Articolo metodologico

Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

DOI:

10.3791/51097

⸱

13 gennaio 2014

 ,  , 
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recentemente abbiamo identificato un nuovo uscita circadiana Drosophila, ritmo di preferenza della temperatura (TPR), in cui la temperatura preferita nelle mosche aumenta durante il giorno e cade durante la notte. Il TPR è regolato indipendentemente da un'altra uscita circadiana, l'attività locomotoria. Qui descriviamo la progettazione e l'analisi del TPR in Drosophila.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'orologio circadiano regola molti aspetti della vita, tra cui il sonno, l'attività locomotoria e i ritmi della temperatura corporea (BTR)1,2. Recentemente abbiamo identificato un nuovo output circadiano drosophila, chiamato ritmo di preferenza della temperatura (TPR), in cui la temperatura preferita nelle mosche aumenta durante il giorno e cade durante la notte 3. Sorprendentemente, il TPR e l'attività locomotoria sono controllati attraverso distinti neuronicircadiani 3. L'attività locomotoria della Drosophila è una nota produzione comportamentale circadiana e ha fornito forti contributi alla scoperta di molti geni e meccanismi dell'orologio circadiano dei mammifericonservati 4. Pertanto, la comprensione del TPR porterà all'identificazione di meccanismi circadiani molecolari e cellulari finora sconosciuti. Qui descriviamo come eseguire e analizzare il test TPR. Questa tecnica non solo consente di sezionare i meccanismi molecolari e neurali del TPR, ma fornisce anche nuove intuizioni sui meccanismi fondamentali delle funzioni cerebrali che integrano diversi segnali ambientali e regolano i comportamenti degli animali. Inoltre, i nostri dati pubblicati di recente suggeriscono che il TPR fly condivide le caratteristiche con il mammifero BTR3. I drosofili sono ectotermi, in cui la temperatura corporea è tipicamente regolata dal punto di vista comportamentale. Pertanto, il TPR è una strategia utilizzata per generare una temperatura corporea ritmica in questemosche 5-8. Crediamo che un'ulteriore esplorazione della Drosophila TPR faciliterà la caratterizzazione dei meccanismi alla base del controllo della temperatura corporea negli animali.

Introduzione

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La temperatura è un segnale ambientale onnipresente. Gli animali mostrano una varietà di comportamenti al fine di evitare temperature dannose e cercarli comodi. La drosofila mostra un robusto comportamento di preferenza dellatemperatura 6,7. Quando le mosche vengono rilasciate in un gradiente di temperatura da 18-32 °C, le mosche evitano temperature sia calde che fredde e infine scelgono una temperatura preferita di 25 °C al mattino3. I sensori di temperatura calda sono un insieme di neuroni termosensoriali, neuroni AC, che esprimono il canale del potenziale del recettore transitorio drosophila (TPR), TRPA16,9. I sensori di temperatura fredda si trovano nei segmenti 3rd antennal, poiché l'ablazione dei segmenti 3rd antennal causa la mancanza di evitare la temperatura fredda6. Recentemente, la proteina TRPP Brivido (Brv) è stata identificata10. Poiché Brv è espresso nei segmenti 3rd antennal e media il rilevamento a freddo, Brv è una possibile molecola di rilevamento a freddo, che è fondamentale per il comportamento di preferenza della temperatura. In somma, le mosche usano questi due sensori di temperatura per evitare le temperature calde e fredde e trovare una temperatura preferita.

Mentre i mammiferi generano calore per regolare la loro temperatura corporea, gli ectotermi generalmente adattano le loro temperature corporee alla temperaturaambiente 11. Alcuni ectotermi sono noti per mostrare un comportamento quotidiano di TPR che si ritiene sia una strategia per gli ectotermi per regolare il loro BTR12. Per determinare se le mosche mostravano TPR, abbiamo ripetuto l'analisi comportamentale delle preferenze di temperatura in vari punti durante un intervallo di 24 ore. Abbiamo scoperto che drosophila esibisce un TPR giornaliero, che è basso al mattino e alto la sera e segue un modello simile a quello del BTR nell'uomo13.

