Rispetto alla cromatografia di affinità tradizionale che utilizza colonne piene di perline di agarosio A, gli adsorbenti a membrana A proteici possono accelerare significativamente l'isolamento su scala di laboratorio degli anticorpi e di altre proteine che esprimono frammenti Fc. Metodi di analisi e quantificazione appropriati possono accelerare ulteriormente l'elaborazione delle proteine, consentendo di completare l'isolamento / caratterizzazione in un giorno lavorativo, anziché oltre 20 ore lavorative.
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Articolo metodologico
Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato
In questo articolo
Sommario
Abstract
La purificazione su scala industriale su scala industriale delle biomolecole dai supernanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari liscivie può essere effettuata utilizzando la cromatografia di affinità. Mentre la cromatografia di affinità che utilizza proteine porose A agarose perline imballate in colonne è probabilmente il metodo più comune di isolamento in scala di laboratorio di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti fc di IgG, può essere un processo dispendioso in termini di tempo e costoso. I vincoli di tempo e finanziari sono particolarmente scoraggianti nei piccoli laboratori scientifici di base che devono recuperare centinaia di microgrammi a quantità di proteine milligrammi da soluzioni diluite, ma non hanno accesso a sistemi di erogazione di liquidi ad alta pressione e / o personale con esperienza in bioseparazioni. Inoltre, la quantificazione e la caratterizzazione dei prodotti possono anche allungare eccessivamente il tempo di lavorazione per diversi giorni lavorativi e gonfiare le spese (materiali di consumo, salari, ecc.). Pertanto, è necessario un protocollo veloce, economico ma efficace per l'isolamento su scala di laboratorio e la caratterizzazione di anticorpi e altre proteine in possesso di un frammento Fc. A tal fine, abbiamo ideato un protocollo che può essere completato da personale tecnico a esperienza limitata in meno di 9 ore (circa un giorno lavorativo) e fino a 4 ore, rispetto ai metodi tradizionali che richiedono oltre 20 ore lavorative. La maggior parte delle attrezzature richieste è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche, biochimiche e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Per dimostrare questo protocollo, vengono presentati risultati rappresentativi in cui la galettanina murina chimerica-1 fusa all'Fc umano (Gal-1hFc) dal supernatante di coltura cellulare è stata isolata usando una proteina A adsorbente di membrana. Il Gal-1hFc purificato è stato quantificato utilizzando una procedura accelerata di analisi western blotting e caratterizzato utilizzando citometria a flusso. Il flusso di lavoro semplificato può essere modificato per altre proteine che esprimono Fc, come gli anticorpi, e /o alterato per incorporare metodi alternativi di quantificazione e caratterizzazione.
Introduzione
L'isolamento di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti di immunoglobulina G (IgG) Fc dai supernatanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari diluite può essere realizzato utilizzando la cromatografia di affinità proteinA A. Nei laboratori e nell'industria scientifica e ingegneristica di base, le colonne piene di proteina porosa A agarosio, vetro o perline polimeriche sono più comunemente utilizzate per la cromatografia di affinità, nonostante gli elevati costi finanziari e i lunghi tempi dilavorazione 1-3. È molto apprezzato che la cromatografia di affinità rappresenti il più grande collo di bottiglia di spesa e lavorazione sia in laboratorio che in ambienteindustriale 2,4. Di conseguenza, sono stati sviluppati numerosi miglioramenti per ridurre i costi e i tempi di elaborazione senza sacrificare il recupero complessivo delprodotto dal treno di processo 1,2,5-7. Particolarmente promettente per l'isolamento di anticorpi e altre proteine che esprimono Fc è la cromatografia di affinità utilizzando una proteina A membrane adsorber2,5,7-10. Mentre la cattura fc nella cromatografia a colonna è limitata dalladiffusione (cioè la proteina che esprime fc deve diffondersi nei pori interni e attraverso di esso per raggiungere la maggior parte della proteina A) con caduta di alta pressione attraverso la colonna, il trasporto di massa negli adsorbenti a membrana è guidato dalla convezione alla rinfusa, con conseguente evitare limitazioni didiffusione 8,9,11,12. Inoltre, la caduta di pressione attraverso l'adsorbente a membrana è bassa, consentendo così portate di perfusione più elevate rispetto alle colonne imballate perline8,9,11,12. Pertanto, per l'isolamento su scala di laboratorio, si prevede che la cromatografia a membrana riduca i tempi di isolamento di diverse ore e aumenti la cattura del prodotto rispetto alla cromatografia a colonna. Inoltre, sono stati proposti modelli matematici per l'adsorbimento IgG negli adsorbenti a membrana8,9,11,12, consentendo così agli utenti finali di prevedere le prestazioni in laboratorio.
