Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Sommario

I microtubuli sono intrinsecamente polimeri instabili, e il loro passaggio tra la crescita e l'accorciamento è stocastico e difficile da controllare. Qui si descrivono i protocolli utilizzando microtubuli segmentato con tappi di stabilizzazione photoablatable. Depolimerizzazione dei microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo l'analisi delle proposte di risoluzione con lo smontaggio estremità del microtubulo.

Abstract

Microtubulo depolimerizzazione in grado di fornire la forza di trasportare diversi complessi proteici e perline proteine ​​rivestite in vitro. I meccanismi sottostanti sono pensati per svolgere un ruolo vitale nel cromosoma movimenti microtubuli-dipendente durante la divisione cellulare, ma le proteine ​​interessate ei loro ruoli esatti sono mal definiti. Quindi, vi è una crescente necessità di sviluppare saggi con cui studiano tale motilità in vitro utilizzando componenti purificati e ambiente biochimico definito. I microtubuli, tuttavia, sono intrinsecamente instabili polimeri, la loro commutazione tra crescita e l'accorciamento è stocastico e difficile da controllare. I protocolli che descriviamo qui approfittano dei microtubuli segmentati che sono fatti con il photoablatable stabilizzazione caps. Depolimerizzazione di tali microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo studi di motilità presso lo smontaggio estremità del microtubulo. Questa tecnica può essere utilizzata per caRRY un'analisi quantitativa del numero di molecole in complessi proteici fluorescenza marcata, che si muovono con processively microtubuli dinamica termina. Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore in questo ed altri saggi fluorescenti quantitative, coprioggetto devono essere trattati per ridurre l'assorbimento aspecifico di proteine ​​solubili fluorescenza marcata. Protocolli dettagliati vengono forniti per tenere conto della disuniformità di illuminazione fluorescente, e determinare l'intensità di un singolo fluoroforo utilizzando equidistante forma gaussiana. Infine, si descrive l'uso dei microtubuli segmentati per studiare i movimenti microtubuli-dipendente delle microsfere rivestite di proteine, fornendo approfondimenti nella capacità di diverse proteine ​​motrici e non motori a coppia microtubuli depolimerizzazione al movimento merci processive.

Introduzione

I microtubuli sono altamente conservate strutture citoscheletriche che sono importanti per l'architettura cellulare, la motilità cellulare, divisione cellulare, e trasporto intracellulare ^1. Questi polimeri dinamici assemblare da tubulina in presenza di GTP, e si passa spontaneamente tra crescita e accorciando ^2. I microtubuli sono molto sottili (solo 25 nm di diametro) quindi particolari tecniche ottiche per migliorare il contrasto dovrebbe essere utilizzato per osservare microtubuli con un microscopio ottico. Il lavoro precedente di questi polimeri esaminato il comportamento dinamico con contrasto di interferenza differenziale (DIC) ^3. Questo ed analoghi studi in vitro hanno rivelato che, in condizioni tipiche sperimentali, i microtubuli subiscono catastrofe e passare alla depolimerizzazione solo raramente, una volta ogni 5-15 minuti (questa frequenza è di 7-15 mM concentrazione di tubulina solubile esaminati a 28-32 ° C ) ^4. Diverse tecniche sono state quindi proposto di induzionee depolimerizzazione dei microtubuli in modo controllato. Microtubulo accorciamento può essere attivato da lavando via tubulina solubile ^5,6, il taglio microtubuli con un raggio laser ^7, oppure utilizzando microtubuli segmentati ^8, come descritto qui. Impieghi precedenti utilizzando microtubuli segmentati, così come polimeri stocasticamente commutazione, ha trovato che i piccoli carichi intracellulari, come cromosomi, vescicole, e perle rivestite con proteine, possono muoversi alle estremità dei microtubuli accorciamento ^9-13. Questo fenomeno è pensato per avere un'implicazione diretta per i movimenti cromosomiche nelle cellule in mitosi, ed i meccanismi di fondo sono attualmente sotto inchiesta attivo ^14-16.

Recentemente, tecniche fluorescenti-based, tra la fluorescenza totale interna riflessione (TIRF) microscopia, sono stati impiegati per studiare la motilità con microtubuli dinamica finisce ^17-24. Il vantaggio di questo approccio è che consente l'esame di interaziones tra i microtubuli e proteine ​​microtubuli vincolante in tempo reale utilizzando proteine ​​marcate con differenti fluorofori. Diversi complessi proteici sono stati trovati a muoversi processively con allungamento e / o accorciando le estremità del microtubulo. Essi comprendono le proteine ​​associate ai microtubuli Dam1 ^10,12,18, Ska1 ^19, e XMAP215 ^20, così come i motori chinesina Kif18A ^21,22, MCAK ²³ e CENP-E ^24. Queste proteine ​​mostrano processive tip-tracking, che è fondamentalmente diversa da quella dei classici proteine ​​punta inseguimento come EB1 ^25. Anche se le molecole EB1 ei partner associati sembrano rimanere stabilmente associata a microtubuli dinamica finisce, le singole molecole rimangono vincolati alla punta microtubulo solo ~ 0,8 secondi, rapido scambio con la piscina solubile ^26. Al contrario, processive punta-trackers, come Dam1, viaggiano con microtubuli finisce per molti micron, e la loro associazione con le punte dei microtubuli può durare per meventuali secondi. La punta associazione tempo, così come la velocità di inseguimento risultante, dipende fortemente dal numero di molecole che formano la punta inseguimento complesso ^27. Ensemble di proteine ​​più grandi sono di solito molto migliori tip-trackers. Ad esempio, tali insiemi complessi come isolate cinetocori lievito possono rimanere agganciati al microtubulo estremità per ²⁸ ore. Alcune proteine ​​microtubuli vincolante, ad esempio Ndc80 complesso proteico cinetocoro, sono stati trovati per essere in grado di monitorare con microtubuli termina a livello di singola molecola, ma Ndc80 è molto efficiente nel accoppiando il movimento del tallone carico ^19,29-31. Così, per comprendere il meccanismo di ribaltamento inseguimento da diversi complessi proteici, così come i loro ruoli biologici, è importante esaminare punta-tracking in funzione del numero di molecole del complesso-punta inseguimento, nonché per determinare la capacità di questi complessi di esporre motilità collettiva sulla superficie del cordone carico.