In Drosophila, ci sono ~150 neuroni dell'orologio nel cervello. I neuroni dell'orologio che regolano l'attività locomotoria sono chiamati oscillatori M ed E. Tuttavia, è interessante notare che gli oscillatori M ed E non regolano la TPR, invece, abbiamo mostrato che i neuroni dell'orologio DN2 nel cervello regolano la TPR ma non l'attività locomotoria. Questi dati indicano che il TPR è regolato indipendentemente dall'attività locomotoria. In particolare, il BTR dei mammiferi è anche regolato indipendentemente dall'attività locomotoria. Studi di ablazione sui ratti mostrano che il BTR è controllato attraverso specifici neuroni SCN che prendono di mira un sottoinsieme diverso di neuroni di zona subparaventricolare rispetto a quelli che controllano l'attivitàlocomotoria 14. Pertanto, i nostri dati considerano la possibilità che il BTR dei mammiferi e il TPR della mosca siano evolutivamente conservati3, poiché sia il TPR a mosca che il BTR dei mammiferi mostrano ritmi di temperatura circadiani dipendenti dall'orologio, che sono regolati indipendentemente dall'attività locomotoria.

Qui descriviamo i dettagli su come analizzare il saggio comportamentale TPR in Drosophila. Questo metodo consente l'indagine non solo del meccanismo molecolare e dei circuiti neurali della TPR, ma anche di come il cervello integra diversi segnali ambientali e orologi biologici interni.

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Protocollo

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1. Preparazione delle mosche

