Simulazione pancreatica neuroplasticità:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurone Plasticità Assay

Sommario

Plasticità neuronale è una caratteristica del tratto gastrointestinale (GI) sempre più riconosciuta, ma non sufficientemente compreso. Qui, nell'esempio di disturbi pancreatici umani, presentiamo un neuroplasticity saggio in vitro per lo studio della plasticità neuronale nel tratto GI a livello sia morfologica e funzionale.

Abstract

Neuroplasticità è una caratteristica intrinseca del sistema e gastrointestinale (GI) innervazione nervoso enterico in condizioni patologiche. Tuttavia, il ruolo fisiopatologico delle neuroplasticità nei disturbi gastrointestinali rimane sconosciuto. Nuovi modelli sperimentali che consentono la simulazione e la modulazione di GI neuroplasticità possono consentire maggiore apprezzamento per il contributo della neuroplasticità in particolare le malattie gastrointestinali come il cancro del pancreas (PCA) e pancreatite cronica (CP). Qui vi presentiamo un protocollo per la simulazione della neuroplasticità del pancreas in condizioni in vitro utilizzando neonato gangli delle radici dorsali di ratto (DRG) e plesso mioenterico (MP) neuroni. Questo approccio dual-neurone permette non solo il controllo di entrambi neuroplasticità organo intrinseca ed estrinseca-, ma rappresenta anche un valido strumento per valutare la morfologia neuronale e gliale e di elettrofisiologia. Inoltre, consente la modulazione funzionale dei contenuti del microambiente forniti per studiare la loro IMPACt sulla neuroplasticità. Una volta stabilito, il presente saggio neuroplasticity porta il potenziale di essere applicabile allo studio della neuroplasticità in qualsiasi organo GI.

Introduzione

Alterazioni nei gastrointestinale (GI) morfologia del nervo e la densità hanno catturato l'attenzione di gastroenterologi e patologi per molto tempo, ma la loro rilevanza per la fisiopatologia delle malattie gastrointestinali rimane sconosciuta ^1-3. Infatti, alcuni disturbi gastrointestinali molto comuni come la gastrite, esofagite da reflusso, colite, diverticolite e appendicite sono associati ad un aumento della densità innervazione nelle aree di tessuto infiammato ^1. Tuttavia, nessuna vera attenzione è stata finora versati ai meccanismi e significato della neuroplasticità nel tratto GI. Sei nervi GI morfologicamente alterati differiscono dalle normali nervi GI, cioè lo stato normale del sistema nervoso enterico, in termini della loro funzione? Quali sono le implicazioni di alterata contenuti neuropeptide / neurotrasmettitore nei nervi enterici di plastica? Fa neuroplasticità periferica comporta sempre la segnalazione alterata al sistema nervoso centrale? E dove sono le proiezioni centrali di Extri plasticaNSIC percorsi neurali GI? Una lunga serie di questioni fondamentali possono essere facilmente generati quando si guarda la scarsità delle nostre conoscenze sugli aspetti funzionali di GI neuroplasticità.

Lo studio di GI neuroplasticità a livello funzionale richiede modelli sperimentali validi, riproducibili e ancora facilmente applicabili. In un'epoca di crescente popolarità e l'accettazione di modelli geneticamente condizionato mouse (GECoMM), come nelle impostazioni vivo portano il potenziale per chiarire gli aspetti sconosciuti di GI neuroplasticità in modo realistico ^1. Tuttavia, la progettazione e la produzione di GECoMM resta costoso, alta intensità di lavoro e, soprattutto, in termini di tempo. Inoltre, essi richiedono a priori selezione del bersaglio da condizionale modulato nel topo geneticamente alterato (ad es transgenico sovraespressione del fattore di crescita nervoso / NGF in cellule epiteliali enterici). Quindi, per il design di un GECoMM di successo, i ricercatori hanno bisogno di alcuni indicatori (ad esempio, dati sperimentali precedenti) di un obiettivo utile, vale a dire che la molecola di interesse (qui NGF) può almeno aspettare di esercitare alcuni effetti biologicamente rilevanti sui nervi GI.

Tali indicatori possono essere facilmente derivate da adeguata in modelli in vitro in cui sottotipi di cellule isolate dal complesso microambiente di un sistema in vivo possono essere selettivamente co-coltivate in maniera eterotipica ^4-7. La modulazione di bersagli molecolari in un tale ambiente cultura eterotipica è in media tecnicamente meno ingombrante, più veloce, e può quindi aiutare nella prefiltraggio degli obiettivi validi per la verifica in studi in vivo.