Qui di seguito forniamo protocolli dettagliati per preparare e condurre esperimenti con i microtubuli segmentati (Figura 1A). In primo luogo, i vetrini disponibili in commercio sono modificati per inserire tubo polietilene breve (protocollo 1). La camera di flusso microscopia riutilizzabile viene assemblato da un tale scorrimento e il plasma puliti e coprioggetto silanizzata (protocollo 2) ^32-34 o chimicamente. Il volume della camera risultante è solo il 20-25 microlitri (o piccolo come 15 microlitri, vedere Nota 3 nel protocollo 1), compreso il volume del tubo di ingresso. Camere di flusso commercialmente disponibili possono anche essere utilizzati, ma il loro volume è di solito più grande, che porta alla inutile spreco di proteine. Se una camera più grande è impiegato, il volume di tutte le soluzioni nei protocolli indicati deve essere scalata proporzionalmente. Semi di microtubuli vengono poi preparati, ad esempio utilizzando lentamente idrolizzabile GTP analogico, GMPCPP (5'-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (protocollo 3, vedi anche Hyman et al. ^35). I semi vengono immobilizzati su un vetrino pulito e la superficie viene successivamente bloccate per impedire l'assorbimento aspecifico di altre proteine ^​​32 (protocollo 4 descrive semi immobilizzazione utilizzando digossigenina). I microtubuli segmentati possono quindi essere preparati utilizzando il protocollo 5. La motivazione principale di questo approccio è che i polimeri microtubuli dinamiche, che formano in presenza di GTP, possono essere stabilizzati temporaneamente aggiungendo le corte "tappi" di segmenti tubulina stabili, che contengono GMPCPP. Questi tappi contengono anche tubulina rodamina marcato, in modo che possano essere rimossi semplicemente illuminando il campo visivo con un laser 530-550 nm o una lampada a vapori di mercurio (Protocollo 6) ^36. Intensità di fluorescenza del segnale punta-tracking può quindi essere utilizzato per stimare il numero di molecole che viaggiano con lo smontaggio estremità del microtubulo, tenendo conto della disuniformità del campo di illuminazione microscopio (Protocollo 7). Un approccio simile può essere utilizzatoper studiare le interazioni tra microtubuli depolimerizzazione e perline rivestite con proteine, preparato come descritto in ²⁷ (protocollo 8). Alcune proteine ​​si legano facilmente alle pareti dei microtubuli segmentati, ma pinzette laser può anche essere utilizzato per contenere il tallone vicino alla parete del microtubulo, promuovendo in tal modo il suo legame.

Protocollo

Attrezzatura richiesta: Gli esperimenti descritti di seguito richiedono un microscopio ottico attrezzato per DIC e imaging di fluorescenza (Tabella 1). Campo chiaro illuminazione del LED può essere utilizzato per migliorare significativamente la rilevazione dei semi microtubuli coprioggetto-divisoria ^37, che sono difficili da osservare con una lampada alogena normale. Per controllare il flusso del liquido nelle camere di microscopia, le soluzioni devono essere scambiati con una pompa peristaltica capace delle velocità di flusso 10-100 microlitri / min. Una pompa siringa può anche essere utilizzato ma particolare cura deve essere presa per evitare bolle d'aria che si possono formare quando la velocità del flusso è cambiato bruscamente. Per la movimentazione perline proteiche rivestite, ad esempio per portarli vicino alla parete microtubulo segmentata, un nm raggio laser 1.064 onda continua può essere introdotto l'asse ottico del microscopio e concentrata ad alto obiettivo apertura numerica (1.3 o superiore) per produrre un trappola. Per l'analisi quantitativa della fluorescenzaintensità di singole molecole luce di eccitazione deve essere fornita da una sorgente laser-base poiché l'intensità di questa sorgente luminosa è più stabile di quella generata da una lampada a mercurio. Per ridurre al minimo le vibrazioni meccaniche, il microscopio deve essere collocato su un tavolo ottico. Attrezzature più sofisticate è necessario per studiare il movimento delle perline con la depolimerizzazione dei microtubuli finisce sotto una forza costante, e per misurare i segnali di forza a colpo singolo ^11,38,39, questi metodi saranno descritti altrove.

1. Produzione riutilizzabili flusso Chambers

Vetrini per camere di flusso riutilizzabili possono essere ordinati da un impianto di produzione di vetro locale utilizzando schemi di Figura 1B (vedi Tabella 2 per i dettagli circa il nostro fornitore). Con la fresatura ad ultrasuoni modificare vetrini da microscopio regolari (75 mm x 25 millimetri, 1,0 millimetri di spessore) per fare due scanalature 15 ± 1 mm lungo, 1,0 ± 0,1 millimetri di larghezza e 0,8 ± 0.05 mm di profondità.Distanza tra le estremità più vicini deve essere di 14 ± 1 mm; questa distanza è ottimale per una camera assemblato da 22 mm x 22 mm coprioggetto. Vedi Tabella 2 per un elenco di altri materiali.

