Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Summary

Il protocollo qui descritto è per la valutazione strutturale di una preparazione retinica a montaggio intero. Ciò include le descrizioni della dissezione tissutale, il montaggio su un inserto di membrana in politetrafluoroetilene idrofilizzato (PTFE), il caricamento del bolo con marcatori fluorescenti e un confronto della fissazione con carbodiimmide e paraformaldeide per l'analisi immunoistochimica dei componenti cellulari e sinaptici.

Abstract

Lavorare con tessuti delicati può essere un fattore complicante quando si esegue la valutazione immunoistochimica. Qui, presentiamo un metodo che utilizza una membrana in PTFE idrofilizzata supportata da anello per fornire supporto strutturale sia al tessuto vivente che a quello fissato durante il processo immunoistochimico, che consente l'uso di una varietà di protocolli che altrimenti causerebbero danni al tessuto. In primo luogo, ciò è dimostrato con il caricamento in bolo di marcatori fluorescenti nel tessuto retinico vivente. Questo metodo consente una rapida visualizzazione delle strutture mirate, mentre il supporto della membrana mantiene l'integrità del tessuto durante l'iniezione e consente un facile trasferimento della preparazione per ulteriori immagini o elaborazioni.

Secondo, viene descritta una procedura per la colorazione degli anticorpi nel tessuto fissato con carbodiimmide. Sebbene la fissazione della paraformaldeide sia più comune, la fissazione della carbodiimmide fornisce un substrato superiore per la visualizzazione delle proteine sinaptiche. Una limitazione della carbodiimmide è che il tessuto fisso risultante è relativamente fragile; Tuttavia, questo problema viene superato con l'uso della membrana di supporto. Il tessuto retinico viene utilizzato per dimostrare queste tecniche, ma possono essere applicate a qualsiasi tessuto fragile.

Introduction

L'esecuzione dell'immunoistochimica in tessuti delicati e intatti comporta il rischio di danni durante la manipolazione e il trasferimento. Questo può verificarsi sia nelle fette di cervello che in altri tessuti sottili, come la retina degenerata. Inoltre, esistono alcuni metodi di fissazione dei tessuti che possono essere vantaggiosi per l'immunocolorazione delle strutture neuronali, ma che comportano una stabilità strutturale compromessa, precludendone l'uso. Un esempio particolare di ciò è la fissazione a base di carbodiimmide, che è superiore per colorare i recettori e gli ormoni^1-7, ma è comunemente evitata a causa dell'instabilità del tessuto fissato.

Qui, descriviamo una procedura che utilizza una membrana in PTFE idrofilizzata per sostenere strutturalmente tessuti delicati, fissi o non fissati, per una varietà di tecniche di colorazione. La membrana di supporto consente la manipolazione di tessuti delicati prima e dopo la fissazione, consentendo diverse fasi di lavorazione e riducendo al minimo il rischio di danni ai tessuti. Nel complesso, questo semplice metodo per preservare l'integrità dei tessuti offre l'opportunità di utilizzare tecniche che altrimenti potrebbero essere evitate. In quanto tale, questo approccio potrebbe essere utilizzato con successo anche per la preparazione di un'ampia varietà di tessuti, come le fette di cervello che diventano fragili in seguito alle procedure di affettatura.

Protocol

In tutte le procedure sperimentali, gli animali sono stati trattati secondo le norme della Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e in conformità con i protocolli approvati dal Weill Cornell Medical College. Gli animali sono stati soppressi con anidride carbonica e successiva lussazione cervicale.