Recentemente, abbiamo presentato un test in vitro neuroplasticità in cui è stato progettato per simulare la maggiore densità neurale e ipertrofia delle ne intrapancreaticarves nel cancro del pancreas umano (PCA) e pancreatite cronica (CP) tessuti. Qui, i neuroni derivati ​​da neonato di ratto gangli spinali (DRG) o plesso mioenterico (MP) sono stati esposti a estratti di tessuto da PCa chirurgicamente asportato o CP tessuti esemplari e rispetto a quelle coltivate in normali pancreas umano (NP) estratti di tessuto ^5. Invece di estratti di tessuto, si può anche utilizzare supernatanti della linea cellulare di studiare l'impatto di tipi cellulari selezionati TG. Quando combinato con una misurazione morfometrica standardizzato, il saggio neuroplasticità presentata consente di valutare valido e riproducibile di plasticità neuronale in risposta a diversi microambienti pancreatiche. In particolare, esso consente la simulazione di 1) neuroplasticity morfologica, cioè i cambiamenti nella crescita dei neuriti, ramificazione e dimensione neuronale, e 2) neuroplasticity funzionale, cioè alterazioni nella eccitabilità dei neuroni periferici. Inoltre, non solo periferica ( Enterico), ma anche centrale (es. DRG o spinale secondo ordine) neuroni possono essere incluse nella presente saggio per valutare la loro reazione morfologica e funzionale a diversi contenuti di tessuto GI. Nel presente tutorial video, dimostriamo il protocollo tecnico per l'esecuzione di questo saggio e discutere i suoi vantaggi e debolezze. Inoltre, attiriamo l'attenzione sulla applicabilità del concetto di base di questo test allo studio della neuroplasticità in qualsiasi organo GI.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali animali nel protocollo seguono le linee guida per la cura degli animali della Technische Universität München, Germania.

1. Media / Estratto di preparazione

1. Tissue omogeneizzazione
   La qualità di omogeneizzazione tessuto è fondamentale per la successiva rivelazione di alterazioni neuroplastici nei neuroni in coltura. Qui, un omogeneizzatore è raccomandato che consente dissociazione tessuto senza grande aumento della temperatura del tessuto.
   1. Trasferire 5 x 5 mm x 5 mm cubi di tessuto pancreatico direttamente da -80 ° C in azoto liquido e posto in una fase solida nel homogenator tessuto. Il homogenator ideale sarebbe dissociare il tessuto abbastanza veloce, senza farlo scongelare.
   2. Subito dopo dissociazione, risospendere il solido, omogenato polverulenti in 300-500 ml di 0.1x tampone fosfato salino (PBS). Qui, non utilizzare alcun tampone di lisi (come RIPA), in quanto puo 'lisi i neuroni.
   3. Centrifugare le omogeneizzati per almeno 15 minuti alla velocità massima del centrifuga da banco (es. 21.130 xg). Raccogliere il surnatante chiaro che rappresenta l'estratto del tessuto.
2. Supernatanti della linea cellulare
   1. Lasciate che le cellule di interesse raggiungono almeno il 70-80% di confluenza nel normale terreno di crescita.
   2. Di solito, questi mezzi contengono componenti siero e possono esercitare effetti incontrollabili sulla crescita neuronale. Pertanto, dopo aver raggiunto la densità cellulare desiderato, lavare le cellule almeno 3x con la coltura cellulare grade PBS e metterli in mezzo privo di siero (SFM) per un massimo di 48 ore.
      Nota: Qui, ritengono che alcune cellule (come le cellule stellate pancreatiche) possono avere bisogno di siero nel loro terreni di crescita, al fine di mantenere il loro stato e la struttura normale. In tali casi, eseguire diluizioni seriali di siero nel mezzo della cella di interesse al fine di trovare il possibile contenuto siero minima necessaria per funzio cellula intattan.
   3. Misurare la concentrazione proteica del tessuto omogenato o surnatanti cellulari tramite Bradford protein assay. Mentre questi valori variano a seconda del tipo di tessuto e di cellule, per gli estratti di tessuto pancreatico, ci si aspetterebbe un intervallo di concentrazione tra 5-12 mg / mL, e per supernatanti della linea cellulare tra 3-8 mg / mL.

