Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale che causa una grave polmonite acquisita in comunità e responsabile per oltre 2 milioni di decessi in tutto il mondo. L'impatto dei fattori batterici implicati in palestra o virulenza può essere monitorato in tempo reale in un mouse polmonite o batteriemia modello acuta con batteri bioluminescenti.
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Articolo metodologico
A seguito in tempo reale l'impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
La polmonite è uno dei principali problemi sanitari in via di sviluppo e paesi industrializzati ed è associata ad una considerevole morbilità e mortalità. Nonostante i progressi nella conoscenza di questa malattia, la disponibilità di unità di terapia intensiva (ICU), e l'uso di agenti antimicrobici potenti e vaccini efficaci, i tassi di mortalità restano elevati 1. Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale della polmonite acquisita in comunità (CAP) e una delle cause più comuni di batteriemia nell'uomo. Questo patogeno è dotato di un armamentario di adesine-superficie a vista e fattori di virulenza che contribuiscono alla polmonite e malattia pneumococcica invasiva (IPD). La valutazione del ruolo in vivo di fattori di forma fisica o di virulenza batterica è della massima importanza per svelare S. meccanismi di patogenicità pneumoniae. Modelli murini di polmonite, batteriemia e meningite vengono utilizzati per determinare l'impatto dei fattori pneumococco a difrenti fasi dell'infezione. Qui si descrive un protocollo per il monitoraggio in tempo reale diffusione pneumococcica nei topi dopo intranasale o infezioni intraperitoneale con batteri bioluminescenti. I risultati mostrano la moltiplicazione e la diffusione di pneumococchi nel tratto respiratorio inferiore e sangue, che può essere visualizzata e valutata utilizzando un sistema di imaging e il software di analisi di accompagnamento.
Introduzione
Infezioni del tratto respiratorio causate da virus o batteri rimangono uno dei problemi acquisite in comunità o cliniche più comuni in tutto il mondo provocando circa un terzo di tutte le morti in tutto il mondo. Le specie batteriche chiave sono Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. Tuttavia, queste specie batteriche sono normalmente costituenti comuni delle naturali flora del tratto respiratorio. Così carrozza batterica è anche di certo rischio di malattia invasiva e seconda dello stato immunitario o predisposizioni degli individui. La colonizzazione asintomatica è attivato per infezioni invasive. Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale della polmonite acquisita in comunità (CAP) e una delle più comuni cause di batteriemia negli esseri umani. Negli individui sani S. pneumoniae (pneumococco) sono spesso colonizzatori asintomatici e innocuo del tratto respiratorio superiore, dove si trovano a confrontarsi con i batteri non patogenidella flora residente, ma anche con agenti patogeni come Haemophilus spp. o Staphylococcus aureus e la prima linea di difesa del sistema immunitario umano. Tariffe di spedizione sono più alti nei bambini (37%) e persino più alto in centri diurni affollati (58%), 3-5. La popolazione più giovane e gli anziani, ricevendo il pneumococco via di trasmissione per aerosol da vettori e secrezioni naso-faringei 6, appartengono ai gruppi ad alto rischio e la vaccinazione utilizzando uno dei vaccini pneumococcico coniugato (PCV10 o PCV13 nei bambini e 23-valente polisaccaridico PPSV23 negli adulti) è raccomandato negli Stati Uniti (US) e molti paesi europei 4. Il PPSV23 copre sierotipi responsabili di ~ 90% delle malattie pneumococciche batteriemia negli Stati Uniti e in Europa, prevenzione delle malattie pneumococciche così efficiente invasive (IPD) negli adulti, mentre i PCVs coprono i sierotipi più frequenti nei bambini. Di conseguenza, IPD a causa di tipi di vaccino (VT) sono ridusierotipi non vaccinali CED ma che mostrano un alto potenziale di virulenza e di resistenza agli antibiotici sono emerse 4,7-12. Il rinofaringe come il serbatoio è il punto di partenza per pneumococchi a diffondersi i seni o le orecchie di mezza avvio infezioni locali nocivi. Più importante, pneumococchi diffondere direttamente attraverso le vie respiratorie di bronchi e del polmone con conseguente pericolo di vita CAP 4,13. Infezioni polmonari sono spesso accompagnate con il tessuto e distruzione barriera, permettendo così al patogeno di diffondersi nel sangue e causando IPD. L'incidenza di PAC e IPD sono più elevati nei soggetti immunocompromessi o agli estremi di 4,13 anni. Le circostanze responsabili per la conversione da un commensale con un patogeno con elevata virulenza sono ancora in discussione. Tuttavia, oltre a cambiamenti nella suscettibilità dell'ospite e adattamento evolutivo accompagnato con maggiore virulenza e l'aumento delle resistenze agli antibiotici sono stati suggeriti per avere un impatto cruciale sul pneinfezioni umococcal 14-16.