1. Dissezione della retina a montaggio intero

1. Dopo che il topo è stato soppresso, enucleare i suoi occhi e metterli nella soluzione di Ringer ossigenata con tampone HEPES (Tabella 1).
2. Rimuovere la cornea tagliando in un percorso circolare lungo l'ora serrata con piccole forbici, tenendo l'occhio al limbus con una pinza. Estrarre la lente con una pinza.
3. Rimuovere quanto più vitreo possibile, utilizzando una pinza a lama smussata. Questo passaggio è importante per le iniezioni in bolo e le registrazioni elettrofisiologiche; Non è necessario quando si esegue solo l'immunoistochimica.
4. Staccare la retina dall'oculare posizionando una pinza tra la retina e l'oculare, muovendo lentamente la pinza lungo la circonferenza. Stabilizzare l'oculare tenendo saldamente la sclera con una seconda serie di pinze. Tagliare il nervo ottico nella posizione tra la retina e l'oculare per facilitare la separazione della retina dall'oculare.
5. La retina può essere sezionata in pezzi (ad es. quarti) o utilizzata nel suo insieme. Per tagliare a pezzi, usa le forbici per praticare incisioni dalla periferia della retina fino al nervo ottico. In alternativa, per utilizzare l'intera retina, praticare delle incisioni dalla periferia a metà del nervo ottico. Le incisioni aiuteranno a fare una preparazione piatta.

2. Montaggio su inserto membrana in PTFE idrofilizzato

1. Preparare la membrana come descritto di seguito. Quando vengono eseguite registrazioni fisiologiche o esperimenti di iniezione di colorante, accorciare il supporto utilizzando un tornio o una sega a mano in modo che l'anello rimanente abbia un'altezza di 1 mm.
   Nota: gli inserti della piastra di coltura possono essere non modificati o modificati (Figura 1A). La scelta della configurazione è dettata dallo scopo dell'esperimento. Per l'immunocolorazione, è adatto un inserto non modificato.
2. Lucidare le superfici ruvide con carta vetrata fine (grana 300 o superiore).
3. (Facoltativo) Rimuovere i piedini sotto l'anello con le forbici.
4. Per rimuovere eventuali detriti, sciacquare o sonicare la membrana in acqua distillata per 2-3 minuti.
5. Montare il tessuto sulla membrana (Figura 1A). Posizionare il fazzoletto con un po' di soluzione sopra la membrana con una pipetta di trasferimento in plastica. Se necessario, tagliare la punta stretta della pipetta per evitare che il campione di tessuto aderisca alla pipetta durante il trasferimento.
6. Attacca la retina con le cellule gangliari (GC) verso l'alto: sulla membrana, rimuovi gradualmente la soluzione mentre allarga la retina e dispiega le pieghe con una pinza.
7. Sul lato opposto della membrana, posizionare una siringa vuota (1 ml) direttamente sotto il tessuto. Applicare l'aspirazione tirando indietro lo stantuffo fino a un volume di 0,2-0,3 ml. Aumentare la superficie di aspirazione tagliando la punta di tenuta della siringa prima dell'uso. Il tessuto non richiede ulteriori trattamenti per l'adesione, poiché è fisicamente invischiato all'interno della membrana.

3. Iniezione in bolo di isolectina Alexa 488

1. Preparare le pipette per cerotti e la soluzione colorante. Estrarre le pipette patch dal vetro capillare borosilicato con un estrattore Flaming/Brown, con una resistenza di ~1 MΩ. Rompere delicatamente la punta della pipetta.
2. Preparare la soluzione colorante aggiungendo 0,3 μl di soluzione madre di isolectina Alexa 488 a 10 μl della soluzione di Ringer tamponata HEPES descritta al punto 1.2.
3. Trasferire il campione nella configurazione del patch-clamp per l'iniezione (Figura 1C). Posizionare la membrana con il tessuto attaccato nella camera di registrazione perfusa con la soluzione di Ringer riscaldata (37 °C) e ossigenata tamponata con HEPES.
4. Posizionare la pipetta contenente il colorante contro la membrana limitante interna (ILM, Figura 2A). Utilizzando il micromanipolatore, far avanzare ulteriormente la pipetta contro l'ILM fino a quando non penetra in essa. Iniettare la soluzione colorante con una pressione di 10-20 psi per 1 sec utilizzando un picospritzer. Una o più sedi possono essere prese di mira per l'iniezione (Figura 2B). Se non è disponibile un picospritzer, è possibile utilizzare una siringa da 10 ml per erogare una pressione positiva dell'aria per l'iniezione.
5. Incubare il tessuto iniettato per 10 minuti. Durante l'incubazione, il tessuto iniettato può essere visualizzato sotto l'illuminazione dell'epifluorescenza.
6. Dopo l'etichettatura, il preparato può essere portato al microscopio per l'imaging. Trasferire l'inserto in una piastra di coltura con fondo di vetro, posizionando la retina con la retina rivolta verso il basso (Figura 1C).
7. Aggiungere una goccia di soluzione HEPES per mantenere umido il campione.
8. Posizionare 2-3 punti di grasso sottovuoto attorno al perimetro dell'anello di plastica per fissare saldamente l'inserto al fondo della piastra di coltura.
9. Trasferire il piatto sul tavolino del microscopio.

