Articolo metodologico

Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

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⸱

DOI:

10.3791/51153

⸱

26 novembre 2013

 ,  ,  , 
1The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 2Department of Molecular Biology, Princeton University, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per la rapida costruzione di fattori di trascrizione artificiali (ATF) con i reporter GFP cognate e la quantificazione della capacità ATF di stimolare l'espressione della GFP mediante citometria a flusso.

Abstract

Biologia sintetica mira a progettare e costruire razionalmente circuiti sintetici con proprietà quantitativi desiderati, nonché fornire strumenti che consentono di analizzare la struttura dei circuiti di controllo native. In entrambi i casi, la possibilità di programmare l'espressione genica in maniera rapida e sintonizzabile, senza effetti off bersaglio, può essere utile. Abbiamo costruito ceppi di lievito contenenti il promotore ACT1 monte di una cassetta URA3 seguito dal dominio di legame del ligando del recettore di estrogeno umano e VP16. Trasformando questo ceppo con un prodotto di PCR lineare contenente un dominio di legame al DNA e selezionando contro la presenza di URA3, un fattore di trascrizione artificiale costitutivamente espresso (ATF) può essere generato mediante ricombinazione omologa. ATF ingegnerizzati in questo modo può attivare un gene bersaglio unico in presenza di induttore, eliminando in tal modo sia l'attivazione off-target e condizioni di crescita non fisiologici trovati con Conditi comunemente usatosistemi di espressione genica onal. Viene inoltre fornito un metodo semplice per la costruzione rapida di plasmidi reporter GFP che rispondono specificamente a un fattore di trascrizione nativo o artificiale di interesse.

Introduzione

Sviluppare interruttori genetici nel lievito è di grande interesse per la ricerca sia accademica che industriale. Nel caso ideale, interruttori genetici possono essere utilizzati per attivare un gene particolare (o insieme di geni) solo quando desiderato dallo sperimentatore. Sequenza codificante di un gene posto a valle di un promotore sintetico non è espresso in assenza di una molecola che induce: su induttore Inoltre il gene deve essere espresso rapidamente. E 'stato solo recentemente dimostrato che tale interruttore può essere progettato in lievito, quando, in assenza di induttore, il ceppo mostra un fenotipo delezione, ma in presenza di induttore, espressione viene attivato in proporzione al livello di induttore in tutte le cellule 1,2. Storicamente, sistemi di espressione condizionali in lievito hanno fatto affidamento su di sequenze di DNA di nutrienti-sensibile, tra cui il MET, PHO, e promotori GAL (le cui attività sono sensibili ai livelli extracellulari di metionina, fosfato egalattosio, rispettivamente). Mentre espressione condizionale può essere realizzato, si tratta a costo di significativi effetti pleiotropici.

Recettori ormonali come i recettori degli estrogeni umani hanno dimostrato di essere efficaci interruttori in eucarioti 3,4. In assenza di ormone, una proteina fusa ad un recettore ormonale può essere sequestrato nel citoplasma dove interagisce con il complesso chaperone Hsp90. In seguito al legame del ligando appropriato, il recettore subisce un cambiamento conformazionale, facendolo essere rilasciato dal complesso chaperone Hsp90 e rivelare un segnale di localizzazione nucleare. Per osservare le dinamiche di localizzazione di una particolare proteina-recettore contenente ormone, abbiamo creato una fusione C-terminale di Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, un fattore di trascrizione sintetico contenente il dominio di legame al DNA Gal4p, il dominio di legame del ligando del recettore di estrogeno umano , e VP16) con GFP 2. Localizzazione nucleare è stata osservata entro 8 minuti in seguito all'aggiunta disaturando quantità di induttore, ß-estradiolo, alla quale tipo selvatico lievito è completamente inerte. A questo punto, la maggior parte delle cellule hanno chiaramente visibili siti attivi per la trascrizione di geni bersaglio GEV (dosati mediante ibridazione in situ fluorescente) e mRNA completamente maturi 2,5. GEV geni bersaglio aumento nell'espressione> 2 volte entro 2,5 min 2,6 (misurata utilizzando microarrays), dimostrando che essa impiega <2,5 min per l'attivatore chimerico di traslocare al nucleo, legare il DNA, e attivare la trascrizione.

