Articolo metodologico

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un In Vitro Aderenza Assay

DOI:

10.3791/51069

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28 aprile 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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In vitro aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di Streptococcus pneumoniae di monostrati di cellule epiteliali e di indagare potenziali interventi quali l'uso di probiotici per inibire la colonizzazione pneumococcica.

Abstract

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L'aderenza di Streptococcus pneumoniae (pneumococco) al rivestimento epiteliale del rinofaringe può provocare colonizzazione ed è considerato un prerequisito per infezioni pneumococciche quali polmonite e otite media. Saggi in vitro di aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di pneumococchi a cellule epiteliali monostrati e di indagare potenziali interventi, come l'uso di probiotici, per inibire la colonizzazione pneumococcica. Il protocollo qui descritto viene usato per studiare gli effetti della salivarius Streptococcus probiotico dall'adesione dei pneumococchi alla linea cellulare epiteliale umano CCL-23 (talvolta indicato come cellule HEp-2). Il test prevede tre fasi principali: 1) la preparazione delle cellule epiteliali e batteriche, 2) l'aggiunta di batteri per monostrati di cellule epiteliali, e 3) individuazione di pneumococchi aderenti da conte vitali (diluizione seriale e placcatura) o quantitativa real-time PCR (qPCR ). Questo technique è relativamente semplice e non richiede attrezzature specializzate diverso da una configurazione coltura tissutale. Il test può essere usato per testare altre specie probiotiche e / o potenziali inibitori di colonizzazione da pneumococco e può essere facilmente modificato per affrontare altre questioni scientifiche riguardanti l'adesione pneumococcica e l'invasione.

Introduzione

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Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è un batterio Gram-positivi che possono causare infezioni, tra cui la polmonite, otite media, e la meningite. E 'una delle principali cause di malattia nei bambini nei paesi a basso reddito e responsabile di circa 800.000 decessi di bambini sotto i cinque anni ogni anno 1. Pneumococchi sono spesso effettuato nel nasofaringe dei bambini. Sebbene questa colonizzazione è generalmente considerato asintomatica, precede infezione pneumococcica e funge da serbatoio per i batteri in popolazioni umane 2. Vaccinazione pneumococcico coniugato riduce efficacemente il trasporto dei sierotipi contenuti nel vaccino. Tuttavia, ci sono più di 90 sierotipi di pneumococco, e la vaccinazione può portare alla sostituzione sierotipo, per cui l'eliminazione dei sierotipi del vaccino è seguita da un aumento della carrozza e malattia causata da sierotipi non vaccinali 3. Inoltre, in alcune popolazioni ad alto rischio, pneumococcocolonizzazione si verifica spesso molto presto nella vita, prima della somministrazione della prima dose di vaccino di 4,5. Recentemente, l'uso di probiotici è stata proposta come una strategia aggiuntiva per inibire pneumococcica colonizzazione 6,7. Saggi in vitro di aderenza sono stati utilizzati per esaminare l'adesione pneumococcica 8,9. Questi test sono stati adattati per studiare l'impatto del probiotico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sull'adesione pneumococcica 10.

Oltre a LGG e altri batteri lattici, Streptococcus salivarius, residente comune della cavità orale, è stato studiato come potenziale probiotico per le vie respiratorie a causa della sua potenziale colonizzazione e capacità di inibire pneumococchi e altri patogeni respiratori in vitro 11 - 13. Il protocollo presentato qui descrive un test aderenza utilizzato per studiare gli effetti di S. salivarius K12 sul rispetto pneumococcoalla linea cellulare epiteliale umano CCL-23. Prima di usare nel saggio, isolati pneumococco sono stati valutati per le capacità di aderenza, come la crescita e le proprietà di aderenza può variare notevolmente tra gli isolati 10,14. Curve di crescita di pneumococchi e S. salivarius sono stati eseguiti per determinare fase mid-log e concentrazione stima (unità formanti colonie o CFU / ml) di densità ottica (OD, Figura 1). Si raccomanda di esaminare crescita conteggio e OD valida per ogni isolato prima dell'uso nel saggio. Questa analisi può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con impianti di coltura di tessuti standard e attrezzature. In questo protocollo, gli effetti di tre dosi di S. salivarius somministrato 1 ora prima dell'aggiunta di pneumococchi sull'aderenza di S. pneumoniae PMP843, un sierotipo 19F carrozza isolato derivata da un tampone nasofaringeo, sono esaminati. Due modi diversi di quantificare pneumococchi aderenti sono presentati: placcatura su agar sangue per scoraggiareil mio conte vitali, e l'estrazione del DNA e la rilevazione del pneumococco LYTA gene da qPCR 15. Il protocollo di base saggio aderenza può essere facilmente modificato per testare diverse dosi o tempo di somministrazione di probiotici e può essere utilizzato anche con altri ceppi batterici o specie.