1. Collocare un tubo lungo di polietilene 100 mm (OD 0,61 millimetri, tabella 2) in ciascuna scanalatura nella diapositiva, lasciando ~ 5 millimetri sporgenze alle estremità interne delle scanalature. Fissare i tubi all'interno delle scanalature con cianoacrilato, incorporare completamente i tubi all'interno delle scanalature.
2. Riempire i solchi con colla epossidica, evitando fuoriuscita del collante all'interno dei tubi. Lasciate asciugare la colla per ~ 1 giorno.
3. Con una lama di rasoio affilata intercettato solidificato colla massa 3-4 mm dall'estremità distale di ciascun sito di attacco, rimuovendo le parti prossimali al centro della diapositiva. I tubi devono rimanere all'interno delle loro scanalature. Rimozione delle parti prossimali anche tagliare e rimuovere le sporgenze interne, creando una superficie piana con due aperture del tubo.
4. Riempire una siringa con acqua e provase i tubi funzionino correttamente. Se il liquido scorre liberamente, mettere una goccia di colla epossidica (~ 5 mm di diametro) alle estremità esterne dei boschi, secchi per 1 giorno (Figura 1D). Questo renderà le camere più durevole, in modo che possa essere utilizzato più volte per molti mesi.
   Nota 1: Per effettuare una camera di un microscopio invertito, i vetrini devono essere modificate inoltre fare due piccoli fori alle estremità opposte delle scanalature (Figura 1C). Inserire i tubi attraverso i fori della diapositiva, piegare i tubi e farli stare ermeticamente all'interno delle scanalature (Figura 1E). Seguire i punti 1.2-1.4, ma rimuovere la colla epossidica da tutta la superficie, che sarà usato per fare una camera di flusso.
   Nota 2: Per ridurre il volume della camera, utilizzare fresatura per fare due rientranze 0,050 ± 0,005 mm di profondità, lasciando la parte centrale della slitta un'ampia 5.0 ± 0,5 mm e leggermente elevata (vedere "aree incise" a Figure 1B e 1C). Quando tegli flusso camera è assemblato (come descritto sotto), posizionare il nastro biadesivo all'interno di queste rientranze.
   Nota 3: Per riutilizzare queste diapositive modificati, dopo aver terminato gli esperimenti rimuovere il vetrino e nastro biadesivo con una lama di rasoio. Rimuovere il sigillante da peeling off e strofinando il vetrino con il 70% di etanolo. Mettere il vetrino in un contenitore con 1-2% di un detersivo per piatti laboratorio, collegare il tubo di una pompa peristaltica e profumato 50-70 ml, seguire a parità di volume di acqua deionizzata, asciugare e conservare in un vano privo di polvere.

2. Preparazione di Coprivetrini

Questo protocollo richiede 6-8 ore e vi aiuterà a preparare 12 lamelle. Avrete bisogno di un titolare vetrino ceramica e 3 coprioggetto vaschette di colorazione con coperchio, il volume vaso dovrebbe essere di 15 ml, quindi ogni terrà quattro lamelle accatastati insieme. Un vaso di vetro con un coperchio (250 ml) deve essere usato per incubare coprioggetto con silano. Utilizzare regolari vetrini No.1 (22 mm x 22 millimetri o 22 millimetri x 30 mm, vedere Tabelle 2 e 3 per un elenco dei materiali). Tutte le procedure devono essere eseguite in una cappa aspirante, mentre indossa guanti.

1. Mettere i vetrini nelle vaschette di colorazione coprioggetto di vetro e riempire i vasi con acetone. Incubare per 1 ora, lavare 10x con acqua deionizzata.
2. Incubare i coprioggetti 10 min con etanolo e lavare di nuovo 10x con acqua deionizzata.
3. Preparare la soluzione "piranha". Mettere 60 ml di soluzione di perossido d'idrogeno (30% in acqua) in un recipiente di vetro resistente al calore e aggiungere lentamente 100 ml di acido solforico (rapporto finale di acido di soluzione di perossido d'idrogeno è 5,3). Soluzione si surriscalda, questo è normale, ma usa cautela. Soluzione piranha è estremamente corrosivo! Utilizzare laboratorio di spessore cappotto, guanti e occhiali!
4. Riempite i vasetti vetrino di colorazione con la soluzione "piranha", chiudere le palpebre e posizionare i vasi in un bagno di acqua preriscaldata a 90 ° C per 1 ora.
5. Versare la soluzione molto "piranha"su e scartare come indicato dalle norme di sicurezza sul posto di lavoro. Lavare coprioggetto 10x con acqua deionizzata.
6. Riempite i vasetti di colorazione coprioggetto con 0.1 M KOH, incubare 10 min, e lavare 10x con acqua deionizzata. Questo neutralizzare eventuali residui di acido lasciati sui vetrini dopo il trattamento "piranha".
7. Vetrini secco uno alla volta tenendo ogni vetrino con le pinzette piatte con bordi rivestiti in teflon (per minimizzare i danni di una superficie di vetro) e mentre soffia azoto secco compresso. Assicurarsi che lamelle vengono essiccate completamente, perché la soluzione silano è altamente reattivo con l'acqua.
8. Stack i coprioggetti secchi in supporti di ceramica (12 coprioggetto per titolare), che dovrebbe essere accuratamente Pre-essiccata con azoto. Mantenere i titolari di ceramica coperte per evitare che la polvere di attaccarsi alla superficie del vetrino.
9. Coprire il fondo del vaso di vetro da 250 ml (6 cm di diametro) con setacci molecolari, di grado 564, per l'assorbimento di acqua.
10. Riempire il vaso con 200 ml diSoluzione PlusOne Repel silano e lentamente immergere un supporto in ceramica con coprioggetto in un vaso, chiudere il coperchio e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Questo creerà rivestimento idrofobo sulla superficie coprioggetto.
11. Rimuovere lentamente il supporto con coprioggetto dal vaso e trasferimento coprioggetto uno alla volta nei vasi coprioggetto colorazione piena di metanolo.
12. Collocare un metallo o piedistallo di vetro nel serbatoio acqua di una vasca sonora, in modo che il vaso coprioggetto colorazione viene immerso per 2/3 della sua altezza. Ultrasuoni a 70 W per 20 minuti, cambiando soluzione di metanolo ogni 5 minuti, quindi risciacquare 10x con acqua deionizzata. Se la silanizzazione funzionato correttamente, i vetrini appariranno asciutto quando viene rimosso dall'acqua.
13. Rimuovere completamente l'acqua residua con azoto, come sopra.
14. Interlay i coprioggetti con Kimwipes per evitare il contatto superficie-superficie tra le lamelle. Coprioggetto possono essere memorizzati in un contenitore sigillato per diverse settimane a temperatura ambiente.
    Nota 1: i passaggi 2,1-2,6 può essere sostituito con la pulizia dei vetrini con il detergente al plasma per 15 min a 30 W, riducendo notevolmente il tempo totale di preparazione. Pressione all'interno della camera di pulizia è fissato a 100-200 mTorr. Sia l'ossigeno atmosferico e compresso può essere utilizzato. Stack i coprioggetti plasma pulito in contenitori di ceramica e passare al punto 2.7.