Mentre molti altri on-switch sono stati applicati in lievito che utilizzano varie piccole molecole o farmaci (inclusi i classici interruttori a base di doxiciclina da Escherichia coli 7,8 e un interruttore a base di indaco-9 da Arabidopsis thaliana), nessuno ha raggiunto la velocità, specificità, o tensione di regolamentazione esibito da interruttori a base di ormoni. Vale la pena ricordare tcappello rapido off-switch sono stati anche sviluppati nel lievito, e in genere funziona fondendo un gene per una proteasi o ubiquitina ligasi di targeting sequenza 2,10,11,12. La possibilità di rimuovere rapidamente una proteina bersaglio dalla cella facilita lo studio di geni essenziali e geni che sono inclini a soppressione genetica quando soppresso 10.

I metodi descritti in questo protocollo sono per la costruzione e la caratterizzazione sintetica-switch nel lievito. In primo luogo, mostriamo come generare rapidamente proteine ​​di fusione genomically integrati costituiti da un dominio di legame al DNA di interesse, il ligando dominio del recettore degli estrogeni umani vincolante, e VP16 (DBD-EV). Seguendo il nostro protocollo, la proteina di fusione è espressa da un promotore ACT1. Abbiamo poi mostreremo come creare un reporter plasmide affine per l'ATF e testare la sua funzionalità mediante citometria a flusso. Sebbene prevediamo questi plasmidi reporter in uso con nuove ATF (Figura 1), si possono be utilizzati come reporter per un attivatore trascrizionale nativo pure. Infine, vengono forniti dettagli per testare l'effetto dell'attivazione ATF sulla crescita delle cellule in piastre da 96 pozzetti e per l'ingegneria inducibili alleli genomiche.

Protocollo

La Figura 2 fornisce uno schema di protocollo sezioni 1-3.

1. Creazione di ATF

  1. Crea primers per PCR amplificare DNA binding domain di interesse. Omologia con il recettore promotore EFF1 e ormone (come descritto nelle figure 3 e 4) è aggiunto mediante PCR per facilitare la corretta ricombinazione nel ceppo yMN15.
  2. PCR amplifica DBD di interesse utilizzando un polimerasi ad alta fedeltà.
  3. Trasformazione> 1 mg di prodotto di PCR purificato in lievito utilizzando il metodo acetato di litio 13.
  4. A seguito di trasformazione, celle di rotazione alla massima velocità per 15 secondi in microcentrifuga e rimuovere trasformazione mix.
  5. Risospendere in ~ 200 ml di acqua sterile e piatto su YPD.
  6. Il giorno successivo, piastra replica da YPD su piastre 5-FOA (piastre 5-FOA sono fatti come descritto nel manuale di lievito Cold Spring Harbor) 13.
  7. Consentire la crescita per 2-4 days, e restreak almeno 5-10 colonie su YPD. Eseguire una colonia PCR utilizzando i primer in Tabella 1 e la sequenza di verificare inclusione.