L'agente patogeno è dotato di una molteplicità di adesine che mediano contatto intimo alle cellule della mucosa epiteliali. Dopo aver superato il muco delle vie respiratorie, l'adesione pneumococcica alle cellule ospiti è facilitato tramite interazioni dirette di adesine-superficie esposta con recettori cellulari e sfruttando componenti della matrice extracellulare o proteine del siero come colmare le molecole 4,17,18. Agenti patogeni come versatili pneumococchi sono anche dotati di fattori coinvolti in evasione dei meccanismi di difesa dell'ospite immunitario. Inoltre, essi hanno la capacità di adattarsi a diversi ambienti host quali il polmone, del sangue e del liquido cerebrospinale (CSF), rispettivamente, 5,17,19,20.
L'impatto dei fattori batterici sulla patogenesi e di accoglienza infiammatoria risposte è studiato in modelli animali sperimentali di polmonite, batteriemia o meningite 21-25. Pur essendo un agente patogeno umano, questi modelli sono noill-istituito per decifrare tropismo tissutale pneumococco, meccanismi di virulenza, o protectivity dei candidati vaccino pneumococcico. Il background genetico dei ceppi inbred topo determina la suscettibilità di pneumococchi. Topi BALB / c intranasale infettate con pneumococchi sono risultati essere resistenti, mentre CBA / Ca e SJL topi erano più suscettibili contro le infezioni pneumococciche 22. Ciò implica che, simili agli esseri umani, il background genetico e dei meccanismi di difesa dell'ospite determinano il risultato dell'infezione. Pertanto, sono necessari ulteriori sforzi per svelare la resistenza loci nel genoma dei topi meno suscettibili alle infezioni da pneumococco. I risultati hanno portato a cambiamenti in vivo protocolli di virulenza in. Invece dei consanguinei topi BALB / c, spesso utilizzate in passato, i altamente sensibili CD-1/MF1 ceppi outbred topi sono oggi spesso utilizzati per studiare l'effetto di virulenza pneumococcica o idoneità perdita-di-funzione di fattori 26-28. Inoltre, la disponibilitàdi pneumococchi bioluminescenti e tecniche di imaging ottico permette la bioluminescenza bioimmagini in tempo reale delle infezioni. In pneumococchi la cassetta genica luxABCDE ottimizzato (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) è stata inserita in un sito di integrazione singola del cromosoma da trasposone mutagenesi. Pneumococchi bioluminescenti sono stati impiegati per valutare l'attenuazione dei mutanti di pneumococco con deficit di virulenza o di idoneità fattori e la loro traslocazione da un sito anatomico all'altro 26,28-31.
Qui forniamo un protocollo per la bioimmagini di infezioni pneumococciche in una polmonite o modello murino di sepsi. Amplificazione e diffusione di pneumococchi bioluminescente in topi infettati per via intraperitoneale, intranasale o possono essere facilmente monitorati nel tempo utilizzando un sistema di imaging ottico e lo stesso animale a tempi diversi.
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Protocollo
Gli esperimenti di infezione animale qui descritte devono essere eseguite in stretta conformità con la (ad esempio diritto europeo della Sanità della Federazione di animali da laboratorio Science Associations (FELASA)) locale e internazionale, linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati. Gli esperimenti devono essere approvati dal consiglio etico locale e Istituzionale Comitato Animal Care. Tutti gli esperimenti con S. pneumoniae in laboratorio o le infezioni animali sono condotti in una classe II biosicurezza Cabinet.