  1. Esperimenti light dark (LD)
    1. Sollevare le mosche negli incubatori (25 °C/40-60% di umidità relativa (RH)) sotto cicli leggeri di 12 ore /buio di 12 ore (LD). L'intensità luminosa degli incubatori è di ~ 500-1.000 lux.
    2. Due incubatori sono necessari per completare i test comportamentali per un periodo di 24 ore. Entrambi gli incubatori dovrebbero avere una luce programmabile con funzioni ON OFF. Dovrebbero anche avere porte solide che non sono permeabili alla luce(cioè senza vetro o plexiglass).
      Nota: un incubatore deve essere designato come incubatore "giorno" e impostato su un ciclo LD di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Il secondo incubatore deve essere designato come incubatore "notturno" e impostato sull'inverso del primo con 12 ore scure seguito da 12 ore di luce. L'incubatore notturno deve essere posizionato nella stanza accessibile al buio, in modo tale che le mosche che vivono le condizioni notturne siano facilmente accessibili per gli esperimenti.
    3. Posizionare le fiale di mosca negli incubatori diurni o notturni. Raccogli le mosche appena schiuse in una fiala fresca, 20-30 per saggio e tieni nella stessa incubatrice per 2-3 giorni.
    4. Dopo 2-3 giorni, utilizzare le mosche per il saggio comportamentale delle preferenze di temperatura.
      1. Per gli esperimenti diurni (tempo Zeitgeber (ZT) 0-12), raccogli le mosche dall'incubatore diurno.
      2. Poco prima degli esperimenti comportamentali, eserti le fiale di mosca raccolte dall'incubatrice del giorno.
      3. Per gli esperimenti notturni (ZT 13-24), raccogli le mosche dall'incubatore notturno.
      4. Proprio prima degli esperimenti comportamentali, eseminare le fiale di mosca raccolte dall'incubatrice notturna, avvolgere con un foglio di alluminio e posizionare in una scatola nella stanza buia sotto una lampada rossa.
        Nota: Poiché il saggio comportamentale di preferenza di temperatura viene eseguito al buio per gli esperimenti notturni, l'esposizione alla luce alle mosche deve essere prevenuta fino alla fine degli esperimenti comportamentali.
        Nota: Le mosche non devono essere esposte all'anidride carbonica il giorno in cui devono avvenire gli esperimenti.
  2. Esperimenti di oscurità costante (DD)
    1. Giorno del DD
      1. Un incubatore aggiuntivo è necessario per gli esperimenti del DD day, che ci riferiamo come un incubatore di "transizione" per il resto del manoscritto. L'incubatore di transizione deve essere posizionato nella stanza accessibile al buio, in modo tale che le mosche che sperimentano condizioni DD siano facilmente accessibili per gli esperimenti. Un programma di luce di esempio per un incubatore di transizione avrebbe la luce ON dalle 13:00 alle 19:00 e la luce SPENTA alle 19:00-13:00(Figura 1).
      2. Raccogli le mosche che sono state sollevate nell'incubatrice del giorno. Posizionare le fiale di volo nell'incubatore di transizione tra le 13:00 e le 19:00, quando la luce è attiva. In questo modo, le mosche sono adeguatamente esposte alla luce fino alle 19:00, quando la luce si spegne.
      3. Il giorno successivo, prima delle 13:00, in condizioni di buio, eserti le fiale di mosca dall'incubatrice di transizione, avvolgerle con un foglio di alluminio e posizionarle in una scatola. Tenere la scatola in qualsiasi incubatore per un altro giorno.
    2. Notte DD
      1. Raccogli le mosche che sono state sollevate nell'incubatrice notturna al buio sotto una lampada rossa. Oppure raccogli le mosche quando la luce dell'incubatore notturno è on.
      2. Avvolgere le fiale raccolte con un foglio di alluminio al buio ogni volta che le luci sono spente e posizionare le fiale in una scatola. Tenere la scatola in qualsiasi incubatore per altri due giorni(figura 1B).
        Nota: Poiché il saggio comportamentale di preferenza di temperatura viene eseguito al buio per gli esperimenti notturni, l'esposizione alla luce alle mosche deve essere prevenuta fino alla fine degli esperimenti comportamentali.
  3. Esperimenti di luce costante (LL)
    1. LL Day
      1. Un incubatore extra è necessario per gli esperimenti ll day. Questo incubatore mantiene la condizione LL (25 °C, 800 lux), con la luce intensa continuamente.
      2. Raccogli le mosche che sono state allevate nell'incubatrice del giorno. Posizionare le fiale di mosca nell'incubatore LL in qualsiasi momento durante il loro "giorno".
    2. Notte LL
      1. Raccogli le mosche che sono state sollevate nell'incubatrice notturna. Trasferire le fiale di mosca dall'incubatore notturno all'incubatore LL durante il periodo in cui la luce nell'incubatore notturno è on.
        Nota: ad esempio, la luce si spegne alle 7 del mattino nell'incubatore notturno. Trasferire le fiale di mosca dall'incubatore notturno all'incubatore LL prima delle 7 del mattino e tenere le fiale nell'incubatore LL per altri 4 giorni.
        Nota: Al giorno 4 in condizioni LL, l'oscillazione dell'attività locomotoriaviene abolita 15,16, mentre il TPR è ancora sostenuto 3.

2. L'apparato per il saggio comportamentale di preferenza della temperatura

  1. Posizionare un coperchio in plexiglass (29 cm x 19,2 cm) (Figura 4) su una piastra di alluminio.
  2. Monitorare la temperatura dell'aria tra la piastra e il coperchio. Sei sonde di temperatura sono attaccate in varie posizioni all'interno del coperchio all'interno di una delle corsie(figura 2).
    Nota: assicurarsi che le sonde non tocchino né la piastra di alluminio né il coperchio in plexiglass. La temperatura dell'aria deve essere impostata su un gradiente da 18-32 °C.
  3. Posizionare l'apparecchio in una stanza ambientale mantenuta a 25 °C/65-75% RH. Questa stanza deve essere sigillata da qualsiasi luce esterna. Una stanza ambientale è normalmente dotata di ventilatori per mantenere una certa temperatura e umidità.
    Nota: l'aria proveniente dalla ventola probabilmente disturba un gradiente di temperatura stabile sull'apparecchio. Per evitare ciò, utilizziamo un foglio trasparente che copre l'area circostante l'apparato.
  4. Preparare un termometro e un igrometro per controllare la temperatura e l'umidità nella stanza ambientale.
    Nota: La luce influenza la preferenza di temperatura di Drosophila3. La stessa intensità di luce deve essere fornita sull'apparecchio in modo uniforme. L'intensità delle nostre luci della camera ambientale è di ~ 800 lux.
    Nota: Quando gli esperimenti comportamentali sono fatti, posizionare un tubo collegato dalserbatoio di CO 2 o fornire vicino al foro della parte superiore dell'apparato per anestetizzare e sbarazzarsi delle mosche.

