Analisi del proteoma dell'epitelio sensoriale cocleare può essere difficile a causa della sua piccola dimensione e perché le proteine di membrana sono difficili da isolare e identificare. Sia membrana e proteine solubili possono essere identificati dalla combinazione di più metodi di preparazione e le tecniche di separazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione.
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Articolo metodologico
Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proteomica è un approccio comunemente usato che può fornire intuizioni in sistemi biologici complessi. L'epitelio sensoriale cocleare contiene recettori che trasducono l'energia meccanica del suono in energia elettrochimica elaborati dal sistema nervoso centrale e periferico. Diverse tecniche di proteomica sono stati sviluppati per studiare l'orecchio interno cocleare, quali l'elettroforesi bidimensionale differenza gel (2D-DIGE), anticorpo microarray e spettrometria di massa (MS). MS è lo strumento più completo e versatile in proteomica e in concomitanza con metodi di separazione può fornire un proteoma approfondita dei campioni biologici. Metodi di separazione in combinazione con MS ha la capacità di arricchire campioni di proteine, di rilevare a basso peso molecolare e proteine idrofobiche, e identificare le proteine abbondanti bassi riducendo la gamma dinamica proteoma. Diverse strategie di digestione possono essere applicate a tutta lisato o frazionata lisato proteico che permettono di migliorare peptide e proteinacopertura della sequenza. Utilizzazione di diverse tecniche di separazione, comprese forte scambio cationico (SCX), a fase inversa (RP), e elettroforesi frazione intrappolamento liquido gel-eluito (GELFrEE) può essere applicato per ridurre la complessità del campione prima dell'analisi MS per l'identificazione delle proteine.
Introduzione
Proteomica è lo studio di sistemi biologici complessi analizzando l'espressione della proteina, la funzione, modifiche e interazioni 1. Diversi metodi sono stati utilizzati per l'analisi del proteoma dell'orecchio interno, compresi anticorpo microarray 2, gel elettroforesi bidimensionale 3-5, e DIGE 6. Tuttavia, solo un numero limitato di proteine sono state identificate e caratterizzate 2,7-10, rispetto agli oltre 10.000 geni e tag di sequenze espresse (EST) identificati nell'orecchio interno 11,12, MS è la tecnica più utilizzata completo e in proteomica per la caratterizzazione dell....
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Protocollo
Dichiarazione Etica
Esperimenti con topi di tessuto sono stati approvati dalla University of South Florida Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (protocolli 3931R, 3482R), come previsto in base alle direttive del National Institutes of Health.
1. Estrazione Protein
- Isolare cocleare epitelio sensoriale da 16 a 30 giorni di età (P30) CBA / J topi e conservare a -80 ° C.
- Il giorno dell'esperimento, lavare tessuti con 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Centrifugare per 3 minuti a 1000 xg, e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di tre lavaggi.
- Tessuto....
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Risultati
Per ottenere il proteoma più completa dell'epitelio sensoriale cocleare, dissezione dei tessuti pratica è necessario prima di estrazione di proteine e di preparazione del campione. Due tecniche di proteomica può essere utilizzato, fucile e bottom-up proteomica. Per preparare campioni per proteomica fucile, procedura digestione FASP stato utilizzato come illustrato nella Figura 1. Il metodo FASP consente concentrazione di proteine, rimozione di detergenti, e la digestione delle proteine utilizzan.......
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Discussione
I passaggi chiave per massimizzare l'identificazione delle proteine dalla epitelio sensoriale cocleare sono: 1) utilizzo di più endoproteinases per la digestione, 2) utilizzo di più tecniche di separazione, e 3) l'utilizzo di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. L'applicazione di più enzimi aumenta il numero di peptidi e migliora la copertura sequenza proteica, consentendo così di migliorare il numero di proteine identificate dal tessuto cocleare. Tripsina, la proteasi più utilizzata prev.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Kent Seeley, direttore del Centro per la Drug Discovery e l'innovazione (CDDI) Proteomica Nucleo Strutture presso University of South Florida, per l'uso di questo strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCD concessione R01 DC004295 a BHAS
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cartuccia di acetato di tris all'8% | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Formiato di ammonio | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinina | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Albumina sierica bovina | BioRad | 500-0112 | |
| C18 colonna | Nuovo Obiettivo | A25112 | 75 μ m x 10 cm |
| Saggio delle proteine DC | BioRad | 500-0116 | Protocollo del test per micropiastre |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinasi Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Kit per la digestione delle proteine | Protein Discovery | 44250 | |
| Acido formico | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Sistema di frazionamento | Scoperta delle proteine | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| Colonna MacroSpin | The Nest Group | SMM SS18V | Silice C18 |
| Microcistina | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatina | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Colonna A di polisulfoetile | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Modello 100 |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T6567 | Grado di proteomica |
Riferimenti
- Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins ....
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Ristampe e permessi
