L'approccio gap vaselina cut-aperto viene utilizzato per ottenere bassi registrazioni sonore di correnti ioniche e gating di canali ionici voltaggio-dipendenti espressi in oociti di Xenopus con alta risoluzione di canale cinetiche veloci. Con piccola modifica, morsetto di tensione fluorometria può essere accoppiato al protocollo ovocita cut-open.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ovocita vaselina gap cut-open (COVG) clamp di tensione permette l'analisi delle proprietà elettrofisiologiche e cinetiche dei canali ionici eterologa in oociti. Registrazioni dalla configurazione cut-open sono particolarmente utili per risolvere basse correnti di magnitudo gating, rapida attivazione corrente ionica e disattivazione. I principali vantaggi rispetto al morsetto di tensione a due elettrodi (TEVC) tecnica includono maggiore velocità morsetto, miglior rapporto segnale-rumore, e la capacità di modulare la intracellulare ed extracellulare.
Qui, impieghiamo canale del sodio cardiaco umano (HNA 1,5 V), espresso in oociti di Xenopus, per dimostrare la configurazione e protocollo cut-open nonché modifiche necessarie per aggiungere capacità fluorometria morsetto di tensione.
Le proprietà dei canali ionici veloci attivanti, come HNA 1,5 V, non possono essere completamente risolti a temperatura ambiente usando TEVC, in which la totalità della membrana dell'oocita è serrato, rendendo difficile il controllo della tensione. Tuttavia, nella tecnica cut-aperto, separazione di solo una piccola porzione della membrana cellulare consente il bloccaggio rapido necessaria per registrare accuratamente cinetica veloce evitando canale run-down associato a tecniche di patch clamp.
In concomitanza con la tecnica COVG, cinetica del canale ionico e proprietà elettrofisiologiche possono essere ulteriormente analizzati mediante morsetto fluorometria tensione, in cui il movimento proteina viene monitorato tramite cisteina coniugazione di fluorofori applicate extracellulare, inserimento di proteine fluorescenti geneticamente codificati, o l'incorporazione di amminoacidi non naturali nella regione di interesse 1. Questi dati aggiuntivi produce informazioni cinetiche su voltaggio-dipendenti riarrangiamenti conformazionali della proteina attraverso cambiamenti nel microambiente circostante la molecola fluorescente.
Introduzione
Tecniche tensione di serraggio specializzati permettono la registrazione di correnti ioniche a potenziali di membrana controllate. Ampiamente usato voltage clamp a due elettrodi (TEVC) e tecniche di patch clamp forniscono informazioni elettrofisiologiche attendibili sulle proprietà di molti canali ionici. Tuttavia, entrambi questi metodi hanno inconvenienti che impediscono l'acquisizione di dati affidabili per i canali del sodio voltaggio-dipendenti veloci e altri canali attivanti veloce nelle membrane come quelle di ovociti di Xenopus. I laboratori Bezanilla e Stefani quindi sviluppato la tecnica del clamp di tensione gap vaselina cut-open (COVG) per ov....
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Protocollo
1. Setup Equipaggiamento iniziale
- Posizionare il palco e il manipolatore microelettrodo su un sistema di vibrazione-isolamento (ad esempio una tabella d'aria) con una gabbia di Faraday circostante per evitare disturbi elettrici e meccanici.
- Saldare sei pellets Ag / AgCl a lunghezze sei pollici di 24 AWG. Per una di queste lunghezze (da collegare P1), splice in un secondo filo per formare una "Y". Alle estremità di ogni filo saldare un oro BNC perno, che è incluso con l'amplificatore.
- Collegare le cinque palline Ag / AgCl saldati al 24 AWG alla headstage Bagno / Guardia (P1, P2, CC, GS1 e GS2). Collegare la "I" Ag / AgCl....
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Risultati
Figura 4 mostra la variazione di permeabilità del ovocita come soluzione saponina viene applicata alla parte inferiore della ovocita. Figura 5 mostra il tasso di conversione soluzione intracellulare per diffusione seguente permeabilizzazione saponina. 20-40 min sono tenuti a venire a uno stato stazionario 2,18.
Figura 6A mostra tracce generate dal protocollo di registrazione. La figura mostra correnti ioniche (dopo P/-8 perdita so.......
