Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

Nissa L. Carrodus; Kathleen Sue-Lyn Teng; Kathryn M. Munro; Matthew J. Kennedy; Jenny M. Gunnersen

doi:10.3791/51139

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Articolo metodologico

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

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DOI:

10.3791/51139

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12 febbraio 2014

Nissa L. Carrodus^*¹ , Kathleen Sue-Lyn Teng^*¹ , Kathryn M. Munro¹ , Matthew J. Kennedy² , Jenny M. Gunnersen¹^,³

¹Department of Anatomy & Neuroscience, The University of Melbourne, ²Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, ³Florey Institute of Neuroscience & Mental Health, The University of Melbourne

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l'anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l'incubazione.

Abstract

Per dimostrare la localizzazione superficie cellulare di un recettore transmembrana in neuroni in coltura, abbiamo etichettato la proteina sulla superficie dei neuroni vivi con un anticorpo primario specifico sollevato contro una porzione extracellulare della proteina. Dato che i recettori sono trafficate da e verso la superficie, se le cellule vengono permeabilizzate dopo fissazione quindi sia sulla superficie cellulare e proteine interna verrà rilevato dal medesimo anticorpo secondario marcato. Qui, abbiamo adattato un metodo utilizzato per studiare traffico di proteine ("alimentazione anticorpo") per differenzialmente proteina etichetta che era stato internalizzato per endocitosi in fase di incubazione anticorpo e proteina che sia rimasto sulla superficie cellulare o è stato oggetto di traffico alla superficie durante questo periodo . La capacità di distinguere queste due piscine di proteine è stato reso possibile attraverso l'incorporazione di un passo di blocco durante la notte con l'anticorpo secondario marcato altamente concentrato, dopo un iniziale incubation di neuroni unpermeabilized con un anticorpo secondario fluorescente marcato. Dopo il blocco, passo, permeabilizzazione dei neuroni consentiti rilevamento della piscina internalizzato con un anticorpo secondario fluorescente marcato con un fluoroforo diverso. Utilizzando questa tecnica siamo riusciti ad ottenere importanti informazioni circa la posizione subcellulare di questo recettore putativo, rivelando che si trattava, infatti, di tratta alla superficie cellulare nei neuroni. Questa tecnica è ampiamente applicabile ad una gamma di tipi di cellule e proteine di superficie cellulare, fornendo un anticorpo adatto ad un epitopo extracellulare è disponibile.

Introduzione

Nello stabilire la funzione delle proteine di nuova identificazione, indagine della localizzazione subcellulare e il traffico della proteina in questione può fornire importanti indizi circa il probabile ruolo / s del ^1,2 proteine. L'analisi bioinformatica del trascrittoma della neocorteccia di sviluppo ³ ci ha fornito una lista di geni che presentano espressione alterata durante il mouse corticogenesi cervello. Abbiamo quindi adottato un approccio del gene knockout per accertare che la proteina codificata da uno di questi geni, sez6, ha un ruolo chiave nello sviluppo del neurone. Abbiamo osservato che il gene sequestro legati 6, o....