Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Summary

Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato. Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Abstract

Molti tessuti, come i cuori umani adulti, non sono in grado di rigenerarsi in modo adeguato dopo un danno. ^2,3 Strategie di ingegneria dei tessuti propongono innovazioni per aiutare il corpo nel recupero e riparazione. Ad esempio, gli approcci TE possono essere in grado di attenuare il rimodellamento cardiaco dopo infarto miocardico (MI) e possibilmente aumentare la funzione cardiaca totale a un livello normale di MI-pre vicino. ⁴ Come con qualsiasi tessuto funzionale, la rigenerazione del tessuto cardiaco di successo comporta la corretta consegna dei più tipi di cellule con stimoli ambientali che favoriscono l'integrazione e la sopravvivenza del trapianto di cellule / tessuti impiantati. Tessuti ingegnerizzati dovrebbero affrontare più parametri tra cui: segnali solubili, cell-to-cell interazioni e materiali a matrice, calcolati come veicoli per le consegne, i loro effetti sulla sopravvivenza delle cellule, la forza materiale, e la facilitazione di organizzazione cellula-tessuto. Gli studi che utilizzano l'iniezione diretta di cellule madri per marze ignorare solo questi elementi essenziali. ^2,5,6Un design di tessuto che unisce questi ingredienti deve ancora essere sviluppato. Qui, presentiamo un esempio di design integrate con stratificazione di fogli di cellule fantasia con due tipi distinti di materiali biologici di derivazione contenenti il ​​tipo di cellule dell'organo bersaglio e le cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi nel "tessuto". Sebbene questi studi si concentrano sulla generazione di tessuto cardiaco-like, questo disegno tessuto può essere applicato a molti altri organi oltre cuore con minimi cambiamenti di design e materiali, ed è pensato per essere un prodotto off-the-shelf per terapie rigenerative. Il protocollo contiene cinque passaggi dettagliati. Una temperatura sensibile Poli (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) viene utilizzato per tessuti cappotto coltura piatti. Poi, le cellule del tessuto specifico sono coltivate sulla superficie delle piastre rivestite / superfici micropattern per formare fogli di cellule con forti aderenze laterali. In terzo luogo, una matrice di supporto è per il tessuto combinando matrice porosa con Permissi neovascolareve idrogel e cellule endoteliali. Infine, i fogli di cellule vengono sollevati dai piatti pNIPAAM rivestiti e trasferiti all'elemento di base, rendendo il costrutto completo.

Introduction

L'iniezione di cellule e/o singoli materiali da sola ha mostrato un successo variabile in altri sistemi di organi e un successo limitato nella rigenerazione cardiaca. ^5,7-12 Attualmente, le cellule derivate da cellule staminali vengono consegnate ai tessuti danneggiati utilizzando una varietà di metodi di consegna, tra cui: iniezione diretta di cellule nei tessuti e perfusione nell'afflusso di sangue. ^Altri hanno impiantato cellule da sole, materiali da soli e/o in combinazione con trasportatori di materiali per aiutare a rigenerare gli organi danneggiati. ^18-21 Questo design combina più strategie che forniscono resistenza del materiale, modelli in più materiali e più tipi di celle.

In particolare, la matrice fibrosa acellularizzata di base fornisce la forza fisica fondamentale al costrutto, rendendolo adatto per la sutura nel paziente, se necessario. Gli spazi vuoti nella matrice di base sono riempiti con cellule endoteliali in un idrogel neovascolare permissivo²² per stabilire rapidamente la vascolarizzazione del costrutto impiantato. Questo composito viene quindi integrato con fogli cellulari pre-modellati che consentono una migliore comunicazione da cellula a cellula, imitando più da vicino il tessuto nativo. ^1,23-25 Il processo di produzione complessivo per il cerotto cellulare stratificato è delineato dal diagramma di flusso nella Figura 1.

Protocol

1 Creazione di piatti pNIPAAM rivestite

1. Sciogliere 2.6 g di pNIPAAM in 2 ml di una soluzione di esano al 60% di toluene / 40%.
2. Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 min agitati, finché il pNIPAAM è disciolto.
3. Tagliare carta da filtro in un cerchio di diametro di 60 mm e carta posto in imbuto Buchner.
4. Filtrare la soluzione attraverso imbuto Buchner nel bicchiere di vetro pre-pesato (non usare la plastica, come esano si scioglierà la plastica).
5. Porre il bicchiere e contenuto in un vuoto campana (24 psi) O / N (16 ore). Nota: Fino a quando il residuo viene fatto reagire con isopropilico esso si ossida in modo da assicurarsi che non venga a contatto con l'ossigeno.
6. Pesare il becher per stabilire il peso del pNIPAAM.
7. Aggiungere alcool isopropilico al pNIPAAM, creando un 50/50 w / w soluzione.
8. Inserire 2 ml della soluzione sulla superficie della piastra di coltura tissutale, e cappotto per 5 min sotto luce UV.
9. Lavare la piastra con 2 ml di PBS caldo due volteprima di utilizzare per la coltura cellulare.