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Protocollo

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1. Preparazione delle cellule epiteliali e batteriche

  1. Scongelamento dei CCL-23 cellule epiteliali
    1. Preriscaldare Minimum Essential media (MEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) in un bagno d'acqua a 37 ° C per ~ 30 min.
    2. Sterilizzare l'armadio biosicurezza cultura approvato tessuto con luce UV per almeno 10 minuti prima dell'uso, e pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo. Pulire la bottiglia mezzi riscaldato con il 70% di etanolo e posto in armadietto biosicurezza.
    3. Usando una pipetta 25 ml, trasferire 14 ml di mezzo in un matraccio T-75. Porre pallone nel 37 ° C incubatore mentre le cellule sono sciolgono (paragrafo 1.1.4).
    4. Rimuovere una fiala di CCL-23 cellule di stoccaggio di azoto liquido mediante opportune misure di sicurezza e caldo in un bagno di acqua a 37 ° C fino a ~ 80% scongelati.
    5. Ritorno il pallone preparato in sezione 1.1.3 per l'armadio biosicurezza. Pulire la superficie esterna del flacone di CCL-23 cellule con etanolo al 70% e contenuto di trasferimento (1 ml) in T-75 Pallone con una pipetta P1000.
    6. Incubare la beuta su un lato a 37 ° C, 5% CO 2, 95% umidità relativa tessuto cultura incubatore notte (16-20 ore).
    7. Controllare le cellule al microscopio per confermare una morfologia sano, rimuovere il supporto e sostituire con 15 ml freschi, preriscaldata MEM + 10% FBS.
  2. Manutenzione di CCL-23 cellule epiteliali
    1. Una volta che le cellule sono ~ 80% confluenti (1-2 giorni), il passaggio rimuovendo multimediale utilizzando una pipetta 25 ml e lavare delicatamente le cellule due volte con 8-10 ml preriscaldata tampone fosfato (PBS) usando una pipetta 10 ml.
    2. Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di soluzione sterile 0,25% tripsina-EDTA (0,25% (w / v) tripsina, 0,1 mM EDTA). Ruotare pallone su un fianco, ruotare garantire tripsina copre lo strato confluente di cellule, e incubare la beuta per 2-3 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
    3. Pallone di tornare al cabinet biosicurezza, aggiungere 9 ml preriscaldata MEM + 10% FBS, e pipetta su e giù 6 -8x per risospendere le cellule, espellere liquido verso il lato del matraccio a staccare le cellule.
    4. Celle divise 1:15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) o 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), scartano cellule in eccesso, e ritornano pallone 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
    5. Passaggio cellule almeno due volte prima di usare nel saggio aderenza. Tipicamente le cellule vengono suddivisi ogni 3-4 giorni.
  3. Semina del CCL-23 cellule epiteliali (un giorno prima rispettare nell'ambito del dosaggio, protocollo 2)
    1. Split cellule confluenti, come descritto nelle sezioni 1.2.1-1.2.3, risospensione in MEM preriscaldata + 5% FBS (concentrazione di FBS si abbassa per ridurre la probabilità di componenti del siero che interferiscono nel dosaggio). Rimuovere 20 ml di cellule e contare utilizzando trypan colorazione blu e un emocitometro.
    2. Diluire le cellule nel preriscaldata MEM + 5% FBS ad una concentrazione di 1,5 x 10 5 cellule / ml in una provetta sterile da 50 ml.
    3. Seme 1 ml di cellule / pozzetto in un tessuto-Coltura trattata piastra da 24 pozzetti.
  4. Preparazione di batteri
    Questa procedura può essere seguita per la preparazione di pneumococchi e S. salivarius. Mezzi di crescita batterica è solitamente conservata in un incubatore a 37 ° C durante la notte per Preriscaldare e prova di sterilità (generalmente appare torbida se contaminata).
    1. Due giorni prima, a rispettare saggio, batteri striscia a cavallo del sangue agar (HBA) piastre e incubare a 35-37 ° C e 5% di CO 2 per 18-24 ore. Agar sangue di montone può essere utilizzato in alternativa.
    2. Il giorno seguente, preparare una coltura durante la notte per ciascuna specie batteriche pipettando 10 ml Todd-Hewitt Broth con 0,5% di estratto di lievito (THB + YE) medio in una provetta sterile da 30 ml. Utilizzando un ciclo 10 microlitri, inoculare circa 10-12 colonie ben separate. Brevemente vortex e incubare a 35-37 ° C e 5% di CO 2 per 14-16 ore. Si noti che pneumococchi si autolyze se lasciato troppo a lungo in brodo di coltura.

