Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

Sommario

Questo protocollo descrive come sezionare premigratory cresta neurale cranica (NC) da Xenopus laevis neurulas. Tali espianti possono essere placcati in fibronectina e coltivate in vitro, o innestate di nuovo in embrioni di accoglienza. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi di NC epitelio a mesenchima transizione, migrazione e differenziazione.

Abstract

La cresta neurale (NC) è una popolazione cellulare dorsale tubo neurale transitoria che subisce una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) alla fine di neurulazione, migra verso estesamente vari organi, e si differenzia in molti tipi di derivati ​​(neuroni, glia, cartilagine e osso, le cellule pigmentate ed endocrine). In questo protocollo, si descrive come sezionare il premigratory cranica NC da Xenopus laevis embrioni, al fine di studiare lo sviluppo NC in vivo e in vitro. Il modello di rana offre molti vantaggi per studiare lo sviluppo precoce; lotti abbondanti sono disponibili, gli embrioni si sviluppano rapidamente, il guadagno in vivo e la perdita di strategie funzionali consentono la manipolazione dell'espressione genica prima di NC dissezione del donatore e / o embrioni di accoglienza. Gli espianti NC possono essere piastrate su fibronectina e utilizzati per studi in vitro. Essi possono essere coltivate per diversi giorni in un mezzo definito privo di siero. Abbiamo anche descritto come innestare espianti NC indietroin embrioni di accoglienza per lo studio della migrazione NC e la differenziazione in vivo.

Introduzione

La cresta neurale (NC) è una popolazione di cellule embrionali transitoria che emerge dal tubo neurale a fine neurulazione negli embrioni dei vertebrati. Gli eventi di segnalazione e genetici che controllano specifiche NC iniziano già nel gastrulazione. La NC è specificato al confine tra la neurale e ectoderma neurale non da segnali dai tessuti dorsali circostanti. Alla fine del neurulazione, celle NC subiscono una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) e migrano ampiamente nell'embrione seguendo percorsi stereotipati rispondendo al circostante spunti guida. Una volta che hanno raggiunto la loro destinazione finale, si differenziano in una vasta gamma di derivati, ad esempio, i neuroni, glia, ossa, cartilagine e cellule pigmentate ^1-5. A causa del loro contributo a molti tipi di cellule e tessuti embrionali, difetti in ogni fase di sviluppo celle NC, dalla induzione alla differenziazione finale, può causare sindromi congenite denominate neurocristopathies ^6. Emanipolazione Xperimental del CN ​​sviluppare in fasi diverse - specifica, EMT, migrazione e differenziamento - permetterà di migliorare la nostra comprensione di neurocristopathies e permettere la progettazione di potenziali strategie terapeutiche.

L'embrione laevis Xenopus è un modello di scelta per studiare lo sviluppo NC. Un gran numero di embrioni sono facili da ottenere, e la fecondazione esterna dà accesso alle prime fasi di sviluppo. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente X. laevis sviluppo embrionale. Gene guadagno-di-funzione e atterramento sono facili da eseguire da microinjecting singole cellule dei primi blastulas. Tessuti embrionali possono essere tagliati per riassociazione in vitro ^7-11 o saggi di back-innesto ^12,13.

In questo protocollo, si descrive come sezionare fuori premigratory cranica NC in X. laevis neurulas fine, prima della migrazione. Tali espianti possono essere coltivate su fibronectina-coated piastre per studiare la migrazione e la differenziazione in vitro controllati in condizioni sperimentali. Espianti NC possono anche essere innestati in normali o manipolato gli embrioni di accoglienza per studiare la loro migrazione e differenziamento in vivo.

Protocollo

Gli esperimenti sono conformi alla normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento.

1. Preparazione di piatti fibronectina rivestite ¹⁴

1. Pipettare 500 ml di 10 mg / ml grado fibronectina cultura diluito in 1x tampone fosfato (PBS) in un piatto di plastica standard di Petri (Ø 40 x 11 mm). Incubare a 37 ° C per 1 ora. Nota: se si utilizza piatti di vetro o vetrini per l'imaging successiva, utilizzare un / soluzione fibronectina ml 100 mg.
2. Lavare tre volte con PBS 1x.
3. Sostituire PBS con 500 ml di 1x PBS/0.1% di sieroalbumina bovina (BSA). Incubare a 37 ° C per 30 min.
4. Lavare tre volte con PBS 1x.
5. Riempire con 1x PBS e conservare a 4 ° C fino all'uso (di solito per 24-48 ore).

