Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione In vitro

Sommario

Migrazione neuroblasti è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti impiegando DNA / piccolo tornante RNA (shRNA) nucleofection e un saggio di migrazione 3D con neuroblasti isolati dal flusso migratorio rostrale roditore postnatale.

Abstract

La zona subventricolare (SVZ) situata nella parete laterale dei ventricoli laterali gioca un ruolo fondamentale nella neurogenesi adulta. In questa zona ristretta del cervello, le cellule staminali neurali proliferano e costantemente generano neuroblasti che migrano tangenzialmente in catene lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) per raggiungere il bulbo olfattivo (OB). Una volta in OB, neuroblasti passare alla migrazione radiale e poi differenziarsi in neuroni maturi capaci di integrare nella rete neuronale preesistente. Migrazione corretta neuroblast è un passo fondamentale nella neurogenesi, garantendo la corretta maturazione funzionale dei neuroni neonati. Data la capacità di neuroblasti SVZ derivati ​​per indirizzare le aree lese del cervello, indagando i meccanismi intracellulari alla base della loro motilità non solo migliorare la comprensione della neurogenesi, ma può anche favorire lo sviluppo di strategie neurorigenerativo.

Questo manoscritto descrive una dettagliataprotocollo per la trasfezione di roditore primaria RMS neuroblasti postnatale e l'analisi della loro motilità con un 3D in vitro migrazione saggio di ricapitolare le loro modalità di migrazione osservato in vivo. Entrambi i ratti e topi neuroblasti possono essere rapidamente ed efficacemente trasfettate via nucleofection sia con DNA plasmidico, piccolo tornante (sh) RNA interferenti o corto (si) oligo RNA mira geni di interesse. Per analizzare la migrazione, le cellule nucleofected sono reaggregated in "gocce appesi" e successivamente incorporate in una matrice tridimensionale. Nucleofection di per sé non altera in modo significativo la migrazione dei neuroblasti. Il trattamento farmacologico dei neuroblasti nucleofected e reaggregated può essere eseguita anche per studiare il ruolo delle vie di segnalazione coinvolte nella migrazione neuroblasti.

Introduzione

Nel postnatale cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica per tutta la vita ed è limitato a due nicchie neurogenici: la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare del giro dentato dell'ippocampo ^1. Diversi studi recenti hanno dimostrato l'importante ruolo della neurogenesi adulta nel facilitare i compiti di apprendimento e memoria ^2,3. Inoltre, la prova di proliferazione e il reclutamento di progenitori neurali seguenti lesioni cerebrali ^4-7 solleva la possibilità di attivazione farmacologica della neurogenesi nella riparazione neurale.

Neurogenesi postnatale è strettamente regolamentato in tutte le sue fasi, che comprendono la proliferazione neurali progenitrici, la migrazione, la differenziazione, la sopravvivenza e l'integrazione sinaptica finale dei neuroni appena nati ^8. Progenitori neurali (neuroblasti) derivate da cellule staminali nel SVZ migrano a grande distanza attraverso la migratorio rostralestream (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB) dove maturano in neuroni funzionali ^9. Neuroblasti migratori sono prevalentemente unipolare, con un corpo cellulare allungato estende un unico processo di primo piano. Queste cellule si muovono in catene in modo collettivo, scorrevoli l'uno sull'altro ^10. La migrazione è un passo fondamentale per la successiva maturazione dei progenitori SVZ-derivati ​​in neuroni funzionali ¹¹ ed è controllata da molteplici fattori e molecole di orientamento, tra cui: polysialylated neural molecola di adesione cellulare (PSA-NCAM) ^12, ephrins ^13, integrine ^14, Slits ^15, fattori di crescita e neurotrasmettitori ^{16 17,} tuttavia i meccanismi molecolari alla base di questo processo non sono pienamente compresi. Indagare le vie di segnalazione intracellulare che regolano la migrazione neuroblasti non solo fornirà una migliore comprensione della neurogenesi adulta, ma contribuirà anche allo sviluppo della nuova terapeuticaapprocci per promuovere la riparazione del cervello.