3. Preparazione di semi microtubuli GMPCPP-stabilizzati

Questa procedura richiederà circa 1 ora e le conseguenti semi microtubuli sono stabili per 1-2 giorni a temperatura ambiente. Vedere la Tabella 4 per un elenco dei reagenti.

1. Miscelare sul ghiaccio:
   • 10 ml senza etichetta tubulina (100 micron, tabella 4) in BRB-80 tampone (Pipes 80 mm, 1 EGTA mm, 4 MgCl ₂ mM, pH 6,9 con KOH, supplemento di 1-2 mM DTT utilizzando un'aliquota fresca per ogni esperimento).
   • 2,6 microlitri marcata con digossigenina tubulina (Tabella 4). Regolare il volume a seconda della preparazione,tale che il rapporto finale di etichetta alla tubulina non marcato è ~ 1:10. Mescolare bene pipettando.
   • 1,4 microlitri GMPCPP 10 mm (concentrazione finale 1 mM)
2. Incubare 15 min a 35 ° C, i semi cresceranno 2-3 micron di lunghezza. Tempo Regolare, se la lunghezza microtubulo diverso si desidera.
3. Aggiungere 35 microlitri BRB-80 (preriscaldata a 35 ° C), mescolare pipettando e centrifugare per 15 minuti a 25.000 xg per agglomerare le semi a temperatura ambiente.
4. Gettare il surnatante, lavare il pellet delicatamente aggiungendo e rimuovendo 50 ml di caldo BRB-80.
5. Risospendere pellet bene in 25 microlitri BRB-80.

4. Fissaggio dei microtubuli Seeds alle Coprivetrini

Protocolli 4 e 5 richiedono 2-3 ore, in modo da due camere di flusso sono utilizzati al giorno.

1. Montare camera di flusso secondo le istruzioni del fabbricante, con vetrini silanizzate e passare al punto 4.2. Se si utilizza coprioggetto misura (protocollo 1), seguire la procedura below.
   1. Collegare due pezzi di nastro biadesivo (5 millimetri x 30 mm) lungo la centrale ~ 5 mm vasta area, mettere coprioggetto silanizzata in cima il nastro, premere con decisione.
   2. Riempire la camera con BRB-80 attraverso uno dei tubi e collegare entrambi i tubi con degli stuzzicadenti tondi.
   3. Spremere una piccola goccia di bicolore Kwik Cast sigillante sulla cima di una capsula di Petri piccolo di plastica, e mescolare rapidamente, ma accuratamente con uno stuzzicadenti. Il sigillante diventerà verde, applicare immediatamente, con attenzione sigillare tutti i bordi del coprioggetto. Se il sigillante penetra troppo in profondità sotto il vetrino, aprire uno dei tubi togliendo il tappo stuzzicadenti e applicare una leggera pressione per impedire la fuoriuscita del sigillante all'interno dei tubi.
   4. Lasciare asciugare camera per 10 minuti e confermare che il flusso non è limitato prima di procedere ulteriormente.
2. Posizionare la camera su un palco microscopio preriscaldata a 32 ° C e collegare uno dei tubi ad una pompa, che pompa il liquido. La lunghezza del tubo di ingressodovrebbe essere minimizzato per evitare inutili perdite di reagenti: la lunghezza consigliata è 5-7 cm. Immergere tal fine, in un flacone da 0,5 ml con BRB-80 buffer. Questa e tutte le soluzioni qui di seguito dovrebbe essere preriscaldata a 32-35 ° C.
3. Applicare una leggera pressione con una pompa o semplicemente sollevare l'estremità del tubo di uscita per spremere le bolle d'aria, che possono formare occasionalmente quando la spina tubo di ingresso viene rimosso.
4. Impostare la velocità della pompa a 100 l / min. Lavare con 2 volumi della camera di anticorpi anti-digossigenina diluito 1:30 in BRB-80, incubare 15 min per consentire l'anticorpo adsorbimento.
5. Lavare con 5-10 volumi da camera di caldo BRB-80, incubare 10 minuti con 1% Pluronic F-127 in BRB-80 per bloccare la superficie idrofoba del vetrino silanizzata.
6. Lavare con 5-10 volumi da camera di tampone motilità (BRB-80 integrate da 0,4 mg / ml di caseina).
7. Ridurre la velocità della pompa a 10 ml / min e profumato semi microtubuli diluiti 1:200-1:600 ​​nel 30-40 buffer di motilità microlitri. Incubare 15 kmn promuovere vincolante dei semi agli anticorpi coprioggetto-adsorbito.
8. Lavare la camera a 100 l / min con 400 ml di buffer di motilità per rimuovere il materiale non legato.
   Nota 1: La densità del seme dovrebbe essere 10-30 per campo ottico (Figura 2A). Per risolvere i problemi, utilizzare tubulina fluorescente durante la polimerizzazione (fase 3.1) per una facile individuazione dei semi coprioggetto iscritti.
   Nota 2: assonemi preparati Chlamydomonas ⁴⁰ o altre fonti biologiche, nonché le pellicole di lisati e deciliated cellule Tetrahymena ⁴¹ possono essere utilizzati anche come microtubuli nucleatori. Questi nucleatori sono utili per creare piccoli array microtubuli, e sono da preferire quando microtubuli con un numero specifico di protofilamenti sono desiderati (nucleates seme GMPCPP uno microtubuli che contiene ≥ 14 protofilamenti ^42). Queste strutture possono essere collegati ai vetrini puliti per assorbimento aspecifico, ma attachment di solito è meno stabile rispetto con attacco a base di anticorpi, soprattutto quando si utilizzano i coprioggetti silanizzate.