2. La dissezione degli espianti NC

1. Preparare 3/4 Normale Anfibio Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca _{(NO3) 2,} 1 MgSO mm _4, 0.1 mM EDTA, 1 NaHCO mm _3, 0.2x PBS, 50 mg / ml gentamicina ^10,15). Non tenere più di 1 settimana per la dissezione, conservare a 4 ° C. NAM Older può essere utilizzato per la preparazione di piatti dissezione agarosio rivestite (in basso).
2. Preparare 60 millimetri piastre Petri per la dissezione, rivestiti con 10 ml di 2% agarosio in 3/4 NAM.
3. Raccolte strumenti di dissezione: pipette Pasteur in plastica, un perno insetto migliore montato su supporto del perno (vedi tabella materiali per riferimento), un "coltello sopracciglio" (fatta con capelli sopracciglio inclusi in paraffina sulla punta di una pipetta Pasteur di vetro ^16), due belle Pinza per dissezione, P1000 pipetta e suggerimenti, uno stereoscopio binocolo con ingrandimento 8-40X a 50, una sorgente di luce brillante con fibre ottiche e guide. Tutti gli strumenti di dissezione devono essere tenuti puliti, dopo ogni esperimento, sciacquare due volte con acqua distillata, una volta with 100% di etanolo e lasciare asciugare. Conservare lontano dalla polvere.
4. Compila il piatto dissezione con NAM fresco quasi al top.
5. Ottenere X. laevis embrioni secondo procedure standard ¹⁰ e li invecchiare fino a raggiungere neurula fase 16 (vedere Nieuwkoop e Faber tabella di sviluppo ^17).
6. Posizionare fase 16 embrioni nel piatto dissezione con il pipetta Pasteur di plastica.
7. Eseguire tutti i passaggi successivi sotto l'ambito binoculare. Rimuovere la membrana vitellina con due coppie di pinze. Fare attenzione a non danneggiare la parte dorsale degli embrioni.
8. Attendere fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase 17 per iniziare la dissezione. Fase 17 è corretto poiché la cresta neurale è chiaramente distingue dal tubo neurale, in contrasto con le fasi precedenti. Dopo la tappa 17, NC inizia la migrazione e mescolanza con mesenchima circostante.
9. Scavare un piccolo foro nel agarosio con una pinza per fare una nicchia per gli embrioni per mantenereloro durante la dissezione. Posizionare un embrione dorsale verso l'alto. Nota: modellare l'argilla può essere utilizzato per mantenere gli embrioni invece scavando un buco nel agarosio.
10. Fare un'incisione nella parte laterale della piega neurale anteriore con il coltello sopracciglio e il perno insetti. Fare attenzione a non andare troppo in profondità l'embrione: lo scopo di tagliare 2-3 strati di cellule (mai raggiungere il profondo come il archenteron!). Durante l'intero processo di dissezione, non permettono ai tessuti dissezionati di entrare in contatto con l'interfaccia aria-liquido dal X. tessuti embrionali laevis sono lisate mediante tensione superficiale.
11. Fare una seconda incisione parallela nella parte più dorsale della piega neurale con gli stessi strumenti.
12. Se necessario, ruotare il piatto di circa 90 °. Effettuare una terza incisione perpendicolare con il coltello sopracciglio e il perno insetto, sul lato posteriore delle prime due incisioni. La NC è una massa densa di cellule sotto lo strato esterno pigmentato della ectoderma, lateraleal tubo neurale.
13. Utilizzare la punta del coltello sopracciglio per staccare lo strato pigmentato ectoderm dal sottostante, NC, a partire dal terzo bordo incisione.
14. Utilizzare il lato del coltello sopracciglio per staccare il tessuto NC partire dal terzo incisione. Il tessuto NC è piuttosto grigiastro, mentre il mesoderma cefalico sottostante è bianco. Separare con attenzione il NC dal mesoderma.
15. Staccare il tessuto NC anteriormente dalla vescicola ottica, e tagliare a questo livello per liberare l'espianto. Come controllo per i primi esperimenti, controllando l'espressione snail2 (un marcatore canonico NC) in alcuni espianti l'ibridazione in situ è raccomandato.