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti in vitro utilizzando nucleofection e un saggio di migrazione 3D. Nucleofection è una tecnica di trasfezione cellulare basato su un metodo migliorato di elettroporazione. Cell-tipo di corrente elettrica specifica e la soluzione nucleofection consentire il trasferimento di macromolecole polianionici come il DNA e shRNA vettori e oligonucleotidi siRNA direttamente nel nucleo della cellula e licenza di trasfezione lentamente divisione o mitoticamente cellule inattive, come i neuroni embrionali di mammifero e ^18. Questo metodo è veloce, relativamente facile da eseguire ei risultati in trasfezione altamente riproducibile di una vasta gamma di tipi di cellule inclusi neuroblasti primarie e neuroni ^19-21.

Dissociazione del tessuto RMS consente l'isolamento di neuroblasti migratori, che può essere nucleofected successo con DNA / SHRVettori NA o oligo siRNA targeting per geni di interesse. Dopo nucleofection, neuroblasti sono reaggregated in appeso gocce e successivamente incorporate in una matrice tridimensionale Matrigel. Queste condizioni consentono di neuroblasti migrano degli aggregati cellulari riassumono la modalità di migrazione osservato in vivo, fornendo così un ottimo sistema modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nella migrazione neuroblasti e di valutare l'influenza dei trattamenti farmacologici sulla motilità di queste cellule.

Protocollo

Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali.

1. Dissezione e dissociazione di Rat RMS neuroblasti

1. Preparare le soluzioni necessarie per RMS dissezione e la dissociazione:

Medio Dissection (100 ml)
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) - 98.5 ml
5 M HEPES pH 7,4-0,5 ml
Penicillina-streptomicina (10.000 unità / ml e 10.000 mg / ml) - 1 ml

Medio dissociazione (2 ml)
HBSS - 1.760 ml
10x tripsina (2,5%) - 200 ml
DNAse1 (1 mg / ml) - 40 microlitri

Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% Fetal Calf Serum (FCS) (40 ml)
DMEM -36 ml
FCS - 4 ml

Terreno completo (12 ml)

Medie Neurobasal - 11,46 ml
Supplemento B27 - 250 microlitri
L-glutammina (200 mm) - 125 microlitri
Glucosio (45%) - 165 microlitri

2. Filtro-sterilizzare l'% FCS DMEM + 10 e il mezzo completo e preequilibrate in un C / 5% CO ₂ incubatore 37 °.

1. Dissezione
   1. Sacrifica un ratto cucciolata P6-P7 (circa 12 cuccioli) per dislocazione cervicale e decapitare con le forbici.
   2. Fare un'incisione antero-posteriore in pelle lungo la sutura sagittale dal naso al cervelletto con una lama da bisturi. Sbucciare la pelle fuori e ripetere la stessa incisione lungo il cranio.
   3. Rimuovere delicatamente i lembi cranici con una pinza e rimuovere con attenzione il cervello con una spatola, avendo cura di includere i bulbi olfattivi.
   4. Tagliare il terzo più caudale del cervello e scartarla.
   5. Tritare the tessuto cerebrale in 1,4 millimetri di spessore fette coronali con un chopper tessuto.
   6. Mettere le fette in piatti contenenti medio dissezione a freddo e separare con cura utilizzando un ago.
   7. Il RMS appare come triangolare, zona traslucida nel centro di sezioni OB e come una piccola area circolare in più sezioni cerebrali caudale. Tagliare i RMS su ogni fetta con un coltello microchirurgico, avendo cura di evitare compreso il tessuto circostante. In P7 cuccioli di ratto, di solito i ~ 8 fette più rostrale (compresi OB) contengono RMS.
   8. Raccogliere i frammenti RMS con una pipetta Pasteur di plastica e metterli in un piccolo piatto contenente il mezzo di dissezione a freddo sul ghiaccio.
   9. Quando la dissezione è completa, trasferire i frammenti RMS in una provetta da 15 ml con una pipetta di plastica. Lasciare frammenti di stabilirsi sul fondo della provetta.
2. Dissociazione
   1. Sostituire il mezzo dissezione con 2 ml di terreno dissociazione.
   2. Triturare i frammenti RMS delicatamente pipetting la sospensione frammento su e giù circa 10x con una pipetta P1000.
   3. Lasciare il tubo con i frammenti di tessuto in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 min.
   4. Pipettare la soluzione nuovamente 10x e garantire che i frammenti si sono dissociati (la sospensione dovrebbe diventare torbida).
   5. Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS.
   6. Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min.
   7. Nel un'aliquota frattempo la quantità necessaria di siRNA / DNA in provette Eppendorf (di solito 3-5 mg DNA / shRNA o 5-9 mg oligo siRNA per nucleofection, tuttavia la quantità di DNA / siRNA può richiedere ottimizzazione).
   8. Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente in 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS.
   9. Eseguire un conteggio delle cellule. Aspettatevi ~ 1 x 10 ⁶ cellule per piccoli dei ratti cervello. Un minimo di 2,5 x 10 ⁶ cellule sono necessari per ogni nucleofection, mentrerisultati ottimali si ottengono con 3-4 x 10 ⁶ cellule per nucleofection.
   10. Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min. Assicurarsi di rimuovere quanto più mezzo possibile.