2. Aliquota Estratti e surnatanti cellulari

A seconda della concentrazione da utilizzare nel saggio, la concentrazione finale dell'estratto o surnatante nel mezzo neuronale dovrebbe essere 100 pg / ml ^5,8.

Nota: Per un saggio con i neuroni crescono in 500 microlitri di media in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, uno ha bisogno di 50 mg di proteina da ogni estratto o surnatante per pozzetto. In una tipica concentrazione estratto di circa 10 mg / mL, uno avrebbe bisogno 5 ml di estratto / surnatante per ciascun bene. In ogni Setting esibito come triplice copia, questo corrisponderebbe a 15 ml di estratto / surnatante. Per i diversi tipi di tessuti o cellule, eseguire diluizioni seriali dell'estratto finale o la concentrazione surnatante e confrontare gli effetti neurotrofici osservati tra le diverse concentrazioni di estratto / surnatante.

3. Isolamento di neuroni

Dopo la raccolta estratto / supernatante è finito, proseguire con isolamento di neuroni.

1. Per neuroni DRG, raccogliere la cervicale lombare DRG di ratto appena nati tra il giorno postnatale (P) 2-12 dopo la decapitazione e la dissezione stereomicroscopio di DRG (Figura 1A). Al fine di avere i neuroni DRG sufficienti per una piastra a 24 pozzetti, raccogliere tutte cervicale per lombare DRG di un ratto neonato (pari a 52 DRG) per piastra.
   1. Tagliare la periferica (neurale) e le proiezioni centrali (radici) di DRG per mezzo di microscissors.
      Lasciando le proiezioni in luogo impedisce triturazione e aumenta tegli contaminazione rischio di cultura da parte dei fibroblasti.
2. Per neuroni MP, tagliare via il mesentere dal piccolo intestino e manualmente e togliere accuratamente lo strato seromuscular del piccolo intestino (per un protocollo dettagliato sull'isolamento MP, consultare Schäfer et al. ^9, Figura 1B). Per MP, raccogliere il plesso di due ratti per 24 pozzetti.
   Nota: Cercate di essere i più dolci possibili al fine di evitare strappi nel livello seromuscular in quanto impediscono la sua separazione con successo dal piccolo intestino.
3. Raccogliere il DRG e lo strato seromuscular in terreno minimo essenziale ghiacciata (MEM) fornito con gentamicina (20 mg in mezzo 500ml) e metronidazolo (2,5 mg in 500 ml di mezzo).
4. Dopo la raccolta di DRG, incubare in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) fornito con collagenasi di tipo II per 20-30 min. Per l'isolamento MP, incubare in collagenasi tipo fra 1-3 ore, a seconda dell'etàdell'animale (Figura 1C).
5. Per MP, raccogliere i MP pezzi netti come sotto stereomicroscopio e trasferimento MEM ghiacciata.
6. Poi triturare il DRG e MP attraverso siringhe con diametro decrescente.
   Nota: triturazione eccessiva può distruggere i neuroni, ma al netto delle cellule gliali.
7. Una volta che il terreno contenente il DRG o MP è diventata torbida, centrifugare la sospensione a 93,9 xg per 5 min, eliminare il mezzo e risospendere in Neurobasal medio (integrato con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, L-glutamina 0,5 mm e 2% B-27).
8. Contare il numero totale di cellule (cioè neuroni e glia) mediante un emocitometro.
   Nota: Il numero di cellule necessarie dipende dal parametro di misura. Per la quantificazione della densità neurite, bisogna culture più dense e quindi un maggior numero di cellule che per la misura della crescita dei neuriti, dimensione perikaryonale la ramificazione modello di singoli neuroni. Per le misurazioni della densità dei neuriti, utilizzare ad esempio 10.000 cellule (neuroni + glia) e / o di 1.500 neuroni / e. Per la morfometria su singoli neuroni, breve (1 minuto a lungo) trypsination delle cellule e semina di cellule 2.500 / e o 400 neuroni / bene è raccomandato. La resa tipica di cellule ottenute da un ratto è di circa 300.000-500.000 cellule.
9. Seed le cellule su 13 vetrini mm che sono state rivestite la sera prima e l'alto i pozzetti con Neurobasal medio (integrato con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 0.5 mM L-glutammina e il 2% B-27) (Figura 1D).
   Nota: Utilizzare poli-D-lisina (40 mg / m ²⁾ OR-ornitina e scivola copertura laminina rivestite (1 mg / ml ciascuna) rivestito. Cellule attribuiscono alla poli-D-lisina estremamente veloce, rendendo così adatto per esperimenti che richiedono molte cellule (cioè misurazioni di densità neurite). L'attaccamento al laminina è in qualche generalequello più debole, ma laminina è un forte promotore di crescita dei neuriti. Pertanto, per misure su ramificazione neuronale e la lunghezza dei neuriti, preferire ornitina / laminina-coating.
10. Consentire alle cellule attribuiscono ai pozzetti durante la notte. Il giorno successivo, preparare il dispositivo estratto supplementato (ad una concentrazione finale estratto / supernatante di 100 pg / ml).
11. Aspirare il mezzo semina, ed eseguire, lavaggio molto delicato opzionale con PBS, e poi lentamente pipetta media estrarre / surnatante-integrato (Figura 1E).
12. Lasciate che le cellule crescono per 48 ore. Aspirare i media e fissare nel 4% paraformaldeide per immunoistochimica (Figura 1F).
13. Eseguire doppia immunofluorescenza utilizzando neurone-specifico (ad esempio beta-tubulina III) e glia-specifica (ad esempio gliale fibriallary proteina acida / GFAP) marcatori (Figura 1G).
14. Per morfometria, utilizzare un microscopio ottico invertito dotato di una fotocamera CCD in combinazione with software automatizzato che consente la misurazione della densità dei neuriti (vedi tabella).
15. La densità neurite delle culture neuronali viene misurata su 4-5 microfotografie rappresentative a 200x ingrandimenti da 4 diverse regioni di crescita più densa su ogni vetrino sovrapponendo 50 micron x 50 micron griglia e contare la densità delle fibre per metro quadrato misurato in fibre di intersezione. Crescita dei neuriti, il numero di sportelli per neurone dire, la lunghezza del ramo media e la dimensione perikaryonal possono essere misurati da selezionati in modo casuale 30 neuroni solitarie di ogni vetrino contrassegnando le neuriti e perikarya (Figura 1H).