4. Fissazione di paraformaldeide e carbodiimmide

1. Fissare il campione trasferendo l'inserto nel fissativo per 15 minuti. Possono essere utilizzati tempi di fissazione più lunghi o più brevi, a seconda dell'applicazione. Entrambi i fissativi possono essere efficacemente utilizzati per fissare GFP, isolectina o idrazidi fluorescenti di Alexa (ad esempio utilizzati per riempire le cellule nelle registrazioni patch-clamp).
   Nota: Per il fissaggio, possono essere utilizzate soluzioni di carbodiimmide al 4% o paraformaldeide al 4%. Per mantenere l'aderenza, la fissazione deve essere eseguita dopo che il tessuto è già stato attaccato alla membrana. Il tessuto può essere fissato immediatamente dopo il montaggio o dopo la registrazione fisiologica e/o l'iniezione in bolo.
2. Sciacquare il fazzoletto in tampone fosfato (PB) per 30 minuti. Successivamente, il tessuto può essere lavorato come montatura intera (passaggio 5) o tagliato in sezioni verticali e quindi lavorato (passaggi 6 e 7).

5. Immunocolorazione di Wholemounts retinici

1. In una capsula a 24 pozzetti (Figura 1D) bloccare i pezzi di retina sulla membrana per 1 ora in una soluzione colorante.
2. Diluire gli anticorpi primari di topo anti-PSD-95 1:300 nella soluzione colorante e applicare per 48 ore a temperatura ambiente al buio. Aggiungere ~100-150 μl di soluzione di anticorpi in ciascun pozzetto con il tessuto. Per evitare che si secchino, riempire i pozzetti inutilizzati con acqua distillata.
3. Risciacquare per 20 minuti in PB, 3 volte.
4. Incubare per 24 ore nell'anticorpo secondario Alexa 568 anti-topo d'asino disciolto 1:500 nella soluzione colorante.
5. Risciacquare per 20 minuti in PB, 3 volte.
6. Posizionare l'inserto con il fazzoletto colorato in una capsula di Petri standard da 3 cm riempita con soluzione di PB. Con piccole forbici, ritaglia la parte della membrana contenente la retina dall'anello.
7. Trasferire la retina sulla membrana su un vetrino retina verso l'alto. Rimuovere il PB, aggiungere il supporto di montaggio. Posizionare piccoli pezzi di un vetrino coprioggetti rotto tra il vetrino e i vetrini coprioggetti per evitare schiacciamenti prolungati e danni alla retina. Posizionare il vetrino coprioggetti.
8. Sigillare il vetrino coprioggetti in posizione con lo smalto per unghie. Conservare i vetrini al buio, in frigorifero.

6. Sezionamento verticale di tessuto montato su membrana

1. Dopo la fissazione, immergere il tessuto sulla membrana nelle soluzioni di gradiente di saccarosio al 10%, 20% e 30% di saccarosio rispettivamente per 30 minuti, 1 ora e durante la notte. La fase notturna viene eseguita a 4 °C in frigorifero, tutte le altre fasi a temperatura ambiente.
2. Usando le forbici, rimuovere la membrana con il fazzoletto dall'anello di inserimento in plastica.
3. Posizionare la membrana tagliata su Parafilm con la retina rivolta verso l'alto e rimuovere quanta più soluzione possibile con Kimwipes.
4. Mettere il Parafilm con il fazzoletto nella camera del criostato e aggiungere una goccia di terreno OCT. Utilizzare il dispositivo di congelamento rapido per accelerare il congelamento.
5. Staccare il campione congelato e capovolgerlo.
6. Tagliare l'OCT congelato in eccesso. Lasciare circa 2 mm intorno al campione su tre lati e lasciare 5-6 mm dal lato che verrà attaccato al supporto.
7. Coprire il lato retinico esposto (lato membrana) con una goccia di OCT. Lasciare libera l'area di fissaggio.
8. Congelare la membrana con tessuto retinico. Ora il campione è pronto per essere posizionato su un supporto di taglio.
9. Posizionare una goccia di OCT su un anello porta freddo. Inserire immediatamente il campione congelato nella goccia.
10. Tagliare sezioni di 10-20 μm di spessore, impostando la temperatura del criostato a -19 °C. Utilizzare vetrini di adesione polisinica caldi (temperatura ambiente). Lasciare i vetrini con le sezioni attaccate su una piattaforma riscaldante per ~2-3 minuti (41 °C) al buio per garantire una salda adesione delle sezioni.
11. Mettere i vetrini in una scatola di immagazzinaggio e conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.