2. Nucleofection

1. Subito risospendere il pellet cellulare in ratto (o il mouse se usando cellule di topo) soluzione nucleofection neurone precedentemente incubate a temperatura ambiente. Utilizzare 100 ml per nucleofection. Nota: in genere una cucciolata di 12 cuccioli di ratto è sufficiente per eseguire 4 nucleofections e una cucciolata mouse (12 cuccioli) è sufficiente per eseguire 2 nucleofections.
2. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta Eppendorf contenente siRNA / DNA e mescolare delicatamente 2-3x pipettando con una pipetta P200.
3. Aggiungere il campione (sospensione cell-DNA/siRNA) al fondo della nucleofectioncuvette, avendo cura di evitare bolle.
4. Nucleofect utilizzando il programma G-013 (per le cellule di ratto) o O-005 (percellule di topo). Un nucleofection richiede circa 5 sec.
5. Aggiungere rapidamente 1 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS al campione nucleofected.
6. Ripetere i punti 2.4 e 2.5 per tutti gli altri campioni. Nota: per ottenere risultati ottimali, l'intera procedura nucleofection non dovrebbe durare più di 5 minuti.
7. Trasferire ciascun campione in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con la pipetta di plastica fornita dal kit nucleofection. Evitare il trasferimento delle eventuali detriti cellulari al tubo.
8. Centrifugare i campioni a 433 xg per 5 min.
9. Rimuovere con cautela tutta eccesso di terreno e risospendere il pellet in 25-30 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con una pipetta P20. Non usare più di 30 ml di mezzo.
10. Pipettare sospensione come una goccia sul lato interno di un coperchio piatto p35.
11. Invertire il coperchio sopra il piatto p35 contenente 2 ml di mezzo completo (vedi anche figura 1).
12. Lasciare in incubatrice (37 ° C / 5% di CO ₂₎ peralmeno 5 ore e fino a 7 ore. Tempo di incubazione più lungo consente una migliore riaggregazione di gruppi di cellule.
13. Trasferire le gocce che pendono dal coperchio in terreno completo nel piatto con una pipetta P1000 con una punta tagliata.
14. Incubare a 37 ° C / 5% di CO ₂ per 24 ore per nucleofections DNA e 48 ore per nucleofections siRNA / shRNA.