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Discussione
L'ovocita vaselina tensione gap clamp cut-open consente una rapida risoluzione dei dati, a basso rumore, aumentato il controllo sulla soluzione interna e la composizione soluzione esterna, e registrazioni stabili nel relativamente lunghi protocolli 19. Questi vantaggi impostate questa tecnica a parte il voltage clamp a due elettrodi standard e le tecniche di patch clamp. Sebbene attrezzature specializzate è necessaria e il protocollo è relativamente difficile, molto pochi problemi si verificano quando il .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Tutti i membri della Washington University di St. Louis Cardiac molecolare Engineering Lab. Un Burroughs Welcome Fondo Premio alla Carriera al Interface scientifico - 1010299 (JS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione esterna | Marca | Numero di catalogo | [Finale], peso o volume |
| N-metil-D-glucamina (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sale di sodio | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Idrossido di calcio | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variabile (pH fino a 7,4) |
| Soluzione | |||
| N-metil-D-glucamina (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sale sodico | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variabile (pH fino a 7,4) |
| Soluzione | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | 1,5mM |
| Cloruro di calcio | Cassone | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Soluzione | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Soluzione di saponina | |||
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Interno Soluzione | Vedi sopra | 50 ml Soluzione | |
| ponte di agar | |||
| N-metil-D-glucamina (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100 ml di 1 M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1,2 g |
| MES idrato | Sigma-Aldrich | M8250 | variabile (pH fino a 7,4) |
| Agar granulato | International | A20250 | 3% |
| NMDG Soluzione | |||
| di stoccaggio NMDG, HEPES, MES Soluzione idrato | vedi sopra | 40 ml | |
| di acqua | 60 ml | ||
| Nome del materiale/attrezzatura Numero di | catalogo | dell'azienda | Commenti/Descrizione |
| Morsetto per ovociti ad alte prestazioni | Dagan | CA-1B | |
| Sistema di acquisizione dati | Axon CNS | Oscilloscopio Digidata 1440A | |
| Tektronix | TDS 210 | ||
| Filtro di alimentazione a rack | APC | G5 | |
| Regolatore di temperatura del bagno di riscaldamento/raffreddamento | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Morsetto di tensione Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Controllo delle vibrazioni Piattaforma da tavolo | TMC | SERIE | |
| TMC Controllo delle vibrazioni Tavolo d'aria | TMC | 20 | |
| V1/I Raccoglitore di dati dell'elettrodo | Dagan | CA-1B | |
| MX10L | Siskiyou | MX10L | |
| Bagno/Guardia (I/V) Headstage (con connettori appropriati) | Dagan | parte del microscopio CA-1B | |
| Omano | OM2300S-JW11 | ||
| Bagno di controllo della temperatura | personalizzato o Dagan | personalizzato o Camera personalizzata HE-204C | realizzata con materiali di Cool Polymers (serie D). Dagan fornisce anche uno stadio pre-feabricato (HE-204C). |
| Contenitore per pellet AgCl personalizzato Elettrodo | personalizzato lavorato su misura | ||
| , pellet, 2,0 mm | Warner | E-206 | |
| Bagno di ovociti esterno | Personalizzato o Dagan | personalizzato o CC-1-T-LB | lavorato su misura o acquistato da Dagan |
| Bagno interno di ovociti | personalizzato o Dagan | personalizzato o CC-TG-ND | lavorato su misura o acquistato da Dagan |
| Capillari per ponti di agar ed elettrodi tirati | Warner | G150T-4 | |
| Supporti girevoli per microscopio, micromanipolatore e bagno | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Candeggina regolare | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Ovociti | Nasco | LM535M (femmine sessualmente mature) | |
| 90 Na+ Soluzione esterna | Vedere la scheda | ||
| 10 Na+ Soluzione interna | Vedere la scheda | ||
| 3 M KCL | Vedere la scheda | ||
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Vedere | la scheda delle soluzioni | ||
| Pipette di trasferimento da 5 ml | SciMart | GS-52 | |
| Iniettore di elettrodi KCl modificato | BD | 309659 | Punta della siringa in plastica fusa per consentire l'iniezione della soluzione negli elettrodi. In alternativa è possibile acquistare un Microfil di WPI. |
| Microvaccum | |||
| Custom Custom Pinze | VWR | 63040-458 | |
| Strumenti per la manipolazione degli ovociti (pompa per pipette) | VWR | 53502-222 | |
| Bottiglia di acqua deionizzata | VWR | 16649-911 | |
| Vaselina Vaselina Vaselina | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Materiali aggiuntivi necessari per le registrazioni VCF: | |||
| Microscopio VCF | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW Obiettivo NIR | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Sistema di traslazione per microscopi verticali a stadio fisso | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| Bagno di ovociti VCF esterno | personalizzato | Lavorato su misura. Le dimensioni della camera sono 2,7 x 1,9 x 0,4 cm. | |
| Bagno di ovociti VCF interno | su misura | . Le dimensioni della camera sono 1,6 x 1,6 x 0,4 cm. | |
| Bagno di controllo della temperatura modificato Camera | personalizzata realizzata con materiali di Cool Polymers (serie D). Le dimensioni della camera del bagno del regolatore di temperatura modificato sono 2,7 x 1,9 x 0,3 cm per la camera orizzontale e 1 x 2,5 x 0,5 cm per la camera verticale. |
Riferimenti
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol
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Ristampe e permessi