2. Creazione di ATF plasmidi Reporter

  1. Determinare il sito di legame ATF (più probabile che provengono dalla letteratura).
  2. Nell'ordine desiderato regione vincolante oligo (o Ultramers, se necessario). Ordine come top e filoni di fondo con sbalzi corretti per Notl & XbaI come indicato nella Tabella 2.
  3. Diluire oligo concentrazioni equimolari (100 micron).
  4. Fosforilare utilizzando T4 polinucleotide chinasi e poi ricottura in un termociclatore. Le condizioni di reazione sono in Tabella 3.
  5. Digest ~ 1-2 mg di pMN8 con NotI-HF e XbaI per 1 ora a 37 ° C (condizioni di reazione nella Tabella 4).
  6. Gel purificare la fascia dorsale.
  7. Diluire il backbone purificata a 10 ng / ml.
  8. Diluire il doppio filamento, fosforileated sito di legame a 5 volte la concentrazione molare di backbone per microlitri.
  9. Utilizzando T4 DNA ligasi, legare i siti di legame nella catena principale digerito a temperatura ambiente per 30 minuti (Tabella 5).
  10. Per la trasformazione, aggiungere metà della reazione di ligazione a 50 ml di norma, chimicamente competenti Escherichia coli come XL1-Blue o DH5-Alpha.
  11. Cellule scossa di calore per 45 secondi in un bagno d'acqua a 42 ° e poi mettere in ghiaccio per 2 min.
  12. Aggiungere 900 pl di mezzo SOC di reazione di trasformazione.
  13. Crescere a 37 ° C per 1 ora su un tamburo rullo.
  14. Stendere 100-200 cellule microlitri per LB + AMP (100 pg / ml) piastra e incubare una notte.
  15. Crescere E. coli in LB + AMP liquido e la raccolta del DNA plasmide. Sequenza verificare nuovo plasmide reporter colonie legatura utilizzando il primer 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 '.
  16. Trasforma nuovo plasmide reporter di in-ATF contenenti lievito strain dalla sezione 1 con litio trasformazione acetato.

3. Quantificare l'effetto di ATF induzione sull'espressione genica Uso GFP Reporter

Preparazione dei campioni:

  1. Fai 25 mm magazzino β-estradiolo (10 ml di etanolo + 0,0681 g di β-estradiolo). Conservare in frigorifero.
  2. Grow ATF + Reporter contenenti ceppo pernottamento in 5ml SC-URA.
  3. Ottenere nove 250 ml scuotono palloni e aggiungere 25 ml di SC-URA a ciascuno.
  4. Aggiungere 0 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 mM, o 10 mM β-estradiolo. Questo è più facilmente fatto facendo diluizioni seriali di 10 volte della β-estradiolo magazzino 25 mm. Per una concentrazione finale di 10 mM β-estradiolo, aggiungere 10 ml di β-estradiolo magazzino 25 mM a 25 ml di SC-URA.
  5. Aggiungere 125 ml di culture durante la notte per fiaschi (1:200 diluizione).
  6. Per i due rimanenti boccette, inoculare con un costitutiva GFP produzione strain ed un ceppo privo GFP. Questi sono necessari per la calibrazione del citometro a flusso.
  7. Agitare a 200 rpm a 30 ° C per 12-18 ore.
    Nota: Il tempo ottimale di incubazione è determinata individuando quando induzione GFP non cambia più in seguito all'aggiunta di β-estradiolo.
  8. Prendete 500 ml di ogni cultura e spin giù in tubi di 1,7 ml microcentrifuga separate.
  9. Aspirare SC-URA.
  10. Risciacquare una volta in 1 ml di PBS +0,1% Tween-20 e aspirare.
  11. Aggiungere 1 ml di PBS +0,1% di Tween-20 e risospendere.
  12. Aggiungere 1 ml di PBS +0,1% Tween-20 per provette Falcon.
  13. Aggiungere le cellule risospese a 5 ml provette (volume finale = 2 ml) (può essere conservato a 4 ° C per diversi giorni).
  14. Optional: cellule Sonicare leggermente per rottura eventuali cellule clumped.
    Citometria a flusso: Descrizione: La fluorescenza delle cellule 10,000-100,000 è tipicamente analizzata per campione. I dati potranno essere trattati in FlowJo o utilizzare script personalizzati in MATLAB oR. Assicurarsi di calibrare tensione del canale GFP usando GFP controlli positivi e negativi. Una volta che i file FCS sono esportati, uno script come quello in figura 6 con le fca_readfcs funzionali ( http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) può essere utilizzato per elaborare il dati.
  15. Eseguire la citometria a flusso.
    1. Usa forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) per identificare le cellule di lievito.
    2. Impostare la portata di ~ 3.000 cellule / sec.
    3. Misurare GFP (canale FITC).
    4. ,. FCS file di esportazione volta che i dati vengono raccolti
  16. Caricare MATLAB.
  17. Spostare i file. FCS, fcs_readfcs.m, e uno script simile a quella in figura 6 nella stessa cartella.
  18. Cambiare la directory di lavoro alla cartella contenente i dati e gli script.
  19. Eseguire lo script di Figura 6 (nota: l'leggenda è stato inserito manualmente per produrre ciò che è visibile nella figura 7).