3. Incorporare

1. Preparare mezzo completo (25 ml) e preequilibrate è a 37 ° C / 5% di CO ₂ per alcune ore.
2. Estrarre le aliquote congelate di matrice membrana basale da -80 ° C freezer e scongelare sul ghiaccio in camera fredda.
3. Per ogni Nucleofection preparare un piatto di 6 centimetri che contiene fino a otto 13 millimetri coverlips sterili.
4. Porre le capsule in una scatola di ghiaccio coperto con pellicola trasparente. E 'importante mantenere i coprioggetti fresco per prevenire solidificazione matrice durante la procedura di incorporamento.
5. Per mantenere l'umidità, mettere una striscia di tessuto umido in un piatto di 15 centimetri che will essere utilizzato per contenere fino a tre piatti 6 centimetri contenenti i neuroblasti incorporati.
6. Aggiungere mezzo completo alla matrice scongelato in un rapporto 1:3. Ad esempio, miscelare 40 ml di terreno completo con 120 ml di matrice pipettando. Questa quantità di matrice è sufficiente per l'incorporamento aggregati su otto coprioggetto 12 mm.
7. Trasferire i gruppi di cellule reaggregated una provetta da 15 ml e centrifugare a 433 xg per 5 min.
8. Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet in 10 ml di terreno completo.
9. Mettere 2 ml di cellule di sospensione aggregato su ogni vetrino sterile e aggiungere 18 ml di matrice / medio impasto completo. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere la matrice su tutta vetrino.
10. Porre immediatamente la capsula di 6 cm contenente i coprioggetti nel piatto 15 centimetri e lasciare in incubatore (37 ° C / 5% di CO ₂₎ per 15-20 minuti. Quando la matrice è solidificato, aggiungere delicatamente 5 ml di terreno completo per ogni sei centimetri assunzione piatto cura di spingeregiù qualsiasi vetrino galleggiante con una punta della pipetta.
11. Incubare per 24 ore a 37 ° C / 5% di CO ₂ per far neuroblasti migrano degli aggregati cellulari.

4. 3D migrazione Assay

1. Preparare le soluzioni necessarie per immunoistochimica.
   1. Preparare la soluzione del blocco:
      Soluzione blocco Capra (50 ml)
      Soluzione tampone fosfato (PBS) - 5 ml
      Siero di capra - 7,5 ml
      10% Triton X-100 - 1,5 ml
      BSA - 50 mg
      H ₂ O - 36 ml
   2. Filtrare e conservare a 4 ° C.
   3. Preparare la soluzione di fissaggio:
      Soluzione di fissaggio (100 ml)
      Paraformaldeide (PFA) - 4 g ATTENZIONE: maneggiare sempre PFA sotto una cappa
      Saccarosio - 20 g (opzionale)
      PBS fino a 100 ml
   4. Su una piastra calda e sotto costante agitazione sciogliere il PFA in 80 ml di PBS mantenuta a 65 ° C.
   5. Una volta che il PFA è sciolta, aggiungere 20 g di saccarosio.
   6. Regolare il pH a7.4 (di solito con l'aggiunta di 60 microlitri ~ 1 M NaOH per 100 ml di soluzione).
   7. Portare a un volume totale di 100 ml con PBS.
2. Immunostaining
   1. Mettere coprioggetto in una piastra da 24 pozzetti.
   2. Risciacquare coprioggetto con PBS 2x.
   3. Fissare gli aggregati neuroblasti RMS con soluzione di fissaggio per 45 minuti a temperatura ambiente.
   4. Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio - su una piattaforma oscillante).
   5. Bloccare per 30-60 min con la soluzione del blocco di capra.
   6. Diluire gli anticorpi primari in soluzione blocco di capra e incubare una notte a 4 ° C. (Se lo si desidera, falloidina fluorescente (1:400) e colorante Hoechst (1:10.000) possono anche essere aggiunti alla soluzione di anticorpo primario per visualizzare actina filamentosa e nuclei).
   7. Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio).
   8. Diluire anticorpi secondari in soluzione blocco capra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
   9. Risciacquare coverslips con PBS 3x (5 min / lavaggio)
   10. Mount coprioggetto con mezzo di montaggio fluorescenti e lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente.
3. Analisi di migrazione
   1. Cattura immagini di aggregati fissi neuroblasti RMS con un microscopio a fluorescenza con obiettivo 10X. Include una barra di scala un'immagine campione in.
   2. Per impostare la scala per quantificare, misurare la barra della scala nell'immagine selezionando lo strumento 'Retta' nella barra degli strumenti ImageJ.
   3. Scegliere l'opzione 'Analizza' e cliccare su 'impostare la scala'.
   4. Nella finestra scala di impostare la 'distanza nota' e spuntare la casella 'globale' per mantenere le stesse impostazioni per tutte le misurazioni.
   5. Utilizzare lo strumento 'linea segmentata' sulla barra degli strumenti ImageJ per misurare la distanza dal bordo dell'aggregato al lontano neuroblast migrato in 6 diversi settori in tutto l'intero aggregato (Figura 3B). Considerare solo isolato aggregates per l'analisi.
   6. Calcolare una distanza media migrazione dai valori 6 ottenuti per ciascun aggregato.
   7. Misura 10-20 aggregati per ciascuna condizione in ogni esperimento e piscina indipendenti risultati da un minimo di tre esperimenti indipendenti. Sempre includere un controllo nucleofection (ad es. GFP o un sh controllo / siRNA).

