La parete cellulare batterica è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da peptidi. La cromatografia liquida ad alte prestazioni fornisce alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan. Presentiamo una procedura per l'isolamento delle pareti cellulari (sacculi) e la loro successiva preparazione per l'analisi tramite UPLC.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
La parete cellulare batterica è fondamentale per la determinazione della forma cellulare durante la crescita e la divisione e mantiene l'integrità meccanica delle cellule di fronte alle pressioni del turgore diverse atmosfere di grandezza. Attraverso le diverse forme e dimensioni del regno batterico, la parete cellulare è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da brevi peptidi. L'importanza centrale del peptidoglicano per la fisiologia batterica è alla base del suo uso come bersaglio antibiotico e ha motivato studi genetici, strutturali e biologici cellulari su come viene assemblato solidamente durante la crescita e la divisione. Tuttavia, sono ancora necessarie indagini approfondite per caratterizzare pienamente le principali attività enzimatiche nella sintesi del peptidoglycan e nella composizione chimica delle pareti cellulari batteriche. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un potente metodo analitico per quantificare le differenze nella composizione chimica delle pareti dei batteri coltivati in una varietà di condizioni ambientali e genetiche, ma la sua produttività è spesso limitata. Qui, presentiamo una procedura semplice per l'isolamento e la preparazione delle pareti cellulari batteriche per analisi biologiche del peptidoglycan tramite HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), un'estensione di HPLC che utilizza pompe per fornire pressioni ultra-elevate fino a 15.000 psi, rispetto ai 6.000 psi per HPLC. In combinazione con la preparazione delle pareti cellulari batteriche qui presentate, gli iniettori di campioni a basso volume, i rivelatori con alti tassi di campionamento, volumi di campioni più piccoli e tempi di esecuzione più brevi di UPLC consentiranno un'alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan e della biologia delle cellule batteriche fondamentali nella maggior parte dei laboratori biologici con accesso a un ultracentrifugo e UPLC.
Introduzione
L'obiettivo del metodo descritto nel presente documento è quello di isolare le pareti cellulari batteriche intatte (sacculi) e di digerire il peptidoglycan (PG) in modo tale che la cromatografia liquida ultra-performance (UPLC) possa essere utilizzata per fornire informazioni come l'identità dei componenti muropeptidi e le loro concentrazioni, la lunghezza media dei filamenti di glicano e la frazione di materiale coinvolto nei collegamenti incrociati tra i trefoli. Per una discussione dettagliata della biochimica PG e delle specie di muropeptidi, ci sono diverse eccellenti recensioni che descrivono la struttura PG e il suo ruolo in infezione, resistenza, morfogenesi e....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Coltivare colture batteriche in 2,5 ml di media durante la notte
Diluire le colture 1:100 in 250 ml di mezzi freschi e crescere fino a600 OD di 0,7-0,8. Preparare una soluzione di dodecil solfato di sodio al 6% (SDS) in acqua.
ATTENZIONE: la polvere SDS è pericolosa - evitare di inalare polvere di SDS; indossare una maschera sul naso e sulla bocca.
2. Giorno 1 - Le colture batteriche di lysing vengono eseguite nel corso di un giorno e durante la notte
- Mentre le colture diluite crescono, impostare un bagno d'acqua bollente su una piastra calda in un becher da 1 L. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Utilizzando la procedura descritta nella figura 1, il campione finale deve essere costituito da almeno 200 μl di soluzione chiara che è stata filtrata direttamente in un flaconcino UPLC (passaggio 4.4). La separazione UPLC dei vari muropeptidi in un campione batterico si basa sulla loro relativa solubilità tra la fase mobile liquida e la fase stazionaria della colonna. Le colonne C18 in fase inversa forniscono una matrice fortemente idrofobica per separare le specie di muropeptidi in base all'idrofobicit.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Un passaggio critico di questa procedura è il passaggio 3.1 del secondo giorno di preparazione del campione. Se l'SDS è precipitato durante la notte o se i campioni sono stati conservati in SDS al 4% per diverse settimane a temperatura ambiente, i campioni devono essere riboiled per almeno 1 ora per riassolvere l'SDS. Una causa comune per la precipitazione dell'SDS è l'uso di mezzi con sali di potassio, quindi il potassio dovrebbe essere evitato nei mezzi se possibile. Come accennato nella sezione Risultati rappresentati.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
I costi di produzione per questo articolo sono stati sponsorizzati da Waters Corporation.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal New Innovator Award DP2OD006466 (a K.C.H.). Gli autori ringraziano Russell Monds per una dimostrazione pratica del metodo e per le discussioni scientifiche.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pronasi E | Amresco | E629 | |
| Mutanolisina da Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Boroidruro di sodio (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Il boroidruro di sodio è altamente reattivo e pericoloso da maneggiare |
| Acido ortofosforico. | Sigma-Aldrich | 79607 | L'acido ortofosforico è corrosivo e pericoloso da maneggiare Acido |
| borico | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Aziduro di sodio | Sigma-Aldrich | S2002 | L'azoturo di sodio è un veleno |
| Tetraborato di sodio | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0,22 μ m filtri per siringhe | Fisher | SLGVR04NL | |
| strisce di pH (intervallo pH 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml di polipropilene Provette Falcon | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm provette di vetro | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm fiala di recupero in vetro con collo a vite | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | La polvere AM9820 | SDS è pericolosa |
| Strumentazione | |||
| Acque Acquity UPLC Sistema di classe H, tra cui: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternario Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 e micro; m colonna | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Riscaldatore / Raffreddatore |
Riferimenti
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Bio....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