Un altro collo di bottiglia nei laboratori di scienze e ingegneria di base è la caratterizzazione della proteina che esprime fc. Tuttavia, la selezione di metodi appropriati per completare i test di caratterizzazione, come le macchie occidentali, può ridurre notevolmente il tempo dedicato ai test dei prodotti. Ad esempio, il trasferimento semidry in un sistema tampone discontinuo può realizzare il trasferimento elettroforetico di proteine da un gel SDS-PAGE a una membrana di polivinile difluoridina (PVDF) in pochi minuti, rispetto a 1-2 ore di trasferimento di serbatoio (bagnato) in un sistema tampone continuo13.
Un protocollo rapido, economico ed efficace per isolare e caratterizzare una proteina di fusione chimerica che esprime un frammento Fc di IgG umano è descritto nel presente documento. La maggior parte delle apparecchiature è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche di base, biologia, chimica e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Sebbene siano stati generati risultati rappresentativi dall'isolamento e dalla caratterizzazione di una proteina di fusione chimerica Fc murina-1/umana (Gal-1hFc), il protocollo semplificato può essere applicato all'isolamento di altre molecole che possiedono un frammento Fc, come anticorpi, frammenti Fc stessi o altre proteine di fusione Fc. I nostri miglioramenti hanno ridotto drasticamente i tempi di elaborazione (fino a 4 ore ma più in genere ~ 9 ore, rispetto a oltre 20 ore lavorative) ottenendo al contempo un recupero del prodotto simile o migliorato rispetto ai metodi standard.
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Protocollo
1. Verificare l'affinità per le proteine A
- Verificare che la proteina che esprime fc (proteina di fusione ricombinante o anticorpo IgG, finora denominata "proteina") abbia un'affinità accettabile per la proteina A14-17 prima di utilizzare l'adsorbente della membrana A della proteina E e verificare la presenza della proteina nella soluzione stock(ad esempio, supernatante di coltura cellulare chiarificato dalla centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti a cellule sospese a pellet). Utilizzare citometria a flusso, western blotting, ELISA, ecc. per rilevare la funzione proteica e/o la presenza di Fc, in base alle preferenze di laboratorio. Idealmente, quantificare la proteina nel supernatante di coltura cellulare (fase 6) per evitare di superare la capacità di adsorbente della membrana A della proteina. Procedere se viene rilevata una proteina.
2. Preparare proteine A membrana adsorbente e coltura cellulare supernatante
- Seguire le istruzioni del produttore per preparare l'adsorbente a membrana. Non lasciare mai che l'aria entri nell'adsorbente della membrana. Tutte le soluzioni perfuse attraverso l'adsorbente a membrana devono essere a temperatura ambiente e prefiltrate utilizzando un filtro da 0,22 μm. Riempire una siringa da 10 ml con la salina tamponata al fosfato (DPBS) filtrata da Dulbecco filtrata da 0,22 μm o tampone di scelta e scarico delle bolle d'aria. Perfondere DPBS per rimuovere la soluzione di archiviazione e equilibrare l'adsorbente a membrana immediatamente prima dell'uso.
- Filtrare il supernatante di coltura cellulare immediatamente prima della perfusione attraverso l'adsorbente a membrana, utilizzando un'unità di filtrazione sterile aspirata da 0,22 μm.
3. Caricare la proteina A Membrane Adsorber
- Aspirare il supernatante di coltura cellulare in una siringa Luer Lock (30 ml o più) e scaricare eventuali bolle d'aria.
- Assemblate materiali e attrezzature, come illustrato nella figura 1. Collegare la siringa all'ingresso dell'adsorbente della membrana. Collegare tubi flessibili all'uscita dell'adsorbente a membrana. Se lo si desidera, posizionare un filtro siringa da 0,22 μm tra la siringa e l'adsorbente a membrana. Utilizzare un pallone o una bottiglia per catturare il flusso attraverso (noto anche come filtrato), dall'adsorbente.