Risultati

Neuroblasti possono essere isolati con successo da Dissected tessuto RMS (Figura 1A) e incorporati in una matrice tridimensionale. Le cellule isolate sia da ratto o RMS postnatali mouse sono immunopositive per i marcatori neuroblasti migratori, come doublecortin (DCX), βIII tubulina o PSA-NCAM (Figure 1B-C).

Neuroblasti dissociate possono essere efficacemente nucleofected con il DNA (ad es. Un plasmide GFP-codifica, Figura 2) o plasmidi shRNA (Figura 4) per ottenere la deplezione proteica, che può essere valutata mediante analisi western blot (Figura 4B) o immunofluorescenza (non mostrato) .

Le cellule nucleofected con plasmidi-GFP codifica migrano radialmente cluster neuroblasti reaggregated (Figura 3a). Quantificazione di relativa migrato a distanza 24 ore dopo l'incorporamento (Figura 3B) mostra alcuna differenza di migrazione tra GFP-posit ive cellule e cellule, nonnucleofected GFP-negativi (Figura 3C), indicando che nucleofection di per sé non interrompe la migrazione. Non vi è inoltre alcuna differenza significativa nel grado di migrazione tra neuroblasti nucleofected e neuroblasti migrano direttamente su espianti RMS (dati non riportati).

Figura 1. Dissezione dei neuroblasti RMS. (A) Rappresentazione schematica di RMS neuroblasti dissezione. Per una descrizione dettagliata si rimanda al testo. (B) isolate le cellule di RMS ratto sono immunopositive per i produttori di neuroblasti migratori DCX e tubulina βlll. Bar, 20 micron. (C) Le cellule che migrano su topo RMS espianti esprimono la neuroblast migratorio marcatori DCX e PSA-NCAM. Bar, 20 micron.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2. Neuroblasti nucleofection Mouse. Dissociata del mouse RMS neuroblasti sono stati nucleofected con PMAX-GFP, reaggregated, incorporati in una matrice tridimensionale e permesso di emigrare per 6 ore. Neuroblasti migrano da un cluster di cellule reaggregated (in alto, foto, contrasto di fase) mostrano un'elevata efficienza di trasfezione (basso, le foto del canale GFP). I pannelli della colonna di destra mostrano le immagini di ingrandimento più elevati corrispondenti alle inserti evidenziati nei pannelli della colonna di sinistra. Bar, 20 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 3. 3D test di migrazione. (A) neuroblasts ratto sono stati nucleofected con PMAX-GFP (GFP) o pCAG-IRES-EGFP ²² (EV), reaggregated, incorporato in una matrice e lasciato a migrare per 24 ore. Le cellule sono state poi fissate e immunoistochimica per GFP (verde) e βIII tubulina (rosso). Bar, 50 pm. (B) Misurare distanza migrazione utilizzando ImageJ. Il cluster di cellule reaggregated è suddiviso in 6 settori uguali. La distanza tra il bordo del cluster (linea tratteggiata) e la più lontana cella migrato viene misurata per ciascun settore. (C) Quantificazione della distanza relativa migrato dalle cellule nucleofected, cellule nonnucleofected (GFP-positive) e di controllo (GFP-negativi) . Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