4. Quantificare l'effetto di ATF induzione sulla crescita delle cellule

  1. Da scorte congelate, realizzato su entrambi (1) un ceppo-ATF contenimento e (2) un ceppo-ATF manca (come yMN15) su piastre YPD separati.
  2. Dopo 2 giorni di crescita, inoculare provette di coltura separate contenenti 5 ml di liquido YPD con ogni ceppo e crescere per una notte a 30 ° C.
  3. Eseguire 10-diluizioni seriali di una soluzione madre mM β-estradiolo 0,25 fino a 10.000 volte (0.025 mM β-estradiolo) in etanolo al 100%.
  4. Aggiungere 40 ml di colture overnight a 10 ml di liquido YPD (1-250 diluizione).
  5. Per ogni ceppo, aggiungere 96 ml di cellule diluite a 18 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
  6. Aggiungere 4 ml di β-estradiolo alle cellule. Un punto essenziale è assicurarsi ogni pozzetto ha la stessa quantità di etanolo totale. (In alternativa, un mo re magazzino concentrata di β-estradiolo può essere utilizzato e successivamente diluite al punto gli effetti dell'etanolo sulla crescita non è misurabile).
  7. Eseguire in triplice copia. Tre dei pozzetti per ogni ceppo deve essere etanolo-solo controlli.
  8. Coprire la piastra a 96 pozzetti del gas membrana permeabile.
  9. Monitorare la crescita (OD 600) in lettore di piastre.
  10. Quantificare i tassi di crescita utilizzando un qualsiasi numero di metodi standard come trovare la massima pendenza.
    Nota: Abbiamo avuto un buon successo con l'open source software grofit 14, che viene eseguito in ambiente di programmazione R Vale la pena ricordare che, mentre i tassi di crescita calcolati da saggi piastra a 96 pozzetti rispetto a scuotere-palloni (25 ml culture). non sono necessariamente le stesse (a causa di entrambe le differenze nella fisiologia e nella strumentazione), abbiamo osservato che i tassi di crescita relativi sono simili (anche se questo può non essere sempre il caso).
tle "> 5. Crea inducibili Genomica alleli

  1. Ottenere pMN10, un plasmide noncentromeric con il promotore ATF-reattiva da pMN8 fusa KanMX (con orientamento opposto).
  2. Limitazione digerire il vettore backbone ed estratto gel come nella sezione 2.
  3. Tempra, fosforilare, e oligo Legare contenenti appropriate siti di legame come descritto nella Sezione 2.
  4. Sequenza di verifica. Questo plasmide servirà ora come stampo il DNA per creare l'allele inducibile.
  5. Ottenere il ceppo di lievito che esprime il corrispondente ATF di interesse.
  6. PCR amplifica la cassetta KanMX-Promoter (~ 2 kb) utilizzando primer dalla tabella 6.
  7. Trasformare il prodotto di PCR nel ceppo-ATF esprimere con il metodo acetato di litio.
  8. Piatto su YPD e la piastra replica su YPD + G418 il giorno seguente.
  9. Conferma appropriato inserimento del promotore utilizzando il primer forward (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') e un innesco inverso interna al secoloe gene il cui promotore è stato sostituito. L'innesco inverso è in genere progettati per essere tra 200-300 bp a valle del primo ATG 15. Il prodotto finale di PCR è ~ 1,2 kb.

Risultati

Figura 5 mostra l'induzione di GFP da Z 3 EV, Z 4 EV, o GEV nel tempo. Nota l'aumento della produzione GFP in risposta alle ATF contenenti domini di legame al DNA nonyeast. Recentemente abbiamo ipotizzato che questo risulta da questi fattori raggiungono singolo gene specificità nel genoma di lievito 1. Induzione GEV sola porta all'attivazione / repressione di centinaia di geni, mentre solo 3 EV Z e Z 4 EV attivare l'espressione di un gene bersaglio posto a valle di un promotore sintetico contenente opportuni siti di legame (5'-GCGTGGGCG-3 'e 5'- GCGGCGGAGGAG-3 ', rispettivamente) 1. Figura 7 illustra la stretta regolazione del sistema (risultati induttore in alcun rilevabile GFP) e che tutte le cellule vengono indotti in risposta ad induttore La capacità di Z 3 EV per indurre GFP attraverso una gamma di concentrazioni di β-estradiolo è mostrata in Figura 8.