1. Preparazione della infettiva stock di Bioluminescent Pneumocococi
- Preparare culture magazzino pneumococco in Todd-Hewitt brodo supplementato con 1% (w / v) di estratto di lievito e una concentrazione finale di glicerolo al 20% per la manutenzione a 80 ° C.
- Piatto una piccola quantità di cultura magazzino pneumococcica surgelati su una piastra di agar sangue ed incubare i batteri per 10 ore a 37 ° C in 5% di CO 2. Tegli piastra di agar sangue contiene antibiotici appropriati come kanamicina (150 mcg / ml) per l'inserimento della cassetta trasposone luxABCDE gene nel genoma.
- Sub-coltivare una nuova colonia su una nuova piastra di agar sangue per un massimo di 10 ore.
- Inoculare THY mezzo supplementato con 10% (v / v) inattivato con il calore (30 min a 56 ° C) di siero bovino fetale (FBS) con pneumococchi e iniziare la coltura ad una OD 600 di 0.05-0.07.
- Incubare pneumococchi senza agitazione a 37 ° C e 5% di CO 2 fino alla cultura raggiunge un OD 600 di 0,35-0,40. La crescita avrà tra 3-4 ore.
- Harvest pneumococchi per centrifugazione a 3.750 xg per 10 min e risospendere pneumococchi bioluminescente in tampone fosfato pH 7,4 (PBS) supplementato con 0,5% FBS.
- Regolare l'inoculo alla concentrazione desiderata in PBS/10% FBS. La dose infezione dipende dal ceppo pneumococcica utilizzato e il background genetico del microfonoe. Per infettare outbred CD-1 topi intranasale con S. pneumoniae D39 lux la dose di infezione deve essere regolato a 1 x 10 7 CFU in una sospensione di 20 microlitri integrate con 90 unità ialuronidasi. Non scuotere o vortice pneumococchi, dal momento che questo si innescherà autolisi.
- Verificare la concentrazione di inoculo mediante placcatura 10 diluizioni seriali piega su agar sangue e la conta delle colonie dopo la crescita notte a 37 ° C in 5% di CO 2.
- Verifica bioluminescenza dell'inoculo pneumococcico misurando la bioluminescenza utilizzando un sistema di imaging ottico.
2. Intranasale e infezione intraperitoneale di topi con Bioluminescent pneumococchi
- Utilizzare topi femmina outbred in età di 7-10 settimane per la polmonite acuta e il modello di sepsi. Il peso di questi topi dovrebbe essere tra 20-30 g.
- Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Preparare una miscela di 1,0 mgketamina e 0,1 mg xilazina in 100 microlitri sterile allo 0,9% (w / v) di cloruro di sodio per topi con un peso corporeo di 20 g. Questo è coerente con una dose di 50 mg / kg di peso corporeo per chetamina e 5 mg / kg di peso corporeo per xilazina. Per essere precisi, pesare i topi prima che l'iniezione di anestetici.
- Iniettare la miscela nella cavità intraperitoneale e posizionare gli animali nella gabbia fino a quando i anestetici agiscono e gli animali sono narcotizzata. La respirazione di topi sarà molto lento e regolare. I topi devono essere completamente narcotizzato, in modo che l'inoculazione intranasale e l'inalazione della sospensione batterica non comporteranno starnuti e, quindi, la perdita di inoculo. Questo può essere valutata pizzicando il mouse alla fine della loro coda, un mouse completamente narcotizzata mancherà di risposta.
- Prendere delicatamente un topo narcotizzato e tenere premuto il mouse tra le dita e il pollice con il naso in posizione verticale (Figura 1).
- Utilizzare una pipetta con lunghe punte strette (Gel LoaderTips) e rilasciare pneumococchi bioluminescente in più piccole gocce sulle narici (10 ml / narice) del mouse 26-29. Il mouse involontariamente inalare i batteri. Tenete il mouse 1-2 minuti in posizione verticale e osservare se il mouse starnutisce o mantiene l'inoculo.