"Figura 4" fo: content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" width = "500px" />
Figura 4. Monitoraggio migrazione neuroblasti dopo shRNA nucleofection. (A) neuroblasts ratto sono stati nucleofected con un shRNA vettore di controllo (PCA-b-EGFPm5 Silencer 3, che esprime anche EGFP ²³⁾ o lo stesso vettore contenente un shRNA mira fascin, an-actina bundling proteina ^24. Le cellule sono state reaggregated oltre 48 ore, incorporati nella matrice e lasciato a migrare per 24 ore. Aggregati sono stati poi fissati e immunoistochimica per GFP (verde) e βIII tubulina (rosso). Bar, 50 pm. (B) fascina Efficace esaurimento può essere rilevato 50 ore dopo shRNA nucleofection da analisi western blot. Actina è mostrato come un controllo di carico (C) Analisi quantitativa di relativa distanza di migrazione mostrando che la deplezione fascina ostacola seriamente la migrazione neuroblasti. (Media ± SEM; ** p <0.01, n = 3 esperimenti indipendenti).

Discussione

La migrazione dei neuroblasti lungo le RMS per la posizione finale in OB è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano questo processo complesso sono ben lungi dall'essere pienamente compreso.

La procedura sperimentale qui descritto consente lo studio della migrazione neuroblasti in vitro. Abbiamo adattato un protocollo precedentemente pubblicato per isolare RMS neuroblasti dai primi di topo postnatale o ratto ^25. Per ottenere risultati ottimali, è importante avere il passo dissezione, dal momento che è fondamentale per mantenere l'intervallo di tempo tra la dissezione e nucleofection al minimo. Dopo nucleofection, neuroblasti possono essere reaggregated, incorporati in una matrice tridimensionale e lasciati a migrare su un periodo di 24 ore. In alternativa, per scopi diversi migrazione (ad esempio, immunofluorescenza e western blot), le cellule possono essere immediatamente placcato dopo nucleofection su polyornithine/laminin-coprioggetto rivestiti, dove sopravvivono fino a 4-5 giorni. Neuroblasti topo e nel ratto migrano in Matrigel in misura simile, tuttavia cellule di topo sembrano avere una maggiore tendenza a migrare nelle catene di cellule di ratto.

A seconda dello scopo dello studio, neuroblasti possono essere nucleofected con differenti plasmidi codificanti proteine ​​fluorescenti o Tipo / mutante proteine ​​selvatiche di interesse. Per ottimali plasmidi di espressione proteica con un promotore CAG (β-actina promotore di CMV enhancer e-β globina poly-A coda) ²⁶ sono altamente raccomandati. Inoltre, oligo siRNA o plasmidi shRNA possono essere nucleofected per atterramento target di interesse. Proteina efficace deplezione può essere visualizzato mediante immunofluorescenza o Western Blot (di solito lisi aggregati incorporati dal 1 ratto cuccioli con 50 ml di tampone di lisi standard).

Nucleofection è un metodo relativamente semplice per transfettare neuroblasts primari, offre un'alternativa più facile e veloce a viral trasfezione mediata da vettori, e può raggiungere alte (~ 70-80%) efficienza di trasfezione. E 'fondamentale lavorare velocemente durante la procedura nucleofection, dopo aver lasciato neuroblasti nella soluzione nucleofection per un tempo prolungato riduce drasticamente la vitalità cellulare.

La resa media di cellule da RMS dissezione è relativamente basso per i topi P7 (~ 5 x 10 ⁵ cellule / cervello) in confronto ai ratti P7 (~ 1 x 10 ⁶ cellule / cervello) e sono richiesti almeno 3 x 10 ⁶ cellule per nucleofection per raggiungere trasfezione con ~ 50% di efficienza. Inoltre, neuroblasti ratto sembrano resistere meglio Nucleofection rispetto ai neuroblasti del mouse. Pertanto, cuccioli precoce postnatale (P6-P7) ratto potrebbero rappresentare una comoda fonte neuroblast, anche considerando che l'organizzazione di RMS ratti e topi sono molto similar ²⁷ e che la portata di ratto e topo migrazione neuroblasti in vitro è paragonabile. Si consiglia di non tenere i grappoli reaggregated di neuroblasti nucleofected in sospensione per più di 48 ore per evitare effetti anomali sulla morfologia cellulare e la migrazione (le nostre osservazioni non pubblicate).