2 Aderenza saggio:. Aggiunta di batteri di monostrati di cellule epiteliali

  1. Preparazione di mid-log colture batteriche di pneumococchi e S. salivarius
    1. Pipettare 10 ml di preriscaldata THB + YE in ciascuno dei due sterili da 30 ml tubi, uno pneumococchi etichettati e l'altro S. salivarius.
    2. Per raggiungere fase di mid-log, pneumococchi richiede ~ 3 ore e S. salivarius richiede ~ 2 ore di incubazione (vedi Figura 1). Inizia entrambe le culture allo stesso tempo. Vortex (3-5 sec) colture batteriche durante la notte e aggiungere 100 microlitri pneumococchi e 100 microlitri S. salivarius in tubi corrispondenti.
    3. Brevemente vortex e incubare le colture a 37 ° C per circa 2 ore per S. salivarius e 3 ore per pneumococchi.
  2. Preparazione del CCL-23 cellule per saggio aderenza
    1. Utilizzando un microscopio invertito, controllare la piastra a 24 pozzetti per confluent Monostrati con morfologia delle cellule sane. Monostrati dovrebbero essere> 80% confluenti, senza evidenza di aggregazione delle cellule o degli effetti citopatici come arrotondamento cella o perdita di aderenza (vedi Figura 2).
    2. Rimuovere il supporto in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta di trasferimento, inclinando leggermente la piastra per non disturbare il monostrato cellulare.
    3. Per lavare delicatamente le cellule, aggiungere ~ 500 microlitri di PBS preriscaldata in ogni pozzetto con una pipetta sierologica e rimuoverlo con una pipetta di trasferimento, inclinando leggermente la piastra. Eliminare il PBS. Ripetere fase di lavaggio una volta.
    4. Aggiungere 500 ml di MEM preriscaldata + 5% FBS in ogni pozzetto. Riportare la piastra a 24 pozzetti per la CO 2 incubatore durante la preparazione delle colture batteriche.
      Nota: Per determinare l'esatto numero di cellule CCL-23 per la molteplicità di infezione (MOI), due pozzetti possono essere tripsinizzate e contate il giorno di infezione.

