Articolo metodologico

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

DOI:

10.3791/51185

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15 gennaio 2014

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1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

In questo articolo

Sommario

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Le proteine antigelo (AFP) si legano a specifici piani di ghiaccio per prevenire o rallentare la crescita del ghiaccio. L'analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una modifica del metodo originale di incisione del ghiaccio per la determinazione dei piani di ghiaccio legati all'AFP. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente, incorporati in cristalli di ghiaccio singoli macroscopici e visualizzati sotto la luce UV.

Abstract

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Le proteine antigelo (ARP) sono espresse in una varietà di organismi duri a freddo per prevenire o rallentare la crescita interna del ghiaccio. Gli ARP si legano a piani specifici di ghiaccio attraverso le loro superfici leganti il ghiaccio. L'analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una tecnica modificata utilizzata per determinare i piani di ghiaccio a cui si legano gli ARP. La FIPA si basa sul metodo originale di incisione del ghiaccio per determinare i piani di ghiaccio legati all'AFP. Produce immagini più chiare in un tempo sperimentale ridotto. Nell'analisi FIPA, gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico o un colorante covalente, quindi lentamente incorporati in un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico, che è stato preformato in un emisfero e orientato a determinare gli assi a e c. L'emisfero di ghiaccio legato all'AFP è stato visualizzato sotto la luce UV per visualizzare i piani legati all'AFP usando filtri per bloccare la luce non specifica. L'etichettatura fluorescente degli AFP consente il monitoraggio in tempo reale dell'adsorbimento AFP nel ghiaccio. È stato riscontrato che le etichette non influenzano i piani a cui si legano gli AFP. L'analisi FIPA introduce anche la possibilità di legare più di un AFP con tag diverso sullo stesso singolo cristallo di ghiaccio per aiutare a differenziare i loro piani di legame. Queste applicazioni della FIPA stanno contribuendo a far progredire la nostra comprensione di come gli AFP si legano al ghiaccio per fermare la sua crescita e perché molti organismi produttori di AFP esprimono più isoforme AFP.

Introduzione

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La produzione di proteine antigelo (AFP) è un importante meccanismo di sopravvivenza di alcuni organismi che vivono in ambienti carichi di ghiaccio. Fino a poco tempo fa, si pensava che l'unica funzione degli AFP fosse quella di prevenire o rallentare la crescita di cristalli di ghiaccio interni che avrebbero bloccato la circolazione, causato danni ai tessuti e stress osmotico. Gli organismi che non possono tollerare alcun grado di congelamento, come i pesci, esprimono ARP per inibire completamente la crescita dei cristalli dighiaccio 1. Altri, come l'erba, sono tolleranti al congelamento ed afps espliciti per inibire la ricristallizzazione del ghiaccio che....

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Protocollo

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1. Cristalli di ghiaccio singoli in crescita

  1. Prendi una padella metallica pulita (15 cm di diametro, alta 4,5 cm) che si adatta e può galleggiare su un bagno di raffreddamento del glicole etilenico.
  2. Preparare stampi cilindrici in cloruro di polivinile (PVC), (diametro 4,5 cm, alto 3-4 cm, spessore 4 mm), segando sezioni da un tubo.
    1. Tagliare una tacca (1 mm di larghezza, 2 mm di altezza) su un lato (Figura 1A).
    2. Preparare tutti gli stampi che possono adattarsi comodamente alla padella (Figura 1B).
      Nota: Uno studio ha dimostrato che l'alcol polivinilico (PVA) può influenzare la nucleazione del

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Risultati

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La preparazione e il montaggio del singolo cristallo di ghiaccio sono i due passaggi della procedura FIPA in cui gli errori sono più comunemente commessi. Determinare se il cristallo di ghiaccio preparato è singolo viene eseguito esaminandolo attraverso polaroid incrociate (Figura 1D),come descritto nel passaggio 2.1 della sezione del protocollo. Se per l'analisi FIPA viene utilizzato un cristallo di ghiaccio multicristallino, il risultato sarà il legame discontinuo degli ARP sull'emisfero senza un model.......

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Discussione

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Sviluppo del metodo di incisione del ghiaccio da parte di Charles Knight per la determinazione di aerei di ghiaccio legati all'AFP studi molto avanzati sul meccanismo di legame del ghiaccio da parte degli ARP. Mentre le strutture degli ARP potevano essere risolte con la cristallografia a raggi X26,27, non c'era un metodo ovvio per dedurre la superficie complementare sul ghiaccio a cui l'AFP si legava. Quando il tipo I AFP dalla passera d'inverno è stato inizialmente caratterizzato, è stato ipotizzato di legars.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

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PLD detiene la Canada Research Chair in Ingegneria proteica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research alla PLD. Questo lavoro è stato anche supportato da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (n. 23310171) e del Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Siamo grati ai dottori Chris Marshall e Mike Kuiper per il lavoro pionieristico che ha portato alla FIPA. Siamo anche grati al Dr. Sakae Tsuda per aver fornito strutture per parte di questo lavoro e al Dr. Laurie Graham per aver istituito i filtri per l'eccitazione della luce fluorescente e le emi....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NESLAB RTE Bagni Refrigeranti/CircolatoriThermo ScientificRTE7
Glicole etilenico, Premiscelato Antigelo/RefrigeranteCertificato29-3037-0Antigelo automobilistico comune
Dito freddonon disponibilenon disponibileRealizzato su misura con ottone (9 cm di lunghezza, 1,5 cm di diametro esterno)
Coppa emisfericanon disponibilenon disponibileRealizzato su misura con resina (8 cm di diametro esterno, 6 cm di diametro interno)
Sistema di illuminazione ad alta doppia uscitaLightools ResearchLT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FXUlteriori e personalizzati filtri di eccitazione possono essere acquistati da Lightools Research
CameraCanonEOS 50D
Filtri di emissioneLightools ResearchLT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVGPotrebbe essere necessario un adattatore per ghiera del filtro per montare il filtro sull'obiettivo della fotocamera

Riferimenti

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  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M.,

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Ristampe e permessi

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Antifreeze ProteinsIce Binding PlanesFluorescence based Ice Plane AffinityIce Crystal GrowthProtein LabelingIce Hemisphere FormationCold Room ImagingWavelength Specific FiltersIce Plane VisualizationProtein Solution Freezing

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