- Infect 7-10 settimane di età topi CD-1 intranasale con una dose infezione di 1 x 10 7 o 7,5 x 10 7 pneumococchi del ceppo D39 e TIGR4, rispettivamente, per controllare l'infezione in tempo reale. Il limite di rivelazione del sistema senza alcun assorbimento da parte del tessuto ospite è di circa 1 x 10 6 batteri bioluminescenti.
- Infettare topi per via intraperitoneale (IP) per valutare e bioimmagini virulenza di pneumococchi in un modello di infezione del mouse sepsi. Usare 5 x 10 3 CFU in 100 ml di ceppo D39 e 1 x 10 4 di tensione TIGR4. I topi non sono anestetizzati utilizzando la via IP.
- Seminare topi di controllo con PBS.
Figura 1. Infezione intranasale di topi CD-1 con S. pneumoniae. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
3. Visualizzazione pneumococcico Diffusione in Lung and Blood uso del sistema di imaging
Immagine diffusione di pneumococchi dopo l'infezione intranasale di sesso femminile outbred topi CD1 in tempo reale utilizzando un sistema di imaging in vivo in.
- Accendere il sistema di imaging e avviare il software di analisi di immagine situata sul computer preconfigurated.
- Il sistema di imaging inizializza automaticamente e la camera CCD è termoelettricamente raffreddata a 90 ° C prima di essere attivi.
- Le impostazioni e binning dipendono dal numero di topi misuratasimultaneamente e sulla forza del segnale bioluminescente. Il campo di vista (FOV) per monitorare la bioluminescenza degli animali è variabile e l'ingrandimento varia tra un FOV di 22,5 cm a misurare cinque topi, e un FOV di 3,9 cm a misurare un singolo mouse o parti dell'animale come il torace o la testa.
- Utilizzare regolarmente un tempo di esposizione di 1 min, un medio grado di binning, ed un FOV di 22,5 centimetri (serie D). In primo luogo, selezionare la modalità di imaging luminescenti e quindi impostare i parametri di imaging.
- L'emissione del segnale può dipendere dal ceppo batterico e ceppo di topi utilizzato, e il pigmento del mouse. Radere il petto di topi quando si utilizza ad esempio topi C57BL / 6, che può essere vantaggioso quando l'imaging lo sviluppo di polmonite in questi topi.
- Immagine topi infettati a intervalli di tempo prescelti. Misurare la bioluminescenza di topi nel modello polmonite acuta a intervalli di tempo di massimo 8-12 ore. Controllare anche il benessere dei topi infetti observing il loro aspetto, il comportamento e la determinazione della perdita di peso.
- Anestetizzare topi nella camera narcotico del sistema anestesia dell'apparecchiatura di imaging prima delle misurazioni nella camera. Inizia inalazione di una miscela di isoflurano e ossigeno e attendere i topi respirare lentamente e regolarmente.
- Posizionare animali anestetizzati nella camera di imaging del sistema e tenere i topi in posizione supina. La telecamera CCD sulla parte superiore della camera di immagine sarà quindi il tratto respiratorio murino.
- Posizionare gli animali con il loro naso in per tubi per consentire l'inalazione di anestetici.
- Isoflurano entrata nella camera di imaging mediante un tubo del gas è permesso di mantenere l'anestesia.
- Per attivare la fotocamera CCD sulla parte superiore della camera e per iniziare imaging ottico bioluminescente, premere "Acquisizione" nel software di imaging. Subito una fotografia dei topi nella camera chiusa appare sullo schermo. Dopo un minuto di Misurazione una sovrapposizione dei dati bioluminescenza e la foto è mostrato.
- Interrompere l'anestesia dopo la sovrapposizione di immagini appare nella finestra del software e mettere i topi nelle loro gabbie.
- I topi sono monitorati per il recupero.