5. Preparazione del segmentata microtubuli

Tutti i volumi soluzione qui di seguito sono per il volume della camera di 15-20 ml; aumentare proporzionalmente in caso di utilizzo da camera più grande.

1. Preriscaldare mix tubulina senza etichetta (buffer motilità 45 microlitri integrato con 1 mM Mg-GTP e 10-15 micron tubulina senza etichetta) per 30 sec a 35 ° C. Perfusione a 30 microlitri / min.
2. Monitorare la crescita dei microtubuli con ottica DIC (Figura 2B, Video 1). Durante 5-7 min di incubazione i microtubuli di solito crescono lungo ~ 10 micron.
3. Preparare mix rodamina-tubulina (65 microlitri tampone motilità supplementato con 0,5 mM GMPCPP e 2-5 mM di tubulina rodamina marcato con 0,5-1 rapporto molare di rodamina alla tubulina) e riscaldare la soluzione a 35 ° C per 30 sec.
4. Profumato subito a 30 μl / min. Incubare per 8-10 min per promuovere la formazione di tappi fluorescenti stabili alle punte microtubuli. Segmenti microtubuli stabili anche nucleazione spontanea e saranno visibili con ottica DIC.
5. Lavare la camera ben con 100 microlitri di tampone motilità a 20 ml / min per rimuovere tubulina e nucleotidi, così come frammenti solubili microtubuli.
6. Con DIC, confermano che i microtubuli sono visibili (Figura 2D), il loro numero, tuttavia, dovrebbe diminuire perché molti microtubuli smontare durante la tappatura (Video 2 mostra un tipico campo con microtubuli segmentati).
   Nota 1: segmentato microtubuli sono molto stabili e possono essere utilizzati per almeno 2 ore. Tuttavia, la vita di questi microtubuli diminuisce con eccessivo scambio soluzione, o se 2-mercaptoetanolo è usato nel buffer di imaging.

6. L'osservazione sperimentale del monitoraggio Proteina con depolimerizzante microtubuli Ends

1. Introduce 30-50 ml di proteina fluorescente (0,1-20 nM) nella camera a 10 microlitri / min. Se la proteina che attacca il vetrino è evidente, integrare il buffer motilità con 4-8 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-tracking richiede inoltre 10 mM DTT o 0,5-1% βME ^10.
2. Limitare il campo di illuminazione mediante un diaframma di campo microscopio per evitare lo sbiancamento inutile e smontaggio dei microtubuli.
3. Inizia acquisizione video utilizzando il filtro GFP cubo, quindi passare a filtro Rhodamine cubo senza interrompere la registrazione delle immagini. I segmenti rossi alle estremità del microtubulo devono essere ben visibile; cominceranno a svanire e disintegrarsi rapidamente (Video 3).
4. Continuare a illuminare fino a quando i tappi quasi scompaiono (di solito per 10-20 secondi, ma questa volta sarà più lungo per i tappi cresciuti con un più basso rapporto di etichettatura Rhodamine), e tornare al canale GFP per registrare proteina inseguimento con microtubuli smontaggio.
5. Analizzare ilrisultanti sequenze costruendo kymographs, immagini cioè bidimensionali che mostrano l'intensità di fluorescenza lungo l'asse microtubuli per varie volte durante l'osservazione) utilizzando MetaMorph, liberamente disponibile ImageJ o altro software di elaborazione delle immagini (Figura 2E).
   Nota 1: tasso di acquisizione dovrebbe essere regolata a seconda della tempistica degli eventi osservati. La velocità consigliata è di 2-3 fotogrammi al secondo (fps) per il lento movimento, anello di dimensioni Dam1 complessi ^27, ma il tempo di acquisizione di singole molecole deve essere> 20 fps ^19.
   Nota 2: Una EMCCD altamente sensibile, ad esempio ANDOR iXon3, è richiesto per la registrazione rapida di eventi punta inseguimento con microtubuli depolimerizzante. Le impostazioni consigliate per la fotocamera Andor iXon3 sono: 5x guadagno, EM guadagno 200, 1 MHz di velocità di lettura, modalità sensore a 16 bit, 80 tempo di esposizione msec.
   Nota 3: Utilizzando la microscopia TIRF permetterà di migliorare il rapporto segnale-rumore, tuttavia, devono essere utilizzati i microtubuli più brevi, come that i tappi di stabilizzazione fluorescenti rimangono alla portata di campo evanescente.