3. Preparazione di apparecchi per l'uso

  1. Accendere l'apparecchio per almeno 30 minuti per stabilire correttamente il gradiente di temperatura sulla superficie della piastra (Figura 3).
  2. Rivestire la copertura dell'apparato comportamentale con idrorepellente per evitare che le mosche si arrampicano sulle pareti o sul soffitto della copertura. Pulire il idrorepellente in eccesso e lasciare asciugare il coperchio per 25-30 minuti.
  3. Rimuovere la condensa sulla piastra di alluminio. Posizionare il coperchio in plexiglass sulla piastra di alluminio e fissare con sei morsetti C(Figura 2).
    Nota: È molto importante che il coperchio sia sigillato bene, se necessario può essere utilizzato nastro a doppia lecca.
  4. Lasciare il coperchio per almeno 15 minuti. Il gradiente di temperatura dell'aria tra la piastra di alluminio e il coperchio viene creato da 18-32 °C.

4. Test del comportamento delle preferenze di temperatura

  1. Caricare le mosche nello spazio tra la piastra di alluminio e il coperchio in plexiglass dell'apparecchio attraverso piccoli fori al centro di ogni corsia del coperchio(figure 2 e 4). Coprire i fori con scivolamenti di copertura per evitare che le mosche fuoriesano.
  2. Per le condizioni di buio, spegnere tutte le luci nella stanza ambientale. Una lampada rossa può essere utilizzata quando le mosche sono posizionate nell'apparato. Assicurarsi che le mosche non siano esposte ad alcuna luce tranne una lampada rossa fino al termine degli esperimenti comportamentali.
  3. Per ogni prova, utilizzare 20-25 mosche adulte, che non devono essere riutilizzate nelle prove successive. Il saggio comportamentale viene eseguito per 30 minuti. Scatta alcune foto con o senza flash. Fare attenzione a non fare molto rumore o movimenti improvvisi durante gli esperimenti.
  4. Registrare la temperatura di tutte e sei le sonde sull'apparecchio. Prendi nota della temperatura ambiente e dell'umidità.
  5. Anestetizza le mosche nell'apparato con gas di anidride carbonica, allenta i morsetti, rimuovi il coperchio in plexiglass e rimuovi le mosche dalla piastra. Dopo ogni esperimento, le mosche vengono scartate. Pulire la condensa o l'umidità dalla piastra. Sostituire il coperchio sulla piastra e stringere con i morsetti in preparazione per l'esperimento successivo.
  6. Per avere una rappresentazione della preferenza di temperatura per tutto il giorno, il periodo di 24 ore è diviso in otto fusi orari, quattro durante il giorno e quattro di notte. Ad esempio, usiamo questi ZT o CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24.
    Nota: poiché le variazioni del fenotipo causate dagli effetti di mascheramento sono previste subito dopo che la luce è accesa (ZT0) o OFF (ZT12), non esaminiamo il comportamento delle preferenze di temperatura durante questi periodi (ZT o CT 0-1, 11.5-13 e 23.5-24). Per rendere statisticamente validi i risultati, devono essere fatte almeno cinque prove in ciascun fuso orario.