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Figura 1. Fattori trascrizionali artificiali interagiscono con Hsp90 in assenza di β-estradiolo. Quando β-estradiolo si lega al ATF, Hsp90 dissocia, permettendo la ATF per entrare nel nucleo e attivare l'espressione dal plasmide reporter.

figure-results-2
Figura 2. Schema di protocollo per i ceppi di ingegneria che contengono fattori di trascrizione artificiali e costruzione / collaudo reporter GFP affini.

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Figura 3. La sequenza ACT1pr-URA3-EV nel ceppo yMN15 al locus LEU2.

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Figura 4. Progettazione di primer PCR per amplificare un dominio di legame al DNA di interesse con ulteriori omologia di sequenza per generare una nuova proteina di fusione quando trasformato con successo in yMN15.

figure-results-4
Figura 5. Induzione GFP da tre diverse coppie ATF-promotore in risposta a 1 mM β-estradiolo.

figure-results-5
Figura 6. Uno script MATLAB per il flusso di elaborazione citometria di dati. Questo script è stato adattato da http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .

figure-results-6
Figura 7. Induzione di GFP da Z 3 EV in risposta a 0 μ M β-estradiolo e 1 mM β-estradiolo seguente 18 ore di induzione. Fluorescenza era anche meaassicurata da cellule prive GFP per illustrare la stretta regolazione del sistema EV Z 3. Questa figura è stata generata utilizzando il codice nella Figura 6.

figure-results-7
Figura 8. Il rapporto tra la concentrazione di induttore e uscita espressione è classificato con un coefficiente di Hill ~ 1. (A) Distribuzione di espressione GFP in funzione della concentrazione di β-estradiolo. (B) La fluorescenza media delle distribuzioni da (A). I dati erano idonei per la funzione G (D) = G min + (G max-min G) D n / (n + K D n) dove D è la dose β-estradiolo, G e G min max sono minime e GFP valori massimi, resture rispettivamente, n è il coefficiente di Hill, e K è la dose β-estradiolo che produce ½ (G max + G min).

Oligonucleotide Sequence Nome
5'-TTGAAACCA
AACTCGCCTCT-3 ' 		DBD Verifica Forward
5'-tccagagac
ttcagggtgct-3 ' 		DBD partner di Reverse

Tabella 1. Primer per confermare corretta fusione DBD di interesse al Estrogen Receptor. Il primer forward è omologa promotore EFF1 e l'innesco inverso è omologo al recettore estrogeno. Per DBDS tipici (~ 300 bp), il prodotto di PCR è <1,5 kb.

Oligonucleotide Sequence Nome
5'-ggccgc ... site abbuffate DBD ... t-3 ' Top oligo
5'-ctaga ... DNA sito di legame inverso ... gc-3 ' In basso oligo
5'-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G
CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG
GGCG T GCGTGGGCG t-3 ' 		Top oligo + 6x zif268 siti di legame
5'-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC
CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC
CACGCACGCCCACgc-3 ' 		In basso oligo + 6x zif268 siti di legame

Tabella 2. S truttura di primer per la creazione di dsDNA contenenti siti di legame di interesse. Per creare la Z 3 EV-reattiva promotore, + 6x Zif268 rilegatura sono stati usati gli oligonucleotidi Top oligo + 6x zif268 siti di legame e inferiore oligo.Sequenze per creare le corrette sbalzi di DNA sono in minuscolo. Il sito di legame Zif268 consenso, GCGTGGGCG, viene sottolineato nella oligo superiore.

