Questo documento fornisce una guida passo per passo per la tecnica di analisi fluttuazione k-Image Space Correlation Spectroscopy (CCI) per misurare i coefficienti di diffusione delle fluorescente proteine di membrana plasmatica in cellule di mammifero vive.
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Articolo metodologico
Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diffusione laterale e la compartimentalizzazione delle proteine di membrana del plasma sono strettamente regolati nelle cellule e, quindi, lo studio di questi processi saranno rivelare nuovi spunti per la funzione delle proteine di membrana plasmatica e la regolamentazione. Recentemente, k-spazio correlazione Immagine Spectroscopy (CCI) 1 è stato sviluppato per consentire misurazioni di routine di coefficienti di diffusione direttamente dalle immagini delle proteine di membrana plasmatica con targhetta modo fluorescente, che evitate distorsioni sistematiche introdotte dal fotofisica sonda. Sebbene la base teorica per l'analisi è complessa, il metodo può essere implementato da non esperti utilizzando un codice liberamente disponibile per misurare coefficienti di diffusione di proteine. CCI calcola una funzione di correlazione tempo da una pila di microscopia a fluorescenza dopo trasformazione di Fourier di ogni immagine reciproca spazio (k-). Successivamente, media circolare, logaritmo naturale trasformare e lineare adatta per la funzione di correlazione produce il coefficiente di diffusione. Questodocumento fornisce una guida step-by-step per l'analisi delle immagini e la misurazione dei coefficienti di diffusione via CCI.
In primo luogo, un frame rate elevato sequenza di immagini di una proteina di membrana plasmatica fluorescente viene eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza. Poi, è selezionata una regione di interesse (ROI) evitando organelli intracellulari, vescicole mobili o sporgenti regioni di membrana. Lo stack ROI viene importato in un codice liberamente disponibile e diversi parametri definiti (vedi sezione Method) sono impostati per l'analisi CCI. Il programma genera quindi un "pendio di piste" complotto dalle funzioni di tempo di correlazione k-spazio, e il coefficiente di diffusione è calcolato dalla pendenza del grafico. Qui di seguito è una procedura step-by-step CCI per misurare il coefficiente di diffusione di una proteina di membrana utilizzando l'renale canale di acqua aquaporin-3 con etichetta EGFP come un esempio canonico.
Introduzione
L'organizzazione spazio-temporale quadridimensionale e mobilità laterale delle proteine di membrana di plasma sono strettamente regolati e possono svolgere un ruolo nella funzione della proteina, l'attività e le interazioni proteina-proteina. Diffusione laterale delle proteine di membrana del plasma, è tradizionalmente stata studiata calcolando i coefficienti di diffusione per singole particelle di time-lapse imaging di quantum dot o tingere etichettati proteine della membrana plasmatica 2-4. Questo approccio richiede l'inserimento di un tag extracellulare della proteina di membrana plasmatica per quantum dot o etichettatura colorante, ch....
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Protocollo
Acquisizione di proteine EGFP-tag nella membrana plasmatica di analisi CCI può essere fatto su un microscopio a epifluorescenza, una configurazione TIRF o su un microscopio disco rotante impostato per acquisire immagini della membrana di interesse. La dimensione pixel fotocamera così come il tempo tra i fotogrammi immagine è necessario per l'analisi. Sequenze di immagini di 100-1,200 fotogrammi a una frequenza di 4-30 Hz possono essere utilizzate per l'analisi. Durante l'acquisizione, è importante mantenere la membrana a fuoco per tutta la durata della rappresentazione e concentrarsi su una frazione della membrana piatta in cui la fluorescenza è distrib....
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Risultati
Per acquisire stack di immagini adatte ad essere analizzati con CCI, possono essere utilizzati diversi sistemi microscopio. È possibile analizzare sequenze di immagini da un microscopio epi-fluorescenza, nonché una configurazione disco TIRF o filatura. La membrana deve essere piatta, senza grandi organelli cellulari in movimento o lo spostamento di vescicole / oggetti. Questo articolo presenta una sequenza di immagini lasso di tempo di AQP3 con etichetta EGFP in cellule MDCK vive impressi su un microscopio disco rotante.......
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Discussione
Questo documento presenta una panoramica dettagliata passo-passo su come applicare il metodo di analisi CCI per determinare i coefficienti di diffusione di immagini di microscopia di proteine marcate con proteine fluorescenti. L'analisi è indipendente dalla scelta sonda con una ampia gamma dinamica della densità etichettatura e può quindi essere applicato anche per proteine marcate con punti quantici così come coloranti e proteine fluorescenti come la EGFP.
Per calcolare coeffici.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una Lundbeck Junior Capo Gruppo Fellowship a LNN. PWW riconosce il sostegno finanziamenti provenienti scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). Ringraziamo anche il danese Molecolare Bioimmagini Center presso University of Southern Denmark di accesso a spinning microscopio disco.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilina | Sigma | 13752 | |
| Kanamicina | Gibco | 15160070 | |
| Streptomicina | Gibco | 11860038 | |
| Mezzo libero rosso fenolo | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Apparecchio | |||
| Disco Rotante Microscopio | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Camera | Andor | Ixon+ |
Riferimenti
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K.
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Ristampe e permessi