Figura 2. Anestesia e monitoraggio dei topi infettati con pneumococchi bioluminescenti usando l'anestesia IVIS e il sistema IVIS Spectrum, rispettivamente. A) Il sistema Spectrum IVIS imaging. B) Il sistema di anestesia IVIS con la camera di incubazione. C) I topi anestetizzati nella camera di incubazione . D) Mouse si trova all'interno della camera di IVIS Spectrum Imaging con il loro naso inalare l'anestetico._blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
4. Quantificazione e valutazione della bioluminescenza di topi infettati con Bioluminescent S. pneumoniae
- Determinare le intensità bioluminescenza dei topi o di una regione selezionata dei topi quantificando l'emissione di fotoni totale (fotoni / sec) utilizzando il software di analisi di immagine.
- Utilizzare i valori della emissione di fotoni che sono forniti in un foglio dati Excel per preparare un grafico. Poiché la variazione di dati è spesso elevato nei topi raggruppati, generare un grafico casella basette per visualizzare le differenze di topi infettati con i diversi ceppi di pneumococco.
- Fornire i fotoni per topi o in alternativa i risultati come la media di radianza (fotoni / sec / cm 2 / sr) di un'area selezionata.
- I dati di misura di ROI (regione di interesse) in modalità di fotoni possono essere quantitativamente confronto tra i diversi sistemi di imaging in vivo con diversi venutoimpostazioni ra, in quanto le misure in unità di radianza tengono automaticamente conto delle impostazioni della fotocamera (ad esempio il tempo di integrazione, binning, f / stop, e il campo di vista).
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Risultati
L'acquisizione e l'assorbimento della metionina è di importanza centrale per pneumococchi per mantenere la forma fisica nella loro nicchia ospitante 32,33. La metionina ABC trasportatore lipoproteina è codificato in D39 dal DOCUP 0151 _ gene (TIGR4: sp_0149) e nominato MetQ 32. Pneumococchi ulteriormente produrre enzimi della biosintesi della metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete e MetF). La mancanza di metionina in un mezzo chimicamente defini...
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Discussione
Tutti gli esperimenti condotti su animali devono essere approvati dalle autorità locali e di etica commissioni. In esperimenti di infezione in vivo la carica batterica nelle varie nicchie che ospitano animali infetti deve essere determinato in vari momenti dopo l'infezione. In queste condizioni sperimentali, gli animali devono essere sacrificati prima che l'isolamento dei batteri dal sangue, rinofaringe, il lavaggio bronchoalvelar o organi come i polmoni, milza e cervello. Per calcolare il numero ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca in laboratorio è stata sostenuta da sovvenzioni da parte del Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) e il Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) Genomica Infezione Medical (FKZ 0315828A) a SH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Todd Hewitt brodo | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | X936.1 | |
| Estratto di lievito | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | 2363.2 | |
| Piastre di agar sanguigno | Oxoid, Wesel, Germania | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | T832.2 | |
| Eritromicina | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germania | E6376 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germania | A11-151 | |
| Topi CD-1, femmina | Charles River, Sulzfeld, Germania | CD1SIFE06W08W | topi CD-1 femmine, da sei a otto settimane di età |
| Ketamin 500 mg, soluzione iniettabile Curamed | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germania | . | |
| Rompun 2%, soluzione iniettabile | Bayer Animal Health, Monheim, Germania | ||
| BD Plastipak Siringhe da 1 ml | Becton Dickinson, Heidelberg, Germania | 300015 | siringhe Luer-Lok sterili con ago |
| Punte per caricatore di gel | PeqLab | 81-13790 | Mµ ltiFlex Tips |
| Ialuronidasi | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Ialuronidasi Tipo IV-S da test bovino |
| Ossigeno | Aria Liquida, Dü sseldorf, Germania | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurano | Baxter, Unterschleiß heim, Germania | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germania | ||
| Oligonucleotidi | Eurofins MWG, Ebersberg, Germania | ||
| Kit Qiaprep Spin Midiprep | Qiagen, Hilden, Germania | 27104 | |
| Kit di purificazione del DNA per PCR | Qiagen, Hilden, Germania | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germania | ||
| Pinza per sistema di anestesia a gas XGI-8 | Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germania | ||
| Sistema di imaging a spettro IVIS | Calibro Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germania | ||
| Biofotometro | Eppendorf AG, Amburgo, Germania |
Riferimenti
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