Reagente Importo
T4 polinucleotide Kinase Buffer 5 microlitri
T4 polinucleotide chinasi (@ 10.000 unità / ml) 1 ml
Top oligo (100 micron) 1,5 microlitri
In basso oligo (100 micron) 1,5 microlitri
Acqua 41 microlitri

Tabella 3. Fosforilare e primer ricottura in un termociclatore con 50 microlitri di reazione descritto sopra. Esistono due passi termociclatore. Passo 1: 37 ° C 30 min (fosforilare), e il passaggio 2: 95 ° C 30 sec (dimettersi 1 ° C ogni 30 sec fino a 4 ° C; Anneal).

Reagente Importo
XbaI 1 ml
NotI-HF 1 ml
DNA plasmidico 5 microlitri (1-2 mcg)
10x taglio intelligente Buffer 5 microlitri
Acqua 38 microlitri

Tabella 4. Limitazione digest di plasmide pMN8 con XbaI e NotI.

Reagente Importo
T4 ligasi Buffer 2 microlitri
T4 ligasi 0.2 microlitri
Backbone @ 10 ng / ml 1 ml
Legatura Sequenze @ 5x molare concentrazione / ml 1 ml
Acqua 15.8 ml

Tabella 5. Legare i siti di legame nel plasmide DNA.

Primer Descrizione
~ 40 bp a monte della ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 ' Forward primer per amplificare KanMX-Promoter
5'-reverse complemento (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 ' Reverse primer per amplificare KanMX-Promoter
5'-caatttgtctgctcaagaaaataaa
ttaaatacaaataaaCGCAC
TTAACTTCGCATCTG-3 ' 		Primer avanti per rendere promotore GCN4 swap.
5'-tggatttaaagcaaataaacttgg
ctgatattcggacatTATAGTT
TTTTCTCCTTGACG-3 ' 		Primer reverse per fare promotore GCN4 swap.

Tabella 6. PCR amplifica KanMX-Promoter per fare allele titratible.

Discussione

Gli interruttori a base di ormoni descritte hanno una miriade di applicazioni, dallo studio biologia cellulare nativo per valutare la capacità di un dominio di legame al DNA di interesse per indirizzare una sequenza di DNA in vivo. Il sistema ha molte caratteristiche desiderabili, tra cui una risposta graduata a induttore, azione veloce e stretta regolazione (cioè. Senza leakiness misurabile, vedi Figura 7). Tuttavia, c'è ancora margine di miglioramento ed espansione.

Un recente lavoro di biologia sintetica ha sottolineato sistemi sintetici di multiplazione e ampliando il repertorio di ben caratterizzati, parti di DNA programmabili 16. Indipendente, espressione condizionale di geni bersaglio distinti richiede sia più induttori e DNA domini di legame che mancano sovrapposizione specificità. La disponibilità di recettori ingegneria e naturali fornisce un ampio insieme di pezzi con cui sviluppare nuovi fattori di trascrizione artificiale. Ampliare ilrepertorio di interruttori mutuamente ortogonali è stato notevolmente aiutato dalla evoluzione diretta approcci 17,18. Gli attuali sforzi per riprogrammare la specificità-ligando dei nostri fattori di trascrizione artificiali saranno presentati in futuro.

In precedenza, le conseguenze fenotipiche del gene delezione / iperespressione sono stati ampiamente studiati in lievito 19,20. Tuttavia, non è stato semplice per studiare l'effetto di espressione su diversi fenotipi su una gamma di livelli di espressione. Una caratteristica principale del sistema qui presentato è la sua natura graduata (Figura 8). Mentre spesso si pensa, il rapporto tra l'espressione genica e fenotipi di interesse può non necessariamente essere monotona. Fattori di trascrizione artificiali come Z 3 EV e Z 4 EV farà il compito di saggiare le risposte fenotipiche ai cambiamenti nell'espressione genica semplice.