7. Immunocolorazione delle sezioni retiniche

1. Togli i vetrini con le sezioni dal congelatore. Lasciarli a temperatura ambiente per 1 minuto per eliminare la condensa.
2. Circonda le sezioni con un bloccante liquido per creare una barriera per un'ulteriore incubazione.
3. Posizionare i vetrini nella scatola di incubazione. Coprire il fondo della scatola con acqua per evitare l'evaporazione della soluzione anticorpale.
4. Risciacquare con PB per 5 min.
5. Preparare le stesse soluzioni coloranti e seguire i passaggi del passaggio 5. L'incubazione con l'anticorpo primario avviene durante la notte e con il secondario di 1 ora. Non utilizzare vetri rotti tra il vetrino coprioggetti e il vetrino.

Results

Dimostrati qui sono due esperimenti rappresentativi che beneficiano dell'uso di una membrana in PTFE idrofilizzata per supportare la retina dell'intero monte durante le procedure di colorazione. Il primo esperimento, illustra il metodo per una caratterizzazione rapida e semplice della vascolarizzazione retinica, un'elaborata rete di vasi sanguigni che si estendono su più strati retinici (Figura 2). Questo approccio combina il caricamento in bolo dell'isolectina con la marcatura ad immersione con SRH. Si ...

Discussion

L'elevata biocompatibilità e trasparenza delle soluzioni della membrana in PTFE idrofilizzata è vantaggiosa quando si lavora con tessuti viventi. Questa preparazione è stata utilizzata con successo in lavori precedenti per registrazioni patch-clamp delle risposte alla luce^8-10. Qui, mostriamo come questo approccio può essere adottato per l'analisi strutturale della retina dell'intero mount.

La tecnica di caricamento in bolo può essere utilizzata efficacemente per l'etichettatura di ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Millicell Inserto per Colture Cellulari, 12 mm, PTFE idrofilo (Biopore), 0.4 μ m	Millipore	PICM01250
Siringa da insulina, 1 ml	Beckton Dickinson	309659
Forbici	Fine Science Tools	15003-08	pinza per dissezione
, Dumont #55, inox	Fine Science Tools	11255-20	dissezione
Criostato	Leica	vari
sistemi di microscopio confocale	Nikon	vari
precisione del mondo	vetro capillare	1B150F-4
P-97 Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone	Sutter Instrument Co.
Picospritzer III	Parker Hannifin
Piastre per colture con fondo in vetro	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Piastra di Petri	Pipette	1008
VWR		16001-180
Piastre multipozzetto, 24 pozzetti	Beckton Dickinson	351147
Vetro di copertura, #1	Microscopia elettronica Scienze	72200-30
Vetrini di adesione polisinica Microscopia	elettronica	Scienze 63412-01
Vetrini per microscopio	Globe	1301
Liquid Blocker	Microscopia elettronica	Scienze 71312
Mezzo di montaggio VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000
OCT medio	Sakura	4583
Parafilm film film da laboratorio	Fisher	13-374-10
Dow Corning grasso per alto vuoto	Sigma-Aldrich	Z273554
Topo anti-PSD95	Millipore	MABN68	anticorpo
Asino anti-topo Alexa 568	Invitrogen	A10037	anticorpo
Isolectin Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sulforhodamine	Sigma-Aldrich	341738
Carbodiimmide	Thermo Scientific	22980	EDC
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148