2 Creazione di fogli Cellulari

Nota: fogli di cellule primarie per l'organo bersaglio possono essere creati utilizzando una serie di metodi diversi, o da rivestimento di superfici di coltura di tessuti con polimero termo-sensibile come descritto qui. Lastre termo-sensibile pre-rivestiti sono offerti anche da un certo numero di fornitori.

Nota: Questo protocollo è per la cultura con un piatto da 35 mm. Brevemente, le cellule vengono incubate a 37 ° C per un minimo di 24 ore a confluenza per stabilire connessioni laterali tra celle adiacenti. Per rilasciare fogli cellulari, piastre vengono sottoposti a temperature inferiori a 32 ° C. Il foglio cella viene poi trasferito al forte matrice fibrosa base contenente un idrogel permissiva neovascolare con cellule endoteliali vascolari.

1. Isolare la popolazione cellulare. Nota: questo metodo dipende dai singoli procedimenti di derivazione e del tipo di cellule. Rat aortica mu lisciacellule SCLE (RASMC) sono utilizzati in questo esempio. Queste sono cellule muscolari lisce primarie isolate dall'aorta addominale di un topo.
2. Lavare le cellule con 2 ml di PBS caldo.
3. Aggiungere 3 ml di tripsina (o altro / soluzione dissociare scissione) alle cellule per 5 min.
4. Inibire la tripsina con l'aggiunta di 3 ml di terreno di coltura, o soluzione tampone fosfato (PBS) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS).
5. Raccogliere le cellule in un tubo conico e contare una aliquota.
6. Spin le cellule a 1000 rpm (228 xg) per 5 min.
7. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in loro mezzi di crescita (SmGM2 più kit proiettile terreno di coltura viene utilizzato per RASMC).
8. Posizionare i supporti contenenti le cellule su un piatto di 35 millimetri termo-sensibili - piastra rivestita pNIPAAM ad una concentrazione che permetterà di conseguire il 100% di confluenza. Nota: Per RASMCs quel numero è stato determinato in 100.000 cellule / cm ^2. Tuttavia, a causa della perdita di cellule durante il passaggio, 120% di detto va viene utilizzato lue.
9. Mettere in un incubatore a 37 ° CO / N. Nota: È importante mantenere le cellule a 37 ° C per mantenere l'adesione delle cellule alla piastra.

3 Preparazione di Matrix Foundational

Nota: Vari matrici fibrosi 3D possono essere usati per sovrapporre forte matrice fibrosa tra i fogli di cellule delicate. Alcuni esempi includono: Gelfoam, Bioglass, materiali naturali acellularized ²⁶ o nanospun materiali ^27,28 Il suina matrice vescica urinaria (UBM) utilizzati in questi studi è stato generosamente fornito dal nostro collaboratore, il dott Badylak ^29.

1. Prima dell'uso, determinare le caratteristiche della matrice, tra cui la mancanza di contenuto cellulare se si utilizza matrice decellularized, ^27,28 cellulare vitalità specifico, e lo spazio vuoto. ²²
2. Tagliare la matrice pre-sterilizzato in una dimensione e forma desiderata. Nota: Qui, un foro-perforazione è utilizzata per tagliare un cerchio del diametro di 4 mm.

ve_title "> 4. Semina cellule endoteliali in un Neovascolare Permissivo Hydrogel

Nota: Le cellule endoteliali possono essere ottenuti da una varietà di fonti, tra cui la differenziazione da cellule staminali o progenitrici. Qui, vengono utilizzati HUVECs.