3. Assay Aderenza

  1. Aggiungi pneumococchi ail CCL-23 celle in un MOI ~ 10:01. Verificare le condizioni elencate nella Tabella 1 in pozzetti duplicati.
    1. Misurare la densità ottica a 600 A (OD) di 1 ml di S. cultura salivarius. OD deve essere compresa tra 0,3-0,6.
    2. Trasferire 5 ml di S. cultura salivarius in una provetta da 10 ml e centrifugare a 1870 xg per 4 min.
    3. Scartare il surnatante e si basa sulla lettura OD nella sezione 3.1.1, risospendere S. salivarius in 200-1000 ml di NaCl 0,85% (concentrazione finale ~ 1,5 x 10 9 UFC / ml). Come regola generale, un diametro esterno di 0,375 verrà risospeso in 260 ml. Preparare 1:10 e 1:100 diluizioni di S. salivarius utilizzando 0,85% NaCl.
      Nota: In totale, tre concentrazioni (in rappresentanza alta, media e basse dosi) di S. salivarius sarà testato nel saggio. La dose elevata è un rapporto di ~ 10 S. salivarius: 1 pneumococchi, il mezzo è ~ 1 S. salivarius: 1 pneumococchi, e il basso è ~ 1 S. salivarius: 10 pneumococchi.
    4. Estrarre la piastra a 24 pozzetti da incubatore.
    5. Dai pozzetti di controllo eparina, rimuovere 40 microlitri di media ed aggiungere 50 ml di eparina (1.000 U / ml di brodo di concentrazione) per una concentrazione finale di 100 U / ml.
    6. Aggiungere 10 ml di 0,85% NaCl per pozzetti contenenti solo CCL-23 cellule e pozzetti contenenti CCL-23 cellule e pneumococchi (senza S. salivarius).
    7. Aggiungere 10 ul di non diluito, 1:10 e 1:100 di S. salivarius a rispettivi pozzetti.
      Nota: S. salivarius può anche essere aggiunto al tempo stesso come pneumococchi (coaddition) o 1 ora dopo pneumococchi (post-addizione) per esaminare l'effetto del tempo di somministrazione probiotico.
    8. Centrifugare la piastra da 24 pozzetti a 114 xg per 3 min a favorire il contatto batterica con lo strato di cellule e incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2.
    9. Effettuare diluizioni seriali della S. salivarius magazzino in 0,85% NaCl e piastra su duplicato HBApiastre per conte vitali. In primo luogo, aggiungere 50 ml di stock da 450 ml di 0,85% NaCl per fare una diluizione 10 -1, poi impulsi vortice (5 sec), punte di cambiamento, e aggiungere 50 ml di diluizione 10 -1 a 450 ml di 0,85% NaCl per fare una diluizione 10 -2 e così via fino a 10 -7.
    10. Piatto 100 ml di 10 -5, 10 -6, -7 e 10 diluizioni in duplicato su piastre HBA e si sviluppa con una spatola sterile. Incubare le piastre HBA invertiti notte a 37 ° C, 5% di CO 2.
    11. Verso la fine dell'incubazione 1 hr, ripetere sezioni 3.1.1-3.1.3 per pneumococchi. DO deve essere compresa tra 0,2-0,7. Centrifugare 1 ml di coltura pneumococcica e risospendere il pellet in 300-2,000 ml di NaCl 0,85% (in base alla lettura OD) ad una concentrazione di circa 1,5 x 10 8 UFC / ml. Come regola generale, un diametro esterno di 0,3 sarà risospeso in 500 microlitri.
    12. Dopo 1 ora di incubazione con S. salivarius, aggiungere 10 μ; L pneumococchi non diluito a tutti i pozzetti tranne pozzetti di controllo negativo (contenenti cellule solo).
    13. Centrifugare la piastra da 24 pozzetti a 114 xg per 3 min e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 3 ore. Eseguire la diluizione seriale del pneumococchi magazzino in 0,85% NaCl come descritto nella sezione 3.1.9 e le diluizioni piatto 10 -4, 10 -5 e 10 -6 su piastre HBA duplicati per conteggi vitali.
  2. Dopo 3 ore, controllare le cellule al microscopio per assicurare che monostrati aspetto sano (vedi figura 2). Rimuovere il supporto di ogni bene e delicatamente lavare le cellule 3x come descritto nella sezione 2.2.3. usando una pipetta diverso per ogni condizione. Questo passaggio è essenziale eliminare pneumococchi nonadherent. I monostrati non dovrebbero sfaldi durante il processo di lavaggio; questo può essere confermata controllando nuovamente al microscopio.

Nota: Supporto rimosso durante questa fase può essere conservato a -20 ° C per ulteriori analisi ( ad es misurazione dei livelli di citochine).

  1. Aggiungere 200 ml di 0,1% digitonina (un detergente delicato) a ciascun pozzetto ed incubare per 7 minuti a 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Aggiungere 800 ml di THB media per ciascun pozzetto. Lisare le cellule pipettando su e giù, e, se necessario, raschiare pozzetti 3-4x con la punta della pipetta per assicurarsi che il monostrato cellulare viene completamente rimosso. Cambiare punte tra pozzi.
  3. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto con una pipetta P1000 e trasferire nelle provette per microcentrifuga con etichetta.

4. Quantificazione dei Aderente pneumococchi

Pneumococchi aderente può essere quantificata determinando conte vitali (diluizione seriale e placcatura su agar sangue) o quantitativa real-time PCR.

