Questo protocollo descrive come sezionare premigratory cresta neurale cranica (NC) da Xenopus laevis neurulas. Tali espianti possono essere placcati in fibronectina e coltivate in vitro, o innestate di nuovo in embrioni di accoglienza. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi di NC epitelio a mesenchima transizione, migrazione e differenziazione.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La cresta neurale (NC) è una popolazione cellulare dorsale tubo neurale transitoria che subisce una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) alla fine di neurulazione, migra verso estesamente vari organi, e si differenzia in molti tipi di derivati (neuroni, glia, cartilagine e osso, le cellule pigmentate ed endocrine). In questo protocollo, si descrive come sezionare il premigratory cranica NC da Xenopus laevis embrioni, al fine di studiare lo sviluppo NC in vivo e in vitro. Il modello di rana offre molti vantaggi per studiare lo sviluppo precoce; lotti abbondanti sono disponibili, gli embrioni si sviluppano rapidamente, il guadagno in vivo e la perdita di strategie funzionali consentono la manipolazione dell'espressione genica prima di NC dissezione del donatore e / o embrioni di accoglienza. Gli espianti NC possono essere piastrate su fibronectina e utilizzati per studi in vitro. Essi possono essere coltivate per diversi giorni in un mezzo definito privo di siero. Abbiamo anche descritto come innestare espianti NC indietroin embrioni di accoglienza per lo studio della migrazione NC e la differenziazione in vivo.
Introduzione
La cresta neurale (NC) è una popolazione di cellule embrionali transitoria che emerge dal tubo neurale a fine neurulazione negli embrioni dei vertebrati. Gli eventi di segnalazione e genetici che controllano specifiche NC iniziano già nel gastrulazione. La NC è specificato al confine tra la neurale e ectoderma neurale non da segnali dai tessuti dorsali circostanti. Alla fine del neurulazione, celle NC subiscono una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) e migrano ampiamente nell'embrione seguendo percorsi stereotipati rispondendo al circostante spunti guida. Una volta che hanno raggiunto la loro destinazione finale, si differenziano in una vasta gamma di deriva....
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Protocollo
Gli esperimenti sono conformi alla normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento.
1. Preparazione di piatti fibronectina rivestite 14
- Pipettare 500 ml di 10 mg / ml grado fibronectina cultura diluito in 1x tampone fosfato (PBS) in un piatto di plastica standard di Petri (Ø 40 x 11 mm). Incubare a 37 ° C per 1 ora. Nota: se si utilizza piatti di vetro o vetrini per l'imaging successiva, utilizzare un / soluzione fibronectina ml 100 mg.
- Lavare tre volte con PBS 1x. <....
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Risultati
Quando placcato in fibronectina, gli espianti cresta neurale attaccano rapidamente (15-30 min) e l'espianto si diffonde piatta entro 2 ore (Figura 1A). Dopo 3-6 cellule hr cominciano a disperdersi. A 24 ore a 15 ° C, molte cellule hanno iniziato a migrare dalla espianto (Figure 1B e 1C). Tuorlo rende le cellule molto luminoso in contrasto di fase (Figura 1B). Sporgenze cellulari (filopodes e lamellipodes) sono chiaramente visibili dopo falloidina co.......
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Discussione
Questo protocollo descrive una tecnica facile da espiantare premigratory cranica NC in X. laevis embrioni. Gli embrioni utilizzati per tali esperimenti devono essere robusti e guarire bene. Eliminare ogni partita di embrioni sani. Inoltre, crescere embrioni a diverse temperature (da 12 a 18-20 ° C), al fine di asportare cresta neurale nella fase 17 e non più tardi. Dopo stadio 17, cresta neurale può essere miscelata con mesoderma cefalico e non può essere rimosso completamente. Tessuti Xenopus guarisco.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Adeline Dolly per le foto di espianto di fibronectina, Eric Theveneau per utili discussioni e il Fondo Animal dell'Institut Curie. CM è un borsista postdottorato della Regione Ile de France (Domaine d'interet Majeur Stelo Pole), Université Paris Sud (addetto Temporaire d'Enseignement et de Recherche), e Agence Nationale de la Recherche. Questo lavoro è stato finanziato dalla Université Paris Sud (Attractivite 2011), il Centre National de la Recherche Scientifique (Programma d'azione thématique et sur fonti di incentivi), Association pour la Recherche contre le Cancer di Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, e Agence Nati....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibronectina dal plasma bovino | Sigma | F4759-1MG | |
| Albumina sierica bovina, frazione V | Euromedex | 04-100-811-C | Il grado di qualità inferiore può essere adatto a questa applicazione |
| Perni per insetti in acciaio inossidabile, dimensione 000 | FST | 26001 | |
| pinza Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm | FST | 11252-20 |
Riferimenti
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to....
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Ristampe e permessi