- Impostare la pompa della siringa sulla portata volumetrica desiderata, ma non superare la portata raccomandata dalproduttore (ad esempio 10 ml/min). Perfondere il supernatante della coltura cellulare attraverso l'adsorbente a membrana, raccogliendo il flusso attraverso un becher o un altro contenitore. Ricaricare la siringa con i supernatanti necessari.
- Se lo si desidera, testare il flusso attraverso per la presenza di proteine utilizzando citometria di flusso, western blotting, ELISA, ecc. in base alle preferenze di laboratorio. In genere non è necessario riperperperare il flusso attraverso.
4. Proteina Elute dall'adsorbente di membrana
- Lavare l'adsorbente a membrana con 10 ml di DPBS per rimuovere eventuali proteine non abbollate.
- Elute proteina dall'adsorbente di membrana alla portata desiderata(ad esempio 1 ml/min) utilizzando 10-15 ml di tampone di eluizione(ad esempio tampone di eluizione a base di ammina (pH 2,8)). Catturare l'eluato in un tubo contenentetampone neutralizzante (ad esempio 1 M Tris (pH 9,4)) al 10% del volume di eluizione (1,0-1,5 ml).
- In alternativa, la proteina eluta in un ml si trasforma in tubi contenenti 100 μl di tampone di neutralizzazione, utilizzando un volume totale di tampone di eluizione da 10-15 ml. Utilizzare il metodo di caratterizzazione preferito per testare ogni frazione per la presenza di proteine.
- Rigenerare l'adsorbente a membrana secondo le istruzioni del produttore. Perfondere 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm o tampone di scelta, quindi 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm in 50 mM naoh in 1 N NaCl e infine 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm. Riempire l'adsorbente a membrana con il 20% di etanolo in DPBS per la conservazione a lungo termine a 4 ºC.
5. Concentrare e dializzare la proteina
- Depositare tutti gli eluati (o frazioni di eluizione contenenti proteine come determinato nella fase 4.3) in un'unità filtrante centrifuga cut-off a peso molecolare da 10 kDa. Seguire le istruzioni del produttore per la centrifugazione.
- Dializzare il ritensionato in un'unità di dialisi a piccolo volume (taglio del peso molecolare di 10 kDa) contro il tampone preferito, seguendo le istruzioni del produttore. Potrebbe essere necessario aggiungere un tampone al materiale dializzato se la precipitazione proteica è un problema. Se lo si desidera, il materiale dializzato può essere refrigerato fino a quando non è possibile eseguire il passaggio 6, ma non è consigliabile conservare a lungo termine senza conservanti.
6. Quantificare e caratterizzare il prodotto purificato in una procedura di blotting occidentale accelerata
- Risolvere gli standard di proteina purificata e Fc sul gel di scelta da parte di SDS-PAGE, in condizioni di riduzione o non riduzione comedesiderato 18-20. Utilizzare un mini gel anziché un gel midi per ridurre al minimo i tempi di esecuzione.
- Se non è già noto, determinare l'intervallo di standard Fc su quale segnale a banda varia linearmente rispetto alla quantità di carico(ad esempio 0,1-1 mg). Usa lo stesso gel, le condizioni di esecuzione, le condizioni di trasferimento e i reagenti che verranno utilizzati per quantificare e caratterizzare le proteine purificate.
- Caricare più quantità di campioni di proteine purificate, inclusi campioni diluiti con DPBS, per garantire che i segnali di banda proteica purificata si trovano all'interno dell'intervallo di segnale lineare degli standard Fc nell'analisi delle immagini.
- Trasferire le proteine dal gel a una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) in un sistema tampone discontinuo utilizzando un blotter semidry13, seguendo le istruzioni del produttore di blotter. Il tempo di trasferimento è in genere di 5-10 minuti. Se lo si desidera, Coomassie macchia il gel dopo il trasferimento per verificare l'efficienza deltrasferimento 21.
- Eseguire l'immunoblotting con anti-Fc o anti-IgG coniugato alla fosfatasi alcalina (AP) o alla perossidasi del ravanello del cavallo (HRP), in base alle preferenze di laboratorio, utilizzando un sistema di rilevamento delle proteine assistito dal vuoto. Il tempo di immunoblotting è in genere inferiore a 1 ora.