3. Espianti placcatura su fibronectina

1. Inserire nel piatto fibronectina rivestite con Modified Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO ₃ 5 mm, K gluconato 4,5 mm, Na gluconato 32 mm, MgSO ₄ 1 mM, _CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, regolare il pH a 8,3 con 1 M Bicine ^18).
2. Trasferire gli espianti nel piatto fibronectina rivestite con una pipetta P1000. Non lasciare mai che gli espianti di toccare l'interfaccia aria-liquido. Primo, pipettare po 'di liquido nella punta, poi gli espianti, poi alcuni di nuovo liquido. Non lasciare che l'aria nella punta durante il trasferimento espianti nel piatto fibronectina rivestite. Una volta che la punta è all'interno del liquido del piatto fibronectina rivestite, lasciare che gli espianti lentamente scendono per gravità, o spingere molto delicatamente. Evitare di espellere gli espianti troppo veloce.
3. Mettere 10-30 espianti nel piatto con il coltello sopracciglio. Evitare i lati del piatto, che non sono adeguate per l'imaging successiva.
4. Cercate di non spostare la parabola fino a quando gli espianti hanno attaccato la fibronectina (ci vogliono circa 15-30 min). Se necessario, spostare il piatto con molta attenzione.
5. Porre la capsula in un incubatore refrigerato (tra 15-20 ° C, per la tabella delle temperature vedi ^17). Quando posto a 15 ° C, le cellule are di solito la migrazione in modo efficiente e di scattering, dopo 6 ore di incubazione (questa tempistica può variare tra esperimenti).

4. L'innesto espianti in embrioni Host

1. Tagliare un bel vetrino di vetro in pezzi molto piccoli che utilizzano pinze grossolani. Le dimensioni dei pezzi dovrebbe essere di circa 1,5 mm ^2. Immergere i pezzi in una capsula di Petri contenente tre quarti NAM o PBS usando le pinze.
2. Preparazione dell'embrione ospitante: sezionare l'ospite NC 3/4 NAM come descritto al punto 3), con particolare attenzione a non danneggiare l'embrione di accoglienza durante la rimozione della membrana vitellina e sviscerare il NC. La tensione del tessuto tende ad aumentare la dimensione dell'ablazione: lasciare l'embrione ospite guar parzialmente mentre sezionare l'embrione donatore.
3. In un altro piatto agarosio rivestite o in un'altra parte dello stesso piatto, sezionare l'espianto NC dall'embrione donatore come descritto nel protocollo 3. Trasferire l'innesto NC nella capsula contenente l'host con cura, come descritto inProtocollo 3.
4. Porre immediatamente l'espianto NC sulla zona ablazione host utilizzando una pinza. L'espianto deve allegare parzialmente. Mettere un pezzo di vetro coprioggetto sul embrione innestato a mantenere l'innesto in posizione. Scegliere un pezzo di vetro più grande di embrione per evitare di danneggiarlo. L'embrione sarà un po 'appiattito.
5. Attendere almeno 15-20 minuti, quindi rimuovere delicatamente il vetrino. Lasciate che l'embrione recuperare per altri 10 minuti e pipettare con cura in un piatto pulito riempito con 3/4 NAM, utilizzando la pipetta Pasteur di plastica.

Risultati

Quando placcato in fibronectina, gli espianti cresta neurale attaccano rapidamente (15-30 min) e l'espianto si diffonde piatta entro 2 ore (Figura 1A). Dopo 3-6 cellule hr cominciano a disperdersi. A 24 ore a 15 ° C, molte cellule hanno iniziato a migrare dalla espianto (Figure 1B e 1C). Tuorlo rende le cellule molto luminoso in contrasto di fase (Figura 1B). Sporgenze cellulari (filopodes e lamellipodes) sono chiaramente visibili dopo falloidina co...

Discussione

Questo protocollo descrive una tecnica facile da espiantare premigratory cranica NC in X. laevis embrioni. Gli embrioni utilizzati per tali esperimenti devono essere robusti e guarire bene. Eliminare ogni partita di embrioni sani. Inoltre, crescere embrioni a diverse temperature (da 12 a 18-20 ° C), al fine di asportare cresta neurale nella fase 17 e non più tardi. Dopo stadio 17, cresta neurale può essere miscelata con mesoderma cefalico e non può essere rimosso completamente. Tessuti Xenopus guarisco...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fibronectina dal plasma bovino	Sigma	F4759-1MG
Albumina sierica bovina, frazione V	Euromedex	04-100-811-C	Il grado di qualità inferiore può essere adatto a questa applicazione
Perni per insetti in acciaio inossidabile, dimensione 000	FST	26001
pinza Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm	FST	11252-20