1. Utilizzare qualsiasi idrogel permissiva (fibrina, gel di collagene) fintanto che il tempo di reticolazione è abbastanza breve da consentire alle cellule rimangono vitali. Nota: Qui, un gel Hyaluronan (HA) basato reticolato con viene utilizzato un ponte disolfuro.
2. Preparare l'idrogel HA in conformità con il protocollo aziendale.
3. Raccogliere le cellule endoteliali e disperdersi in una soluzione singola cella utilizzando tripsina 1x. Nota: Accutase o cellulare Dissociazione Buffer potrebbero essere utilizzati anche per la dispersione singola cellula.
4. Disattivare l'enzima tripsina utilizzando una pari quantità di inibitore della tripsina di soia (se è importante che le cellule non vengano a contatto con il siero) o 10% FBS in PBS, raccogliendo la soluzione / cellule in un tubo da 15 ml.
5. Count le cellule, e calcolare il volume necessario per le dimensioni delle patch (precedentemente quantificato). Nota: Per una patch a 4 mm, sono usati qui 2 milioni di cellule endoteliali.
6. Estrarre 2 milioni di cellule, e inserire in un nuovo tubo da 15 ml.
7. Spin a (228 xg) per 5 min.
8. Aspirare il supernatante, lasciando le cellule come pellet in un tubo conico.
9. Mescolare i materiali liquidi HA e la gelatina in un 1: 1 razione. Aggiungere quindi 80% del volume totale nel tubo conico contenente il pellet.
10. Risospendere le cellule endoteliali nella miscela 1: 1 HA / gelatina
11. Posizionare le cellule in sospensione nella miscela HA / gelatina nella base matrice fibrosa dal punto 2.
12. Aggiungere 1/5 (20 percento) del volume totale desiderata del cross-linker
13. Incubare per 1 ora a 37 ° C.

5 Isolamento di fogli Cellulari

1. Rimuovere le piastre 35 millimetri pNIPAAM trattati contenenti le cellule dal incubatore e posto in una cappa di coltura cellulare aRT.
2. Aspirare rapidamente il supporto dalle cellule, e aggiungere 2 ml di 6% di gelatina normale che è stato riscaldato a 37 ° C.
3. Mentre la gelatina è ancora caldo, posizionare il reticolo di metallo nella gelatina, immergendo sotto la superficie della gelatina normale (Film 1).
4. Inserire l'intera piastra su ghiaccio per 5 a 7 minuti, consentendo la gelatina per indurire.
5. Dopo 7 minuti, utilizzare una spatola per separare accuratamente i bordi gelatina dal lato della piastra, e quindi utilizzare pinze per sollevare la grata metallica dalla piastra Nota: La gelatina 6%, e il foglio di cella deve sollevare con il reticolo.
6. Spostare il foglio cella al piatto e posto sulla sommità della combinazione matrice idrogel di base fibrosa, impostando attentamente il reticolo sopra il costrutto. Nota: La parte apicale dello strato di cellule sarà ancora in prima posizione.
7. Aggiungere 2 ml di supporti caldo (37 ° C).
8. Incubare O / N consentendo il foglio di cellule di aderire alla superficie idrogel.
9. Rimuovere tegli reticolo di metallo dopo la soluzione si riscalda (circa 1 ora), o il giorno successivo.

Results

Il diagramma di flusso (figura 1) illustra il metodo generale di rendere la patch multistrato. Fogli cellulari sono staccati dalla piastra trattata pNIPAAM facendo cadere la temperatura sotto i 32 ° C. Poi il foglio cella è posto in cima al idrogel reticolato contenente le cellule endoteliali seminate nella matrice fibrosa sottostante (Figura 1). Le piastre termosensibili pretrattati possono essere utilizzati anche per creare i fogli di cellule. Superfici speciali topologiche sono usati...

Discussion

I passaggi critici nel protocollo comprendono: rivestimento delle superfici delle piastre con il polimero thermoresponsive e manipolare i fogli di cellule dopo il raffreddamento delle piastre. Poiché le cellule differenti presentano differenti proprietà fisiche, come adesività, il tempo di sollevamento deve essere ottimizzata per ogni tipo di cellula diversa. Il secondo, e più significativamente impegnativo componente di questo protocollo, incentrata sulla manipolazione dello strato di cellule, un aspetto critico di met...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Cellule muscolari lisce dell'aorta di ratto
SmGM2	Lonza	CC-4149	Media muscolare liscia
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Cellule endoteliali venose umane
HyStem	Glycosan/ Biotime
Alcool isopropilico	VWR International	BDH1133-4LP
Tripsina	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Attrezzatura specifica
Carta da filtro	Ahlstrom	6310-0900
Imbuto Buchner	Sigma Aldrich	Z247308
Piastre UpCell	Nunc	2014-11
Luce UV	Jelight Company	Pulitore UVO Modello n.42