In vitro aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di Streptococcus pneumoniae di monostrati di cellule epiteliali e di indagare potenziali interventi quali l'uso di probiotici per inibire la colonizzazione pneumococcica.
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Articolo metodologico
Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'aderenza di Streptococcus pneumoniae (pneumococco) al rivestimento epiteliale del rinofaringe può provocare colonizzazione ed è considerato un prerequisito per infezioni pneumococciche quali polmonite e otite media. Saggi in vitro di aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di pneumococchi a cellule epiteliali monostrati e di indagare potenziali interventi, come l'uso di probiotici, per inibire la colonizzazione pneumococcica. Il protocollo qui descritto viene usato per studiare gli effetti della salivarius Streptococcus probiotico dall'adesione dei pneumococchi alla linea cellulare epiteliale umano CCL-23 (talvolta indicato come cellule HEp-2). Il test prevede tre fasi principali: 1) la preparazione delle cellule epiteliali e batteriche, 2) l'aggiunta di batteri per monostrati di cellule epiteliali, e 3) individuazione di pneumococchi aderenti da conte vitali (diluizione seriale e placcatura) o quantitativa real-time PCR (qPCR ). Questo technique è relativamente semplice e non richiede attrezzature specializzate diverso da una configurazione coltura tissutale. Il test può essere usato per testare altre specie probiotiche e / o potenziali inibitori di colonizzazione da pneumococco e può essere facilmente modificato per affrontare altre questioni scientifiche riguardanti l'adesione pneumococcica e l'invasione.
Introduzione
Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è un batterio Gram-positivi che possono causare infezioni, tra cui la polmonite, otite media, e la meningite. E 'una delle principali cause di malattia nei bambini nei paesi a basso reddito e responsabile di circa 800.000 decessi di bambini sotto i cinque anni ogni anno 1. Pneumococchi sono spesso effettuato nel nasofaringe dei bambini. Sebbene questa colonizzazione è generalmente considerato asintomatica, precede infezione pneumococcica e funge da serbatoio per i batteri in popolazioni umane 2. Vaccinazione pneumococcico coniugato riduce efficacemente il trasporto dei sierotipi contenuti nel v....
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Protocollo
1. Preparazione delle cellule epiteliali e batteriche
- Scongelamento dei CCL-23 cellule epiteliali
- Preriscaldare Minimum Essential media (MEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) in un bagno d'acqua a 37 ° C per ~ 30 min.
- Sterilizzare l'armadio biosicurezza cultura approvato tessuto con luce UV per almeno 10 minuti prima dell'uso, e pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo. Pulire la bottiglia mezzi riscaldato con il 70% di etanolo e posto in armadietto biosicurezza.
- Usando una pipetta 25 ml, trasferire 14 ml di mezzo in un matraccio T-75. Porre pallone nel 37 ° C incubatore mentre le c....
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Risultati
I risultati di un esperimento rappresentativo in cui pneumococchi (S. pneumoniae PMP843, un colonizzando 19F isolare) sono stati aggiunti al CCL-23 cellule 1 ora dopo l'aggiunta di S. salivarius, e l'adesione pneumococcica è stata quantificata sia conta vitale e Lyta qPCR sono mostrati in Tabella 2. risultati erano coerenti tra i due metodi sia per il numero assoluto di batteri (presentato come CFU / ml) e l'aderenza%, normalizzato al numero pneumococchi di aderent.......
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Discussione
Una parte critica di questo saggio è l'aggiunta concentrazioni appropriate di S. salivarius e pneumococchi nelle sezioni 3.1.7 e 3.1.12. Le concentrazioni sono stimate utilizzando le letture di OD, ma l'inoculo esatto non sono determinati fino piastre vengono conteggiati il giorno seguente. Per questo motivo, si consiglia di eseguire curve di crescita per misurare OD e conta vitali (CFU / ml) nel tempo per tutti i ceppi batterici utilizzati nel test per identificare la fase di mid-log e assistere nell.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Murdoch Childrens Research Institute e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreni minimi essenziali (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | |
| T-75 Fiaschetta | Nunc | 156472 | |
| Celle CCL-23 | ATCC | CCL-23 | |
| Tecnologie per la vita della tripsina | 15090046 | ||
| Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti | Nunc | 142475 | |
| Piastre di agar di sangue di cavallo (HBA) | Oxoid | PP2001 | Piastre di agar di sangue di pecora accettabili anche |
| Todd-Hewitt Brodo | Oxoid | CM0189 | |
| Estratto di lievito | Beckton Dickinson | 212750 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Cuvette monouso | Kartell | 1938 | |
| L'eparina | Pfizer | 2112105 | è disponibile in fiale sterili da 5.000 UI/5m/ |
| Spalmatore sterile | Technoplas | S10805050 | alternativamente, uno spandiconcime di vetro può essere immerso in etanolo al 96% e sterilizzato a fiamma prima di ogni utilizzo |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Mutanolisina | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| proteinasi K | Qiagen | 19133 | |
| Soluzione SDS 20% | Ambion | AM9820 | |
| RNasi A | Qiagen | 19101 | |
| Mini-kit QIAamp DNA (250) | Qiagen | 51306 | |
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | made | 5' -> 3' sequenza ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequenza TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT |
| LytA sonda | Eurogentec | Su misura | 5' -> 3' sequenza Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, è possibile utilizzare fluorofori alternativi |
| Acqua priva di nucleasi | Ambion | AM9906 | |
| Mastermix QPCR ultra veloce Brilliant III | Agilent Technologies | 600880 | |
| Piastra di rilevamento Thermo-Fast 96 | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | |
| Strisce di tappi qPCR ultratrasparenti | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | |
| Sistema QPCR Mx3005 | Tecnologie Agilent 401449 | ||
| *fonti alternative sono disponibili per la maggior parte/tutti i prodotti elencati |
Riferimenti
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colo....
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Ristampe e permessi