7. L'analisi quantitativa del Molecular Dimensioni di microtubuli Complessi Tip-tracking

Il razionale di questo approccio è quello di determinare il numero di molecole in un complesso a punta inseguimento trovando il rapporto di intensità di fluorescenza totale del complesso punta tracking per l'intensità di un singolo fluoroforo. Questo approccio può essere applicato a fusioni GFP-proteine ​​e proteine ​​marcate con coloranti fluorescenti, ma può sottovalutare il numero di molecole in complessi punta-tracking se alcune molecole proteiche nei preparati non sono fluorescenti.

1. Record cinetica Fotodecolorazione per le molecole di proteina fluorescente.
   1. Montare regolare camera di microscopia utilizzando un vetrino nonmodified, due strisce di nastro biadesivo, e un coprioggetto pulito, che può essere preparato utilizzando l'intero protocollo 2, o passi solo 2,1-2,6 di questoprotocollo.
   2. Aggiungere circa 50 nM in tampone proteico motilità, lavare brevemente con tampone motilità e sigillare la camera con VALAP (Tabella 4). Ottimizzare concentrazione di proteine ​​per ottenere il campo con macchie uniformemente dispersi (Figura 3a), in rappresentanza di singole molecole e dei loro piccoli aggregati (trimeri e tetrameri, che possono formare spontaneamente in soluzione o possono apparire quando diverse molecole singole sono ravvicinati e non possono essere risolte) . Questo passaggio è molto importante per ottenere una distribuzione multi-picco di passi photobleaching e determinazione accurata di un passo (vedi sotto).
   3. Ridurre al minimo l'intensità del laser di illuminazione in cui le macchie fluorescenti singoli sono ancora visibili, con illuminazione minore è il tempo di photobleaching è esteso, in modo da tracce più photobleaching possono essere ottenuti. Inoltre minimizzare il tempo di esposizione per ridurre la probabilità di più di una sbianca fluoroforo durante un frame. L'impostazione consigliataper Andor iXon3 fotocamera: guadagno 5.0x, EM guadagno 999, 10 MHz di velocità di lettura, 50-100 tempo di esposizione msec.
   4. Concentrarsi sulla superficie del vetrino, chiudere l'otturatore illuminazione, spostarsi in un campo fresco, aprire l'otturatore illuminazione e acquisire immagini fino a quando tutti i complessi sono sbiancato (di seguito la IMG (x, y)).
2. Correggere le immagini acquisite per irregolarità di illuminazione (Figura 3B).
   1. Preparare la soluzione di qualsiasi fluoroforo, ad esempio, 1 mM fluoresceina isotiocianato (FITC) in BRB-80. Tale soluzione può essere preparata in anticipo, suddiviso in aliquote e conservato a -20 ° C.
   2. Assemblare una camera come nella sezione 7.1.1, ma utilizzare un vetrino normale. Aggiungere la soluzione fluoroforo e sigillare la camera con VALAP.
   3. Raccogliere> 50 immagini dell'intero settore microscopio: spostare il palco per una nuova area greggi, mentre l'otturatore illuminazione è chiuso, e di acquisire le immagini immediatamente dopo l'apertura dell'otturatore.
   4. (Figura 3C). L'immagine risultante rappresenta la distribuzione della intensità di illuminazione del campo (Illum (x, y), dove xey corrispondono alle coordinate di pixel).
   5. Determinare la massima luminosità dei pixel di questa immagine (Max (Illum)).
   6. Con l'illuminazione otturatore chiuso e con le impostazioni della fotocamera stessa come nella sezione 7.2.3 acquisire una sola immagine, determinare l'intensità media dei pixel di questa immagine, questo valore corrisponde a CN, il rumore della fotocamera.
   7. Utilizzare i valori di cui sopra e l'immagine (Illum (x, y)) per normalizzare l'immagine sperimentale (img (x, y)) utilizzando la seguente espressione:
      
      Utilizzare la ^norma immagine img risultante (x, y) per l'analisi quantitativa del brightness dei complessi fluorescenti fissi, e anche per normalizzare le immagini con complessi-punta virata (Figura 3D).
3. Determinare l'intensità di un singolo fluoroforo.
   1. Utilizzando le immagini normalizzate img ^norma (x, y) e qualsiasi software di elaborazione delle immagini selezionare una macchia fluorescente con una regione circolare (5-6 pixel di diametro) e determinare la sua intensità integrale per tutti i fotogrammi, generando le tracce Fotodecolorazione. Evitare stessi punti luminosi (> 5 volte più luminoso di quelli dimmer).
   2. Con lo stesso strumento regione circolare, selezionare almeno 3 aree gratuito in loco, generare i corrispondenti tracce photobleaching, medi e in forma con funzione di decadimento esponenziale.
   3. Tabulare questa curva di intensità bassa per abbinare i punti di tempo sperimentali e sottrarla dalle curve Fotodecolorazione.
   4. Smussare le curve Fotodecolorazione (media con la finestra scorrevole di 3-5 punti). Ispezionare visivamente le curve e le conseguentiscartare qualsiasi curva che mostra un brusco aumento della fluorescenza o mancanza di sbiancamento evidente (Figura 3E).
   5. Per ciascuno dei rimanenti curve (di solito 50-70% del numero totale di curve), selezionare visivamente il plateau finale, quando la macchia fluorescente è sbiancata. Accorciare questo segmento di lasciare solo ~ 100 punti e una media di queste intensità. Sottrarre questo valore dalla curva photobleaching accorciato per minimizzare piccole variazioni sia i livelli di fondo e di ridurre le dimensioni del picco sfondo (sotto).
   6. Tracciare un istogramma delle intensità per tutti i punti temporali provenienti da 20 o più curve Fotodecolorazione (> 1.000 punti di tempo). L'istogramma dovrebbe presentare almeno 4 picchi distinti (vedi nota 2).
   7. Montare l'istogramma con equidistante distribuzione gaussiana ^10,43 con MATLAB, Mathematica o software simile (Figura 3F):
      
