Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Sommario

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l'evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Abstract

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un piccolo crostaceo trovato in intercotidali habitat marini di tutto il mondo. Negli ultimi dieci anni, Parhyale è emerso come organismo modello promettente per studi di laboratorio di sviluppo, fornendo un confronto outgroup utile al ben studiato modello artropodi organismo Drosophila melanogaster. In contrasto con le fratture sinciziale di Drosophila, i primi divisioni di Parhyale sono holoblastic. Mappatura Fate utilizzando coloranti traccianti iniettati nel primi blastomeri hanno dimostrato che tutti e tre i foglietti embrionali e la linea germinale sono stabiliti dallo stadio di otto cellule. In questa fase, tre blastomeri predestinati per dare luogo alla ectoderma, tre sono destinata a dare origine al mesoderma, e gli altri due blastomeri sono rispettivamente i precursori della linea endoderma e germe. Tuttavia, gli esperimenti di ablazione blastomeri hanno dimostrato che gli embrioni Parhyale possiedono anche significativo capabiliti normativoes, in modo tale che i destini di blastomeri ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti blastomeri. Blastomere ablazione è stato precedentemente descritto da uno dei due metodi: iniezione e successiva attivazione di coloranti fototossiche o ablazione manuale. Tuttavia, fotoablazione uccide blastomeri ma non rimuove il corpo cellulare morto dall'embrione. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Qui vi presentiamo un protocollo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri dalla fase di otto cellule di embrioni Parhyale, illustrando gli strumenti e le procedure manuali necessarie per la rimozione completa del corpo cellulare mantenendo vivo e intatto rimanenti blastomeri. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cella Parhyale allo stadio di otto cellule, o blastomeri di altre fasi iniziali della scissione. Inoltre, in linea di principio questo protocollo possa essere applicabile ai primi di CleaVage embrioni stadio di altri invertebrati marini holoblastically fendendo.

Introduzione

Il Parhyale hawaiensis anfipode crostaceo è emerso negli ultimi dieci anni come organismo modello promettente con un grande potenziale per l'uso in biologia dello sviluppo evolutivo di ricerca ^1. Tra gli artropodi, la maggior parte dei sistemi modello sono insetti, e il più ampiamente studiati di questi è il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. D. melanogaster è un membro dell'ordine dei Ditteri insetti, e come tale visualizza molte caratteristiche embrionali derivate rispetto a quelli degli insetti basally ramificazione ^2. Inoltre, gli insetti sono annidati all'interno del subphylum Pancrustacea ^3,<....

Protocollo

Commenti che possono essere utili in esecuzione di alcuni passaggi sono indicati in corsivo.

1. Giorno 1: Preparazione dei Materiali

1. Preparare i seguenti materiali (cfr. tabella dei Materiali e attrezzature):
   • 15 cm e 22 cm pipette Pasteur
   • Diamante scriba
   • acqua di mare artificiale filtrata (salinità tra 0,0018-0,0020) contenente 1 mg / ml di amfotericina B (1:100 di una soluzione madre di 100 mg / ml), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (1:50 di una soluzione madre contenente 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina)
   • filtrata acqua di mare artificiale (....

Risultati

Dopo il successo ablazione del singolo terzi scissione P. micromeri hawaiensis come descritto in questo protocollo, i restanti micromeri progressivamente spostano le loro posizioni leggermente in modo da occupare parzialmente lo spazio precedentemente occupato dal blastomero ablato. Per esempio, quando g viene rimosso, la vicina blastomeri mr e ML spostare leggermente e venire a condividere i bordi delle celle laterali che erano precedentemente in diretto contatto con .......