Il test 3D qui descritto può essere usato per quantificare la migrazione neuroblasti in un punto di tempo fisso dopo inclusione in matrice (ad es. 24 hr). Aggregati di dimensioni diverse possono essere utilizzati nell'analisi, poiché non vi è alcuna correlazione significativa tra la dimensione degli aggregati e distanza di migrazione (nostre osservazioni non pubblicate). Per visualizzare e ulteriormente approfondire le dinamiche della migrazione neuroblasti, time-lapse imaging può essere utilizzato. Si raccomanda di effettuare l'analisi di migrazione all'interno di un intervallo di 24 ore dopo l'incorporamento, in quanto la velocità di neuroblasti sembra diminuire drasticamente a tempi più lunghi (nostre osservazioni non pubblicate).

Ci sono alcune limitazioni a questo protocollo. In primo luogo, nucleofection può finora essere utilizzato per i primi neuroblasts roditori postnatale, mentre l'infezione con vettori virali rimane il metodo più efficiente per trasfezione neuroblasti adulti ^28. In secondo luogo, la migrazione in vitro non riproduce completamente la complessa architettura delle RMS osservati in vivo. Infatti, anche se neuroblasti mantengono la capacità di migrare in modo simile alle loro controparti in vivo, nel setup sperimentale qui descritte non hanno interazioni con altri componenti di RMS come astrociti e vasi sanguigni, che contribuiscono anche a regolare la loro motilità ^{9,29, 30.} Questo problema può essere affrontato in futuro ottimizzazione del tridimensionali sistemi modello di co-coltura.

In conclusione, combinando nucleofection con un saggio di migrazione 3D rappresenta uno strumento prezioso per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla basemigrazione neuroblasti. Questa procedura sperimentale fornisce un metodo iniziale, veloce e relativamente semplice per valutare il ruolo dei regolatori candidati di migrazione neuroblasti, che possono essere ulteriormente convalidate da altri approcci come in vivo postnatale elettroporazione e time-lapse imaging di culture fetta cerebrali ^28,31,32 .

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Penicillina-Streptomicina	Invitrogen Life Technologies	15140-122
2,5% Tripsina-EDTA (10x)	Gibco	15090-046	negozio 200 &; l aliquote a -20 ° C
DNAsi I Fiala (D2)	Worthington	LK003170	≥ 1.000 unità per fiala; negozio 50 µ l aliquote a -20 ° C
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Siero fetale per vitello (FCS)	Hyclone	SH3007902
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Integratore B27	Invitrogen Life Technologies	17504044
L-Glutammina (200 mM)	Invitrogen Life Technologies	25030-081
Soluzione di D-(+)-glucosio (45%)	Sigma-Aldrich	G8769
Matrigel Matrice di membrana basale, fattore di crescita ridotto (GFR), senza rosso fenolo, 10 ml, senza LDEV	BD Biosciences	356231	preparare 120 µ l aliquote a 4 gradi C, quindi conservare a -80 ° C
PFA	Sigma-Aldrich 441242
Saccarosio	BDH	102745C
Siero di capra	Sigma-Aldrich	69023
Triton X-100	VWR International Ltd.	306324N
BSA	Fisher Chemical	BPE9701-100
Mezzo di montaggio a fluorescenza Dako		S3023
Kit di nucleofecazione del neurone di ratto	Lonza	VPG-1003
Kit di nucleofecazione del neurone di topo	Lonza	VPG-1001
Coltello microchirurgico	Angiotech	7516
McIlwain trinciatutto di tessuti	The Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector II	Lonza