      wqui A _i e σ _i, d ed N sono parametri di montaggio. Parametri A _i e σ _i otterrebbero ampiezza e di i-esimo picco, d è la distanza tra i picchi, N è il numero intero che corrisponde al numero totale di picchi nella distribuzione. Se centri delle prime 3 o più picchi mostrano una buona corrispondenza visivamente alla linea adattata, la distanza tra questi picchi (parametro d) corrisponde ad una intensità di fluorescenza di un singolo fluoroforo.
      Nota 1: Numero di punti esaminati (Sezione 7.3.6) deve essere aumentato se il sistema di microscopia presenta forti vibrazioni o c'è un'altra fonte di rumore (raggio laser ad es instabile).
      Nota 2: E 'essenziale per ottenere> 3 picchi per analisi accurate equidistante fit gaussiano. Se si ottengono minor numero di picchi, il falso (ad esempio doppio) passo potrebbe essere ottenutaquando le condizioni di illuminazione non sono ottimali, ad esempio quando i punti candeggina passaggi troppo veloci e singoli non vengono risolti bene.
4. Determinare la dimensione molecolare del complesso punta inseguimento.
   1. Utilizzare le immagini raccolte con il protocollo 6 e selezionare i primi 2-4 fotogrammi, che sono stati acquisiti immediatamente dopo l'apertura dell'otturatore. Se il campo è stato illuminato per qualche tempo prima è stata osservata la punta-tracking, stimare l'intensità originale dai cinetica di photobleaching nelle stesse condizioni sperimentali.
   2. Calcolare la media dei fotogrammi selezionati e normalizzare l'immagine risultante come nelle sezioni 7.2.5-7.2.7.
   3. Misurare l'intensità integrante del complesso punta tracciamento fluorescente utilizzando la stessa dimensione di interesse nella sezione 7.3.1.
   4. Misurare l'intensità integrante del 3 zone di fondo situate nei pressi del complesso di punta il monitoraggio e usando la stessa regione, la media di questi valori e sottrarre l'intensità del complesso punta di inseguimento dalla Sezione 7.4.3.
   Calcolare il numero di molecole di fluoroforo nel complesso dividendo l'intensità fluorescente ottenuto al punto 7.4.4 dall'intensità del singolo fluoroforo ottenuto nella sezione 7.3.5.
   Nota 1: È auspicabile che le impostazioni di illuminazione e di acquisizione di protocollo 7.4 sono le stesse come nel protocollo 7.1. Se sia il tempo di esposizione o l'intensità del laser è stato adeguato durante queste fasi, i valori fluorescenti risultanti dovrebbero essere scalati di conseguenza. Tuttavia, l'accuratezza della scalatura vanno verificate mediante l'imaging stesso campione (ad esempio tempo fluorescente) in queste diverse condizioni e calcolando il rapporto tra le intensità risultanti.

8. Microtubuli Tip-tracking dai Beads Proteine ​​patinata

1. Effettuare esperimenti con perline tip-tracking innescando MT smontaggio come nel protocollo 6. Intensità della fonte di luce DIC dovrebbe essere ridotto per consentire la visualizzazione Rhodamine fluorescenza contemporaneamenteDIC imaging.
2. Preparare le perle come in Grishchuk et al. ¹⁰ e Asbury et al. ¹¹ Introdurre 30-50 microlitri di sospensione di sferette nella camera a 10 microlitri / min. La concentrazione tallone suggerito è 10 ^-16 -10 ^-17 M.
3. Se si utilizza il microscopio in posizione verticale, rimuovere la camera dal palco microscopio e capovolgere per 5-10 minuti per consentire perle di sedimento sul vetrino. Questo favorisce una migliore vincolante del tallone ai microtubuli impastoiati al vetrino, ma questa procedura non è successo con 0,5 micron perle di polistirene, che mostrano poca sedimentazione a gravità in un tempo così breve.
4. Selezionare un cordone che è collegato al microtubulo coprioggetto-legato, il tallone dovrebbe muoversi in un chiaro arco di ⁴⁴ (Figura 4A). Il cordone legato deve essere posizionato 1-3 micron dalla superficie coprioggetto, che è chiaramente visibile a causa delle occasionali coprioggetto iscritti perle che rimangono motionless.
5. Passare per filtrare Rhodamine cubo e iniziare a raccogliere le immagini durante l'utilizzo di illuminazione DIC.
6. Otturatore aperto per illuminare il campo di imaging (restrizione con un diaframma di campo) con una lampada al mercurio o 530-550 nm laser. Si effettua la registrazione fino a quando il cordone si stacca o si muove con la fine smontaggio dei microtubuli (figure 4D, 4F e 4G).
   Nota 1: trappola ottico può essere usato per promuovere l'interazione tra la parete del microtubulo e tallone proteina rivestite. Ciò è particolarmente utile quando si lavora con perle rivestite con motori chinesina (figure 4E-G). Segui stessi protocolli come sopra, ma integrare tampone motilità con 2 mM Mg-ATP. Nel passo 8.3, catturare una perlina fluttuante con il raggio laser 1.064 nm, spostare la fase di portare il tallone intrappolata più vicino alla parete del microtubulo segmentato. Iniziare di imaging con luce scarsa DIC e attraverso il filtro cubo Rhodamine e attendere che il tallone di iniziare a camminare verso la fine microtubuli capped. A poppaer il movimento tallone diretto si osserva, chiudere l'otturatore per intrappolare trave e aprire l'otturatore per l'illuminazione fluorescente. Si effettua la registrazione fino a quando il cordone si stacca o tracce con la fine microtubuli smontaggio.