Discussione

Descriviamo un protocollo per l'ablazione manuale e rimozione fisica completa di singoli blastomeri dalle fasi iniziali della scissione del anfipode P. hawaiensis. Dimostriamo l'uso di questo protocollo rimuovendo la singola linea germinale cellula precursore g da una fase embrionale di otto cellule, e dimostrare che l'ablazione ha avuto successo, confermando l'assenza di s 'g cellule figlie in embriogenesi più tardi. Questo protocollo può essere utilizzato .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pipetta Pasteur da 15 cm	Wheaton	53499-630 VWR	Per il trasferimento di embrioni intatti e ablati con blastomero da una piastra all'altra.
Pipetta Pasteur da 22 cm	Wheaton	53499-632 VWR	Per la realizzazione di puntali per pipette orali.
Piastre di Petri da 3 cm	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Utilizzare un po' inalterato per raccogliere e conservare gli embrioni; rivestire alcuni con uno strato di Sylgard (vedi sotto) per creare una superficie di lavoro per l'ablazione dei blastomeri.
Piastre a 48 pozzetti	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	Per la coltura di embrioni dopo l'ablazione.
Filtri per bottiglie 0,2 &; micro; m	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	Per la creazione di FASW (vedi sotto).
Bruciatore Bunsen	VWR	89038-530 VWR	Per la creazione di un utensile a filo di tungsteno e di una pipetta con punta fine.
Graffietto a diamante	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	Per la creazione di pipette Pasteur a bocca larga per il collezionismo di coppie.
Forcipe	Strumenti di Fine Science	11050-10 Strumenti di Fine Science	Per trattenere femmine anestetizzate durante la rimozione di embrioni dalla sacca di covata. Non è necessario che si tratti di pinze Dumont a punta fine: le punte possono essere smussate almeno quanto quelle delle pinze per le quali è riportato il numero di catalogo.
Fungizone-Amfotericina B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Aggiungere a FASW fino a una concentrazione finale di 1 mg/ml e utilizzare questa soluzione per coltivare embrioni ablati con blastomero.
Capillari in vetro lunghi 4 pollici, 1/0,58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	Per realizzare aghi per perforare il blastomero da ablare.
Vetro orologio 300 mm di diametro	Microscopia elettronica	Scienze 70543-30 Scienze della microscopia elettronica	Da utilizzare nella rimozione di embrioni dalla sacca di covata di femmine anestetizzate.
Acqua di mare artificiale Instant Ocean (ASW)	Gli	ecosistemi acquatici Instant Ocean IS160	producono ASW sciogliendo il sale in acqua deionizzata a una salinità di 1,022-1,024.
Acqua di mare artificiale filtrata Instant Ocean (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Use 0.2 µ m filtri per sterilizzare ASW. Preparare in piccole quantità (< 250 ml) secondo necessità.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	Per rompere in sicurezza l'estremità fine delle pipette Pasteur modificate per la raccolta di coppie.
Adattatore per pipetta orale	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Inserire la punta della pipetta Pasteur tirata fine in questa estremità, da utilizzare per rimuovere il contenuto delle cellule estruse durante la procedura di ablazione.
Tubo per pipette per bocca	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Taglialo in modo che sia abbastanza lungo da poter essere appeso comodamente al collo durante la procedura di ablazione.
Estrattore di aghi	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	Per realizzare aghi da capillari di vetro per perforare il blastomero da ablare.
Soluzione di penicillina-streptomicina	Mediatech	45000-650 VWR	Aggiungere a FASW fino a una concentrazione finale di 100 unità/ml di penicillina e 100 mg/ml di streptomicina e utilizzare questa soluzione per coltivare embrioni ablati con blastomero.
Bulbo di gomma	Microscopia elettronica	Sciences 100488-418 VWR	Per l'utilizzo delle pipette Pasteur per trasferire gli embrioni da un piatto all'altro.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific Make	up secondo le istruzioni del produttore. Versare uno strato di 2-5 mm di spessore in una capsula di Petri di 3 cm per creare una superficie di lavoro per l'ablazione dei blastomeri.
Filo di tungsteno 0,004 pollici di diametro	A-M Systems	719000 A-M Systems	Utilizzare questo per realizzare uno strumento per la rimozione di embrioni dalla sacca di covata di femmine anestetizzate.