare in acciaio per 24 millimetri coprioggetto riempiti con DMEM w / o rosso fenolo, supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1% pen / strep, 25 HEPES mM , 50 pg / ml cicloeximide e 1:100 OxyFluor per prevenire i campioni da photobleaching. Un microscop SP5 confocalee dotato di CO 2 incubatore a temperatura controllata (37 ° C e 5% CO 2) è utilizzato per esperimenti di imaging cellulare dal vivo, con d GFP-ER essere visualizzata utilizzando un laser 488 nm ed un filtro 525/50 emissione passa banda.
  2. Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP). Prelievo di una regione di interesse (ROI), corrispondente ad una struttura OSER, e decolorazione con 20 iterazioni e una combinazione di 488 nm (100% di un laser 30 mW Argon, corrispondente a 5,5-6 μW al campione) e 405 nm (60% di 30 mW diodo laser 405, corrispondente a 11,6 μW al campione) laser che, nella nostra esperienza, porta a fotoscolorimento efficiente e rapido.
  3. Registrare il recupero della fluorescenza nei ROI sbiancate prendendo un singolo fotogramma ogni 10 secondi per 10 minuti (tempo di pixel = 1.61 msec / px).
  4. Perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP). Disegnare un ROI corrispondente ad una struttura OSER, e candeggina come descritto sopra. Lo sbiancamento si ripete ogni 30 sec,e le immagini post-sbiancanti vengono registrati ogni 10 secondi per 30 minuti (tempo di pixel = 1.61 msec / px).
  5. FRAP e FLIP analisi. Tutte le immagini sono analizzate utilizzando il software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). Negli esperimenti FRAP, il recupero di fluorescenza della ROI sbiancato è misurata nel tempo e normalizzati alla fluorescenza totale di cellule sbiancato, che è sempre verificata sia costante nel tempo.
  6. Per gli esperimenti FLIP, disegnare un ROI al di fuori della OSER sbiancato e che coprono tutta la cella. Misurare l'intensità di fluorescenza nel tempo e normalizzare i livelli di fluorescenza di una ROI tratti su una cella greggi per correggere in caso di riduzione della fluorescenza causata dalla rappresentazione stessa.
  7. In tutti gli esperimenti, sottratto il segnale di fondo (determinato in una zona diversa da cellule) dalle intensità di fluorescenza delle ROI. Infine, tracciare i risultati utilizzando Grsoftware aphPad Prism.

3. Ultrastrutturali analisi mediante microscopia elettronica a trasmissione

Data la tossicità di molti dei reagenti, tutte le procedure devono essere effettuate indossando un laboratorio appropriato. cappotto e guanti sotto una cappa aspirante.

  1. Dopo aver rimosso il vetrino dalla piastra di Petri, fissare le restanti cellule cresciute sul fondo del piatto come un monostrato utilizzando filtrata 2% glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato, pH 7,4, per 10 min a temperatura ambiente.
  2. Raschiare le cellule utilizzando un raschietto Teflon e trasferirli in provette da 1,5 ml Eppendorf. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 9000 g per 10 min. Rimuovere il surnatante, aggiungere fissativo fresco, e lasciare per una notte a 4 ° C.
  3. Lavare il pellet con il tampone, poi post-fissare con una soluzione di 1% tetrossido di osmio in tampone cacodilato per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Risciacquare con acqua MilliQ, e bagno macchia blocco con1% acetato di uranile in acqua distillata per tra 20-60 min.
  5. Disidratare i campioni ascendente serie di etanolo (70%, 80%, 90%, 100% e 100% per 10 min ciascuno), e lavare rapidamente due volte in ossido di propilene (15 min ciascuna).
  6. Infiltrati i campioni in una miscela di ossido di propilene + Epon (1:1) (da 2 ore a tutta la notte).
  7. Incorpora in resina epossidica Epon indurito a 60 ° C per almeno 24 ore.
  8. Sezione blocchi resina tagliati manualmente utilizzando un ultramicrotomo LEICA UC6 dotato di una lama di diamante 45 ° per ottenere sezioni dello spessore di 60-70 nm. Raccogliere le sezioni su 300 griglie di rame maglia.
  9. Macchiare le sezioni sulla griglia di partenza con una soluzione satura di acetato di uranile (20 min) e citrato di piombo (7 min), lavare accuratamente le griglie immergendole in acqua filtrata bi-distillata e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
  10. Le griglie colorate vengono osservate con un microscopio elettronico a trasmissione Tecnai G2, e le immagini sono state acquisite utilizzando una bottcamera CCD om-montato in diversi ingrandimenti finali (in genere vanno da 6,000-39,000 X).

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Risultati

La Figura 2 mostra un esempio di studio FRAP mobilità proteina. La mobilità dei d proteina EGFP-ER è dimostrata dal rapido recupero di fluorescenza dopo photobleaching in OSERs sbiancato. Per l'analisi quantitativa, il primo tempo e la frazione cellulare risultano dai dati misurati sperimentalmente inserendo la seguente equazione monoesponenziale:

F (t) = F postale + (F rec-F post) (1-e-t / τ)

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Discussione

I protocolli e approcci di imaging descritti in questo documento sono stati utilizzati per studiare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti TA trasfettate residenti nel ER di cellule viventi. Abbiamo anche analizzato l'effetto dell'espressione eccessiva di queste proteine ​​sull'architettura di questo compartimento subcellulare mediante analisi ultrastrutturali.

La combinazione di live-cell imaging confocale e microscopia elettronica rappresenta è un potente ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati alla Fondazione Filarete per il suo aiuto e il sostegno nella pubblicazione di questo articolo. Vorremmo anche ringraziare Centro Europeo di Nanomedicina per l'uso del microscopio elettronico a trasmissione Tecnai G2.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM) senza rosso fenoloInvitrogen31053028
Siero bovino fetale (FBS)Invitrogen10270106
Pen/StrepInvitrogen15140-122
Soluzione di L-Glutammina 200 mMInvitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfectionPP10110
OxyFluor OxyRase Inc.OF-0005
Glutaraldeide Grado ISigma AldrichG5882
Cacodilato di sodio TriidratoSigma AldrichC0250
Tetrossido di osmio 4% soluzioneMicroscopia elettronica Scienza19150
Acetato di uranile diidratoSigma Aldrich73943
Ossido di propileneSigma-Aldrich82320
Kit di terreno di inclusione EPONSigma-Aldrich45359-1EA-F
Microscopia elettronicacitrato di piombo 17800
Centrifuga da bancoEppendorf5415 D
Microscopio confocale spettrale Leica Microsystems TCSSP5
CO2 Sistema di incubazione a gabbia per microscopio OkoLab
Ultramicrotome Leica MicrosystemsUC6
Coltello diamantato DiatomeUltra 45 gradi
Microscopio elettronico a trasmissione FEITecnai G2
GraphPad Prism Software GraphPadSoftware, Inc
Camera cellulare di coltura in acciaio per vetrino coprioggetti da 24 mmStrumentiBioscience CSC-25
Griglie per microscopia elettronica Microscopiaelettronica ScienceG300Cu
leggermente radioattivo al Scienza

Riferimenti

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