Risultati

Proteine ​​inseguimento con depolimerizzante microtubuli finisce. Lievito cinetocoro componente Dam1 è di gran lunga il miglior consiglio-tracker del microtubulo depolimerizzante finisce ^14. Questo complesso di 10 subunità marcato con GFP può essere facilmente espresso e purificato da cellule batteriche ^18,38, quindi si raccomanda di usarlo come controllo positivo per il test-punta inseguimento. Una proteina fluorescente che tiene traccia con la fine depolimerizzante di un microtub...

Discussione

Molti saggi singola molecola al giorno d'oggi usano abitualmente coprioggetto appositamente trattata per ridurre drasticamente aspecifica di proteine ​​attaccare. La procedura che descriviamo qui è una modifica del protocollo originale sviluppato in laboratorio Howard ^32, e troviamo che silanizzante i coprioggetti è valsa la pena, anche con saggi di perline basati DIC, che non utilizzano la fluorescenza. Chambers assemblati con tali coprioggetto mostrano superfici più puliti, ed i risultati ottenuti in pr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tabella 1. Microscopia e altre apparecchiature.
Microscope	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	è possibile utilizzare altri modelli di microscopio in grado di eseguire DIC e imaging a epifluorescenza
Obiettivo	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Olio 1.49	100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Riscaldatore dell'obiettivo	Bioptechs	150803, 150819-19
Cubo con filtro fluorescente	Chroma	49004 o 49008 41017 o 49020	ottimizzato per la fluorescenza della rodamina ottimizzato per la fluorescenza GFP
Software di acquisizione	freeware MicroManager Molecular Devices	non applicabile MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ altri software possono essere utilizzati per acquisire immagini e per un tracciamento delle particelle
Telecamera EMCCD	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Telecamera EMCCD altamente sensibile
Laser di intrappolamento	IPG Laser Photonics	YLR-10-1064-LP	da 1.064 nm,
laser ad eccitazione a fluorescenza	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Zaffiro 488 LP Zaffiro 552 LP	eccitazione di fluorofori verdi eccitazione di fluorofori rossi
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-001
Camere di flusso commerciali	Warner Instruments	RC-20 o RC-30
Pompa di perfusione	Cole Palmer Harvard Apparatus	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Entrambe le pompe forniscono la portata di liquido richiesta, ma una pompa peristaltica può pulsare a velocità molto bassa. Il flusso con una pompa a siringa è più costante per un'ampia gamma di velocità, ma questa pompa ha inerzia.
Tabella 2. Preparazione della camera per microscopia.
Vetrini per microscopio modificati per camere riutilizzabili	Soffiatura di precisione del vetro del Colorado	Ordine personalizzato www.precisionglassblowing.com	Fessure soniche nei vetrini utilizzando schemi in Figura 1
Tubo in polietilene	Intramedic	427410	D.I. 0,58 mm, D.E. 0,965 mm; utilizzare questi tubi per collegare la camera assemblata alla pompa e al contenitore dei rifiuti
Tubo in polietilene	Intramedic	427400	D.I. 0,28 mm, D.E. 0,61 mm; utilizzare questi tubi per realizzare la camera riutilizzabile
Vetrini per microscopio regolari VWR		48312-003	È possibile utilizzare altri vetrini simili
Vetrini coprioggetti	VWR	48393-150, 48366-067	È possibile utilizzare altri vetrini coprioggetti simili
Sigillante	siliconico World Precision Instruments	KIT, SIGILLANTE SILICONICO 5 MIN CURE
Colla epossidica	Loctite	83082
Adesivo cianoacrilato	Scotch 3M	AD114	O adesivo cianoacrilato di altri produttori
Tabella 3. Pulizia e rivestimento dei vetrini.
Setacci molecolari, grado 564	Macron	4490-04
Barattolo per colorazione in vetro di copertura	Ted Pella, Inc.	21036
Supporto in ceramica per vetrino coprioggetti	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silane	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-digossigenina AB	Roche Applied Science	11093274910
Tabella 4. Preparazione di semi e microtubuli segmentati.
Tubulina	purificata da cervelli di mucca Cytoskeleton, Inc	T238P	Per i protocolli di purificazione vedere 49– 51 Tubulina suina non marcata
Tubulina marcata	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (rodamina) A-2952 (digoxigenina)	Tubulina suina marcata con rodamina La tubulina può essere marcata con qualsiasi colorante reattivo all'ammina come in riferimento52.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot e conservare a -70 gradi C
VALAP	Vaselina, lanolina e paraffina a 1:1:2 in massa		vedi riferimento9