Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.
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Articolo metodologico
Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR
In questo articolo
Sommario
Abstract
MicroRNA (miRNA) costituiscono uno strato potente di regolazione genica guidando RISC a bersaglio siti posizionati su mRNA e, di conseguenza, modulando la loro repressione traduzionale. Cambiamenti nell'espressione miRNA hanno dimostrato di essere coinvolti nello sviluppo di tutte le principali malattie complesse. Inoltre, recenti scoperte hanno mostrato che i miRNAs possono essere secrete nell'ambiente extracellulare ed entrano nel flusso sanguigno e altri fluidi corporei dove possono circolare con elevata stabilità. La funzione di tale microRNA circolanti rimane in gran parte sfuggente, ma approcci sistematici ad alto rendimento, come miRNA array profiling, hanno portato all'identificazione di firme miRNA in diverse condizioni patologiche, tra cui le malattie neurodegenerative e alcuni tipi di tumori. In questo contesto, l'identificazione di miRNA profilo di espressione nel fluido cerebrospinale, come riportato nel nostro studio recente, rende miRNA candidati interessanti per analisi biomarker. _content "> Ci sono diversi strumenti disponibili per il profiling microRNA, come microarrays, quantitativa real-time PCR (qPCR), e sequenziamento profondo. Qui, descriviamo un metodo sensibile al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale dal quantitativa real-time PCR. noi utilizzato i pannelli umani Exiqon microRNA pronti per l'uso PCR I e II V2.R, che consente il rilevamento di 742 unici microRNA umani. Abbiamo eseguito gli array in un parchetto in triplicato e abbiamo elaborato e analizzato i dati utilizzando il software GenEx Professional 5.
Usando questo protocollo, abbiamo profilato successo microRNA in vari tipi di linee cellulari e cellule primarie, CSF, plasma e tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina.
Introduzione
MicroRNAs appartengono alla famiglia di piccole dimensioni (21-23 nt in lunghezza) RNA non codificanti che regolano l'espressione genica post-trascrizionale. microRNA possono essere secreti nello spazio extracellulare dove sembrano essere relativamente stabile. Mentre determinare cambiamenti nell'espressione miRNA può essere un passo importante verso l'identificazione di biomarcatori, eseguire profili miRNA e gestire una grande quantità di dati può essere intimidatorio.
Qui, descriviamo un protocollo per determinare cambiamenti nell'espressione miRNA nel liquido cerebrospinale (applicabile ad altri fluidi corporei) da un t....
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Protocollo
Il protocollo che segue descrive la procedura standard per isolare RNA da CSF e di profilo microRNA utilizzando piastre PCR pronti. Si noti che l'estrazione fase organica è facoltativo, e che un RNA carrier viene aggiunta al campione durante l'estrazione garantire massimo recupero di RNA. Di conseguenza, non vi è alcuna necessità di quantificare l'RNA.
Nel complesso, una media di 6-8 piastre può essere eseguito in un giorno se il cDNA viene sintetizzato il giorno prima (circa 2 ore). L'analisi dei dati viene eseguita quando tutti i campioni sono stati profilato e caricato nel software. A seconda del numero di campioni / gr....
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Risultati
I risultati di questo studio sono stati pubblicati in precedenza 1. Figura 1 mostra i risultati dell'analisi dei microRNA riferimento candidati usando l'applicazione di geNorm. Di conseguenza, due microRNA, miR-622 e miR-1266, sono stati identificati i geni di riferimento e sono stati usati per normalizzare i valori di miRNA.
Per lo studio QCS avevamo tre gruppi di campioni: da HIV (n = 10), HIVE (n = 4), e l'HIV +, senza encefalite (.......
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Discussione
MicroRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione genica inibendo la traduzione e / o la promozione di degradazione dell'mRNA 2. Grazie alla loro elevata stabilità in condizioni cell-free, microRNA sono stati rilevati in molti fluidi corporei. Inoltre, il profilo di espressione dei microRNA distinta è stata correlata con la fase e / o la progressione in una varietà di tumori umani 3-9.
Ci sono diversi strumenti a disposizione al profilo microR.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto descritto è stato supportato da Award numero R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) del National Institute of Mental Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiali dell'Istituto Nazionale di Salute Mentale o il National Institute of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
Tabella 3. Elenco delle apparecchiature. | |||
| Finnpipette Novus Multichannel Pipetter | Thermo Scientific | HH05279 | |
| Finntip Pipette Tips | Thermo Scientific | 9400613 | |
| Thermal Cycler C1000 | Biorad | ||
| 0,2 ml a basso profilo, Provette per PCR trasparenti | Biorad | TLS0801 | |
| Flat Cap Strips | Biorad | TLS0803 | |
LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | ||
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04 729 757 001 | |
| Centrifuga refrigerata 5804R | Eppendorf | ||
| Rotore a secchio oscillante, 4 posti | Eppendorf | A-4-44 | |
| Mini centrifuga da banco | Fisher | 05-090-100 | |
| Vortice da banco | Fisher | ||
| 1,5 ml Provette per microcentrifuga, sterilizzate | Fisher | 02-681-5 | |
| Serbatoio reagenti Matrix, 25 ml | Thermo Scientific | 8093 | |
| Thermomixer Confort | Eppendorf | ||
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15 | Sigma | ||
| Vortice da banco | Velp Scientifica | F202A0173 | |
Tabella 4. Elenco dei reagenti. | |||
| Kit universale di sintesi del c-DNA, 16-32 rxns | Exiqon | 203300 | |
| SYBR Miscela master verde, Universal RT, 25 ml | Exiqon | 203400 | |
| Acqua distillata ultrapura Dnase, Senza RNA | Invitrogen | 10977-015 | |
| MicroRNA Pronto all'uso PCR Pannelli umani (I+II) V2.R | Exiqon | 203608 < | |
| p>mirKit di isolamento miRNA Vana, 40 isolamenti | Ambion | AM1556 | |
| MS2 RNA carrier | Roche Applied Science | 10165948001 | |
2-mercaptoetanolo 98% | Sigma Aldrich | M3148-25ml | |
| Etanolo 100% | Carlo Erba | 64-17-5 | |
| Acqua priva di nucleasi | Qiagen | 1039480 | |
RNAsi Zap | Ambion | AM9780 |
Riferimenti
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (20....
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Ristampe e permessi