  1. Metodo Conta vitale
    Questo metodo deve essere eseguita immediatamente dopo passo 3.5 del dosaggio aderenza.
    1. Per ogni pozzetto analisi, preparare diluizioni seriali dei campioni raccolti inpunto 3.5 del dosaggio aderenza aggiungendo 50 ml di campioni da 450 ml di 0,85% NaCl, impulso vortex, e diluizioni seriali come descritto nella sezione 3.1.9 fino alla diluizione 10 -6.
    2. Piatto 100 ml di 10 -3, -4, 10 10 -5, e 10 -6 diluizioni in duplicato su agar sangue, si sviluppa con una spatola sterile e incubare le piastre capovolte notte a 37 ° C, 5% di CO 2. Notare che i pozzetti contenenti CCL-23 celle da solo non devono contenere batteri e possono essere placcati ordinata (100 ml non diluito) come controllo di sterilità.
    3. Il giorno seguente, determinare il inoculi pneumococcico contando le colonie sulle piastre di diluizione appropriate (contenenti 30-300 colonie) preparati in sezione 3.1.13 del dosaggio aderenza. Calcolare il CFU / ml di inoculo utilizzando il valore medio da due piastre. Analogamente, determinare il S. salivarius inoculi per conteggio delle colonie sulle piastre preparatenella sezione 3.1.10.
      Nota: Le piastre devono contenere solo pneumococchi; la presenza di altre specie indica che il test è stato contaminato e risultati non sono validi.
    4. Per determinare i livelli di aderenza pneumococco, conta la piastra di diluizione appropriata (contenente 30-300 colonie pneumococco) per ogni campione preparato nella sezione 4.1.1. Si noti che S. colonie salivarius saranno piccoli e nero, mentre pneumococchi sarà dovuto piatta e verde di α-emolisi, come mostrato nella Figura 3. Per calcolare l'adesione pneumococcica, normalizzare il numero di pneumococchi aderente dalla condizione b. CCL-23 celle + pneumococchi al 100% e confronta i pneumococchi aderente da altre condizioni a questa condizione.
  2. metodo qPCR
    I campioni raccolti in aderenza Assay passo 3.5 possono essere conservati a -20 ° C fino estrazione del DNA. Estrazione del DNA viene eseguita utilizzando un kit commerciale e descritto nelle sezioni 4.2.1-4.2.9 e la qPCR comedire in sezioni 4.2.10-4.2.20.
    1. Preparare enzimatica Lysis buffer (50 mM tampone fosfato pH 6,7 contenente 1 mg / ml lisozima, 0,075 mg / ml mutanolysin, e 2 mg / ml proteinasi K). La ricetta che segue può essere utilizzata rendere 10 ml (sufficiente per 50 estrazioni). Tampone di lisi enzimatica dovrà essere preparata prima dell'uso.