Infine, i protocolli discutonoed in questo manoscritto sono per ingegneria e caratterizzare fattori trascrizionali artificiali che rispondono a β-estradiolo, tuttavia, un'importante alternativa ai domini chimicamente reattivo è l'uso di domini luce-responsive (come il PhyB/Pif3, LOV, e BLUF), attività di cui sono reversibili senza dover turbare il mezzo di crescita della coltura 21-23. Sistemi basati su luce facilitano il controllo spazio-temporale dell'espressione genica, le interazioni proteina-proteina, trasporto di ioni, e l'attività enzimatica, che hanno già dimostrato potente 21-26.

In conclusione, abbiamo presentato metodi per la costruzione rapida di inducibili, fattori di trascrizione artificiali in lievito. Questo protocollo fornisce un modello per la loro costruzione in congiunzione con i reporter GFP affini, nonché metodi per analizzare i dati giornalista citometria a flusso e saggiando l'effetto dell'attivazione ATF sulla crescita.

Dichiarazioni

McIsaac, Noyes, e Botstein (con gli altri) hanno presentato parte di questo sistema come un Disclosure brevetti.

Ringraziamenti

RSM riconosce finanziamento dal NSF Graduate Research Fellowship. MBN riconosce finanziamenti da Lewis-Sigler Fellowship e il dono dotati di Peter Lewis. DB riconosce finanziamenti del NIH (GM046406), l'Istituto Nazionale di General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). Riconosciamo Christina DeCoste per l'assistenza con gli esperimenti di citometria a flusso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagenteAziendaNumero di catalogoCommenti 
Espandi il sistema PCR ad alta fedeltàRoche11 732 650 001
T4 DNA ligasiNEBM0202S
Competente E. coliLife Technologies18258-012
EstradioloTocris Biosciences2824
AmpicillinaFisher ScientificBP1760-5
T4 Polinucleotide chinasiNEBM0201
PBSLife Technologies10010-23
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5
clonNATJena BioscienceAB-102L
XbaINEBR0145S
NotI-HFNEBR3189S
CutSmart BufferNEBB7204S
GlucosioFisher ScientificD15-500
Bacto-PeptoneBD Biosciences211677
Estratto di lievitoBD Biosciences210929
AgarosioBD Biosciences214010
100% etanoloDecon Laboratories04-355-222
G418Life Technologies11811-031
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
Acetato di litio diidratoSigma-AldrichL-6883
Sperma di salmone DNASigma-Aldrich93283
PEG 3350Sigma-AldrichP-3640
Plasmidi pMN8 e pMN10; ceppo di lievito yMN15Noyes o Botstein labs
Luria BrodoATTREZZATURA
BD BiosciencesVari modelli
MATLAB o FlowJoMATLAB o FlowJoSoftware per l'analisi . File FCS da esperimenti di citometria a flusso
ROpen SourcePer l'analisi dei dati sul tasso di crescita dal lettore di piastre.
Falcon TubesBD Biosciences352052
1,7 ml Eppendorf  ProvetteGeneMateC3262-1
250 ml Shake FlasksCorning4446-250
96 pozzetti, piastre a fondo piattoCostar3635
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)BioTekH1MG
Breathe-Easy MembraneSigma-AldrichZ380059-1PAK
Thermocyclervarie aziendeVari modelli
SC-Ura polvereMP Biomedicals 114410622
5-FOAZymo ResearchF9001-1
Sigma-Aldrich L3397: Ciclometro a flusso LSRII 

Riferimenti

  1. McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic acids res. 41, e57(2013).
  2. McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).
  3. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131, 129-134 (1993).
  4. Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).
  5. McIsaac, R. S., et al. Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (76), e50382(2013).
  6. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).
  7. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).
  8. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  9. Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).
  10. Hickman, M. J., et al. Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast. Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).
  11. Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron. Mol. Syst. Biol. 5, 267(2009).
  12. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat. methods. 6, 917-922 (2009).
  13. Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
  14. Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. grofit: Fitting Biological Growth Curves with R. J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).
  15. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).
  16. Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150, 647-658 (2012).
  17. Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).
  18. McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold. Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).
  19. Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast. Science. 297, 395-400 (2002).
  20. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol. cell. 21, 319-330 (2006).
  21. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).
  22. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).
  23. Losi, A., Gartner, W. Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors. Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).
  24. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  25. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  26. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).

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