- Sviluppare immunoblot utilizzando il substrato e il metodo di scelta(ad esempio substrato AP e chemiluminescenza migliorata).
- Quantificare le proteine purificate mediante analisi delle immagini. Eseguire una regressione lineare sui segnali di banda dagli standard Fc. Se R2>0,90, utilizzare l'equazione per la linea per calcolare la quantità proteica dai suoi segnali di banda. Tenere conto della diluizione del campione, se necessario. Poiché la quantificazione della proteina viene eseguita sulla base di Fc, regolare il valore delle differenze di peso molecolare tra la proteina e Fc. Se R2<0,90, ripetere il passaggio 6 nella sua interezza.
- Convalidare proteine utilizzando saggi o metodi funzionali per rilevare Fc tramite citometria a flusso, western blotting, ELISA, ecc. in base alle preferenze di laboratorio.
- Diluire le proteine alla concentrazione desiderata e/o aggiungere eventuali conservanti o stabilizzanti desiderati alla soluzione proteica purificata prima di aliquota per la conservazione a lungo termine, congelata o meno.
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Risultati
Il protocollo semplificato per l'isolamento e la caratterizzazione delle proteine che esprimono fc viene regolarmente utilizzato per elaborare la galettanina murina chimerica-1 fusa all'Fc umano (Gal-1hFc) dai supernanti di coltura cellulare diluita. Il diagramma di flusso nella figura 2 illustra il flusso di lavoro e l'ora di ogni passaggio del protocollo. Per un lotto tipico di 300 ml di supernatante, il tempo totale di lavorazione è di circa 9 ore quando viene eseguita la prova citometrica del flusso ...
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Discussione
Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per isolare e caratterizzare rapidamente una proteina di fusione chimerica che esprime fc umano (Gal-1hFc), senza compromettere significativamente il recupero del prodotto o il costo di gonfiaggio. I componenti chiave del flusso di lavoro semplificato sono un adsorbente a membrana A proteico per l'isolamento e il trasferimento semidry e l'immunoblotting sottovuoto per la caratterizzazione da parte dell'assorbente occidentale.
La drastica diminuzio...
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Dichiarazioni
Non c'è nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Luis F. Delgadillo (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University), il Sig. Matthew H. Williams (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University) e il Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital e Harvard Medical School) per l'assistenza tecnica di esperti. Gli autori desiderano inoltre ringraziare gli studenti dell'inverno 2011 CHE 404/BME 504 e dell'autunno 2012 CHE 4830/BME 5830 (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare e Ingegneria Biomedica, Ohio University) per la consulenza tecnica e la discussione. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione per la strumentazione di ricerca principale della National Science Foundation (NSF) CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NSC grant 1R15CA161 830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctoral Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) e NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Proteina A adsorbitore di membrana (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Filtro centrifugo Amicon Ultra, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Utilizzare un volume di 15 ml se necessario |
| Unità filtrante sottovuoto sterile, 0,22 &; m, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Siringhe da 10 ml con punte Luer Lock | 301604 | BD | |
| Siringhe da 30 ml con punte Luer Lock | BD | 309650 | |
| Tubi da laboratorio Tygon (1/16 pollici x 1/8 pollici x 50 piedi) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dispositivi per dialisi (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Vassoio di raccolta anticorpi Snap i.d. | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. supporto per blot a pozzetto singolo | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| tampone di eluizione | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra puro | Fisher Scientific | 819623 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS con Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-umano Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-umano Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Substrato di fosfatasi alcalina | Promega | S3841 | |
| Provette per citometria a flusso (5 ml di polistirene o polipropilene) | BD | 352054 | |
| Pompa a siringa | Apparecchio di Harvard | 55-2226 | È accettabile anche una pompa peristaltica |
| Gel proteico sistema di elettroforesi | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Qualsiasi sistema di elettroforesi su gel è accettabile, ma i sistemi mini gel funzionano più velocemente |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Qualsiasi sistema di trasferimento è accettabile, ma i sistemi di trasferimento discontinuo eseguono il trasferimento elettroforetico più velocemente |
| SNAP i.d. sistema di rilevamento di proteine assistito da vuoto | EMD Millipore | WBAVDBASE | Un modello aggiornato ha sostituito questo strumento specifico, ma entrambi dovrebbero funzionare altrettanto bene |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