5. Analisi dei dati

  1. Calcolare il gradiente di temperatura come segue: determinare dove sono posizionate le sonde di temperatura in base ai due righelli posizionati sul lato superiore e inferiore del coperchio in plexiglass lungo i bordi (Figura 2A).
  2. Si stima che il gradiente di temperatura tra le sonde di temperatura sia lineare. In base alla posizione delle sonde di temperatura, nonché alle corrispondenti temperature registrate, tracciare linee che rappresentano ogni grado di temperatura nella posizione appropriata sulle immagini. Contare il numero di mosche situate in ogni intervallo di grado. Escludere eventuali mosche sulle pareti o sul soffitto della copertura.
  3. Calcola la percentuale di mosche in ogni intervallo di temperatura di ogni corsia. Una temperatura media preferita è calcolata sommando i prodotti della percentuale di mosche e temperatura di ciascun intervallo, come mostrato di seguito:
    % di mosche x 18,5 °C + % di mosche x 19,5 °C + % di mosche x 20,5 °C ....+ % di mosche x 31,5 °C + % di mosche x 32,5 °C.
  4. Calcola la temperatura media preferita in ogni fuso orario: il comportamento delle preferenze di temperatura viene eseguito >5 volte durante ogni fuso orario (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24). Per calcolare la temperatura media preferita in ogni fuso orario, la temperatura media preferita di ogni prova viene calcolata in media insieme. Le barre di errore .m s.e. sono uguali all'errore tra le versioni di valutazione.

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Risultati

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Un esempio del ritmo delle preferenze di temperatura è illustrato nella figura 5. Se la procedura di comportamento viene eseguita con successo, le mosche dovrebbero mostrare un TPR in cui preferiscono una bassa temperatura al mattino e una temperatura più alta la sera. L'aumento di ~ 1-1,5 ° C durante il giorno nella preferenza per la temperatura dovrebbe essere osservato nel corso della giornata, indipendentemente dallo sfondo genetico, poiché abbiamo dimostrato che le mosche w1118, ...

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Discussione

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Qui, illustriamo i dettagli dell'apparato comportamentale delle preferenze di temperatura e l'analisi del comportamento TPR. Drosophila mostra le caratteristiche salienti, robuste e riproducibili della TPR controllata dall'orologio. Tuttavia, i nostri dati suggeriscono che almeno due fattori, luce ambientale ed età, disturbano significativamente i fenotipi comportamentali TPR.

Osserviamo che la luce influisce significativamente sulla preferenza di temperatura in Drosophila. È...

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Dichiarazioni

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Non c'è nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati ai dottori Aravinthan Samuel e Marc Gershow che hanno contribuito a sviluppare la versione iniziale dell'apparato comportamentale e a Matthew Batie che ha modificato l'apparato comportamentale. Questa ricerca è stata supportata da Trustee Grant del Cincinnati Children's Hospital, JST/PRESTO, March of Dimes e NIH R01 GM107582 to F.N.H.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bright Lab Jr. SafelightAmazon#B00013J8UYLuce rossa per ambienti bui
Prodotti Rain XSOPUSIdrorepellente: Applicare la copertura in plexiglass
C-ClampHome Depot
Temperatura/igrometroFisher15-077-963
Dispositivi PeltierTE Technology, Inc.HP-127-1.4-1.15-71P
TermometroFluke Fluke52II
Controllore da bancoForno Industries5R6-570-15R e 5R6-570-24R
Sonda sensore di temperaturaOven IndustriesTR67-32
Generico 480 Watt ATX alimentatoresistema di raffreddamento del computer
MCR220-QP-RES Doppio 120 mm Radiatore con serbatoio Sistema di raffreddamento per computerSwiftech
Pompa in linea 12V DC MCP350di raffreddamento per computerSwiftech
Scheda grafica MCW50 Raffreddatore a liquidoraffreddamento per computerSwiftech
Falce Kaze-Jyuni Ventola SY1225SL12SHCrazy PC
Sistema Sistema di

Riferimenti

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