Risultati

Neuroplasticità morfologica

Nella fascia di età indicata di ratti neonati (P2-12) e le densità di semina, MP e DRG neuroni già costruiscono reti neuronali dense dopo 48 ore (Figura 2A). Confronto di densità neurite tra neuroni coltivati ​​in CaP, CP, e estratti NP rivela maggiore densità neuriti dei neuroni DRG PCA o estratti CP rispetto estratti NP (Figura 2A) ^5. Abbiamo particolarmente preferiamo i neuroni MP per misure su singoli neuro...

Discussione

Il presente protocollo ha lo scopo di illustrare la metodologia alla base del pancreas test neuroplasticità in vitro che è stato sviluppato recentemente dal nostro gruppo per studiare i meccanismi di neuroplasticità in PCa e CP ^5. Il protocollo prevede una procedura in tre giorni, che può essere facilmente applicato una volta l'artista ha maturato un'esperienza sufficiente per l'isolamento e la cultura del DRG e MP neuroni. Inoltre, esso rappresenta un valido strumento per studiare la rea...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bromidrato di poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P1149
Ornitina/laminina	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Vetrini coprioggetti	Merck		Per l'uso in piastre a 24 pozzetti
Dismembranator S	Sartorius
Anticorpo anti-beta-III-tubulina	Millipore	MAB1637	concentrazione 1:200
Anticorpo anti-GFAP	DAKO	M0761	Concentrazione 1:400
Tampone RIPA + inibitore			Qualsiasi fornitore
Mezzo neurobasale	Gibco/Life Sciences	21103-049
Integratore di B-27	Gibco/Life Sciences	17504044	La qualità del B-27 è nota per dipendere dal numero di lotto
Gentamicina/Metronidazolo			Qualsiasi fornitore
Minimo essenziale medium	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133 Migliora l'attività della collagenasi quando contiene Ca/Mg
Collagenasi di tipo II	Worthington Biochemical	CLS-2	Ottenere lotti con almeno 200 U/mg
di attività Tripsina-EDTA 0,25%	Gibco/Life Sciences	25200056
4% Paraformaldeide			Qualsiasi fornitore
analizza software	Olympus

della proteasi