      7.25 ml di soluzione di 50 mM tampone fosfato (pH 6.7)
      1,00 ml di 10 mg / ml di brodo lisozima per una finale [1 mg / ml]
      0,75 ml di 1 mg / ml mutanolysin magazzino per finale [0,075 mg / ml]
      1,00 ml di 20 mg / ml proteinasi K magazzino per finale [2 mg / ml]
    2. Scongelare i campioni in ghiaccio oa 4 ° C. Vortex e il trasferimento di aliquote di 100 ml di ogni campione in provette per microcentrifuga con etichetta. Ritorno campioni originali indietro nel -20 ° C freezer.
    3. Centrifugare i campioni a 6.700 xg per 10 min.
    4. Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 200 ml di tampone di lisi enzimatica al pellet e vortex per risospendere. Incubmangiato i campioni a 56 ° C per 30 min. Centrifugare brevemente (5 sec) a 6.700 xg per raccogliere il liquido sul fondo della provetta.
    5. Aggiungere 10 ml di 20% SDS per completare la lisi cellulare e mescolare delicatamente a temperatura ambiente per 2 min.
    6. Aggiungere 4 ml di RNase A (100 mg / magazzino ml) e mescolare delicatamente (su una sedia a dondolo o invertendo i tubi) a temperatura ambiente per 2 min.
    7. Aggiungere 200 ml di tampone AL (da kit) e vortex per 15 sec. Incubare i campioni a 70 ° C per 10 min. Centrifugare brevemente (5 sec) a 6.700 xg per raccogliere il liquido sul fondo della provetta.
    8. Aggiungere 200 ml di 100% EtOH e vortex per 15 sec. Centrifugare brevemente per raccogliere il liquido sul fondo della provetta, poi trasferire il composto (compreso l'eventuale precipitato) alla colonna di spin (in un tubo di raccolta 2 ml) senza bagnare il bordo. Seguire i passaggi di lavaggio a seconda del il protocollo del produttore (non mostrato qui).
    9. Per eluire il DNA, trasferire colonna in una provetta per microcentrifuga con etichetta, aggiungere 50 ml di tampone AE (frkit om), e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Centrifugare a 4.300 g per 1 min. Ripetere una volta per un volume finale di 100 microlitri di eluizione. Il DNA può essere conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.
    10. Per eseguire qPCR, sterilizzare le cappe con luce UV per 15 minuti prima di iniziare. Preparazione di una piastra a 96 pozzetti map foglio di lavoro per registrare le posizioni e per ogni campione è raccomandato.
    11. Preparare curva standard utilizzando un / magazzino ml 10 ng di DNA genomico da pneumococco (estratto dal ceppo di riferimento ATCC 6305).
      1. Scongelare pneumococco magazzino DNA e spin down brevemente (5 sec) in una centrifuga da tavolo.
      2. Eseguire 01:10 diluizioni seriali in 6 provette per microcentrifuga prelabeled con l'aggiunta di 3 ml di DNA a 27 microlitri priva di nucleasi H 2 O, cambiando suggerimenti e vortex tra ogni diluizione. La serie diluizione finale è composta da 6 tubi: 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 e 0.00001 ng / ml.
        Nota: Questi possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di una settimana.
    12. Prepae Lyta MASTERMIX come segue in una sterile tubo da 15 ml in una cappa sterile PCR. Scongelare componenti su ghiaccio e vortex immediatamente prima dell'uso.
      componente per reazione x 102 (piatto pieno)
      LYTA F 0,25 ml di 10 mM magazzino 25.5 ml
      LYTA R 0,25 ml di 10 mM magazzino 25.5 ml
      Sonda LYTA 0,5 ml di 10 mM magazzino 51 microlitri
      H 2 O 9.5 microlitri 969 microlitri
      Master mix 12.5 ml 1.275 pl
      Volume finale 23 microlitri 2346 microlitri
      Nota: Alcune macchine PCR in tempo reale richiedono l'uso di un colorante di riferimento, che è contenuto in alcuni mastermixes commerciale o può essere aggiunto separatamente. Questo protocollo è progettato per l'esecuzione di reazioni 25 microlitri in una piastra a 96 pozzetti, ma può essere regolato per adattarsi a diverse macchine PCR in tempo reale. I primer e le sequenze di sonda sono stati originariamente pubblicati da Carvalho et al. 15 e sono mostrati nella lista dei materiali.
    13. Vortex e carico 23 microlitri / pozzetto della LYTA mescolano nei pozzetti appropriati. Fare riferimento alla targa mappa.
    14. Piastra Trasporti per modello area aggiunta (preferibilmente un armadio sterile in una stanza separata) per caricare il campione.
    15. Utilizzare una pipetta P2 per caricare campioni, cambiando suggerimenti per ogni bene. Tutti i campioni vengono eseguiti in duplicato. Fare riferimento alla targa mappa per la posizione.
    16. Per i pozzi curva standard, aggiungere 1 ml / pozzetto della diluizione appropriata di DNA curva standard più 1 ml / pozzetto H 2 O per portare il volume finale di 25 microlitri.Per non pozzetti di controllo del modello, aggiungere 2 ml H 2 O.
    17. Aggiungere 2 ml / pozzetto di DNA campione nei pozzetti appropriati.
    18. Cap tutti i pozzetti in uso. Rendere sicuri i tappi sono chiusi comodamente. Girare rapidamente la piastra PCR (5 sec) prima di caricare la piastra in una macchina PCR real-time.
    19. Piatto di carico in PCR macchina ed eseguire qPCR secondo le istruzioni fornite dal costruttore della macchina. Si raccomandano le seguenti sonda condizioni di ciclo di idrolisi:
      Fase 1 (1x): 3 min a 95 ° C
      Passo 2 (40x): 20 sec a 95 ° C
      20 sec a 60 ° C
    20. Raccogliere i dati e quantificare il DNA pneumococco utilizzando la curva standard. Cariche batteriche sono calcolate come descritto in precedenza 17, stimando che 1 pg di DNA genomico è equivalente a 447,4 cellule, e segnalato come UFC / ml (assumendo one genoma per ogni CFU, e una copia del LYTA per genoma; vedere Figura 4). Per un saggio di successo, il valore di R 2 deve essere ≥ 0,98 e tutti i risultati positivi all'interno della gamma della curva standard (cT valori inferiori a quello ottenuto per il ng 0,00001 / pl punto curva standard sono considerati sfondo / LYTA negativo).
      Nota: alcuni sistemi PCR in tempo reale sono dotati di software di analisi che può essere usato per costruire curve standard e calcolare incognite. Altrimenti, questi calcoli possono essere eseguiti in Excel o programmi simili. Una curva standard esempio è mostrato in Figura 4.
    21. Per calcolare l'adesione pneumococcica, normalizzare il numero di pneumococchi aderente dalla condizione di b. CCL-23 celle + pneumococchi al 100% e confronta i pneumococchi aderente da altre condizioni a questa condizione.

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Risultati

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I risultati di un esperimento rappresentativo in cui pneumococchi (S. pneumoniae PMP843, un colonizzando 19F isolare) sono stati aggiunti al CCL-23 cellule 1 ora dopo l'aggiunta di S. salivarius, e l'adesione pneumococcica è stata quantificata sia conta vitale e Lyta qPCR sono mostrati in Tabella 2. risultati erano coerenti tra i due metodi sia per il numero assoluto di batteri (presentato come CFU / ml) e l'aderenza%, normalizzato al numero pneumococchi di aderente nei pozzet...

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Discussione

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Una parte critica di questo saggio è l'aggiunta concentrazioni appropriate di S. salivarius e pneumococchi nelle sezioni 3.1.7 e 3.1.12. Le concentrazioni sono stimate utilizzando le letture di OD, ma l'inoculo esatto non sono determinati fino piastre vengono conteggiati il ​​giorno seguente. Per questo motivo, si consiglia di eseguire curve di crescita per misurare OD e conta vitali (CFU / ml) nel tempo per tutti i ceppi batterici utilizzati nel test per identificare la fase di mid-log e assistere nell...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Murdoch Childrens Research Institute e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreni minimi essenziali (MEM)Thermo Fisher ScientificSH30244.01 
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30084.03 
T-75 FiaschettaNunc156472 
Celle CCL-23ATCCCCL-23 
Tecnologie per la vita della tripsina15090046 
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzettiNunc142475 
Piastre di agar di sangue di cavallo (HBA)OxoidPP2001Piastre di agar di sangue di pecora accettabili anche
Todd-Hewitt BrodoOxoidCM0189 
Estratto di lievitoBeckton Dickinson212750 
DigitoninSigma-AldrichD141-100MG 
Cuvette monousoKartell1938 
L'eparinaPfizer2112105è disponibile in fiale sterili da 5.000 UI/5m/ 
Spalmatore sterileTechnoplasS10805050alternativamente, uno spandiconcime di vetro può essere immerso in etanolo al 96% e sterilizzato a fiamma prima di ogni utilizzo
LysozymeSigma-AldrichL6876 
MutanolisinaSigma-AldrichM9901 
proteinasi KQiagen19133 
Soluzione SDS 20%AmbionAM9820 
RNasi AQiagen19101 
Mini-kit QIAamp DNA (250)Qiagen51306 
LytA F primerSigma-Aldrichmade5' -> 3' sequenza ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primerSigma-AldrichCustom made5' -> 3' sequenza  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA sondaEurogentecSu misura5' -> 3' sequenza Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, è possibile utilizzare fluorofori alternativi
Acqua priva di nucleasiAmbionAM9906 
Mastermix QPCR ultra veloce Brilliant IIIAgilent Technologies600880 
Piastra di rilevamento Thermo-Fast 96Thermo Fisher ScientificAB-1100 
Strisce di tappi qPCR ultratrasparentiThermo Fisher ScientificAB-0866 
Sistema QPCR Mx3005Tecnologie Agilent 401449 
*fonti alternative sono disponibili per la maggior parte/tutti i prodotti elencati 
Custom

Riferimenti

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  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

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