Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l'aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l'isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino.
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Articolo metodologico
Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Attualmente non esiste un protocollo standard per l'isolamento delle cellule T DN dai tessuti non linfoidi nonostante il loro coinvolgimento sempre segnalato in varie risposte immunitarie. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è stato implicato nella regolazione delle risposte immunitarie e la tolleranza e autoimmuni di allotrapianto 1-6. Cellule DN T sono, tuttavia, rare nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e linfonodi), ma sono i principali abitanti del rene normale. Molto poco si sa circa la loro funzione fisiopatologico 7 a causa della loro scarsità in periferia. Abbiamo recentemente descritto una vasta analisi fenotipica e funzionale di questa popolazione nel rene 8 in stato stazionario e durante ischemia riperfusione. Analisi della funzione delle cellule T DN sarà notevolmente migliorata con lo sviluppo di un protocollo per il loro isolamento dal rene.
Qui, descriviamo un nuovo protocollo che consente isolation di CD8 + cellule altamente puri ab CD4 + T e le cellule T DN dal rene murino. In breve, abbiamo digerire tessuto renale con collagenasi e isolare le cellule mononucleate del rene (KMNC) dal gradiente di densità. Questo è seguito da due passaggi per arricchire cellule T ematopoietiche dal 3% al 70% dal KMNC. La prima fase consiste in una selezione positiva di cellule ematopoietiche CD45 + utilizzando un kit di isolamento. Nella seconda fase, le cellule T sono DN negativamente isolati mediante rimozione delle cellule non desiderati utilizzando CD4, CD8, e MHC di classe II anticorpi monoclonali e CD1d α-GalCer tetramero. Questa strategia porta ad una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. Colorazione della superficie con gli anticorpi suddetti seguita mediante analisi FACS è utilizzato per confermare la purezza.
Introduzione
Periferico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppio negativo cellule (DN) T sono suddivisi in vari sottogruppi che possiedono fenotipi e funzioni 1-4 distinte. Cellule DN T sono poco conosciuti, ma sempre più spesso coinvolti nelle risposte immunitarie fisiopatologiche in differenti modelli di malattia 4-6.
Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è sempre più coinvolto nella regolazione delle varie risposte immunitarie e autoimmuni e la modulazione della tolleranza allotrapianto. 4-6, 9 sono rari nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e dei linfonodi ). Tuttavia, essi sono i principali abitanti della normale rene e intestino epitelio 10-12. Molto poco si sa circa la loro funzione 7 del rene in stato stazionario e in condizioni patologiche come danno renale acuto (AKI) associata a Transpl reneant.
A causa dei ruoli intricati di diverse cellule immunitarie nel regolare le risposte immunitarie, tra cui alloresponses, la definizione del ruolo di ogni giocatore è fondamentale per comprendere alloresponses e la progettazione di nuove terapie. Dato numero significativo di cellule DN T presenti nel rene in condizioni fisiologiche e diverse malattie, le cellule T DN sono suscettibili di svolgere un ruolo critico nel regolare le risposte immunitarie e autoimmuni nei topi e nell'uomo, e alloresponses nei pazienti trapiantati. Accumulare se prova ancora sparse implica cellule DN T in entrambe le funzioni patogeni e immunosoppressori, ma è poco conosciuta perché e come mostrano una funzione dannoso o soppressiva specifico e come l'ambiente li influenza.
A causa della loro bassa abbondanza nel rene, sono necessari metodi migliorati di isolamento.
Attualmente non esiste un protocollo standard per l'isolamento di cellule T DN da tegli tessuti non linfoidi. Il nostro protocollo descrive un nuovo metodo per l'isolamento di cellule T DN dal rene; Tuttavia, il metodo può essere utilizzata anche per vari tessuti non linfoidi.
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Protocollo
1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e reagenti
- Strumenti: Preparare i reagenti in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare.
- Preparare 1 L di terreno di coltura RPMI, aggiungere 5% di siero fetale bovino, 2,1 g di bicarbonato, 10 ml glutammato 100x, 10 mg di HEPES, 1 mg di piruvato di sodio e 10 ml di 100x penicillina / streptomicina.
Nota: il terreno di coltura tissutale raccomandata, RPMI, è intercambiabile con DMEM. - Preparare soluzione al 5% di collagenasi "D" (5 ml di collagenasi "D" a 9 ml di terreno di coltura tissutale).
- Preparare la soluzione di Percoll a tre diverse concentrazioni: 100%, 80% e 40%. I seguenti concentrazioni sono calcolati per 1 campione. Mantenere le soluzioni a temperatura ambiente.
- Soluzione Percoll: aggiungere 9 ml di diluito Percoll (da soluzione stock); aggiungere 1 ml di PBS 10x.
- Soluzione Percoll: aggiungere 8 ml di Percoll 100%; aggiungere 2 ml di PBS 1x.
- Soluzione Percoll:aggiungere 4 ml di Percoll 80%; aggiungere 4 ml di PBS 1x.
- Fare 1 L di cella fluorescenza-attivato (FACS) tampone; aggiungere 5 ml di 10% di BSA (0,1% BSA), sodio azide 1 ml 10% (0,1%), 2 agente ml EDTA, portare a 1000 ml con PBS 1x.
2. Preparazione del rene Digestione
- Avendo acquisito alcuna approvazione istituzionale necessario, sacrificare e exsanguinate i topi con metodi standard e seguendo le normative vigenti e le linee guida per la cura degli animali.
- Anestetizzare il mouse con pentobarbital (0,07 mg / kg).
- Procedere al dissanguamento.
- Posizionare il mouse in posizione supina su un tavolo operatorio.
- Spruzzare la zona addominale con etanolo al 70%.
- Aggiungere 10 ml di soluzione D collagenasi al piatto di Petri.
- Rimuovere e decapsulate entrambi i reni da ogni mouse.
- Aprire la cavità abdomimal facendo un'incisione mediana attraverso la pelle addominale e del peritoneo dallo sternoil pube.
- Esporre il rene sinistro spostando l'intestino lateralmente al lato.
- Separare con cautela la capsula sinistra con le pinze.
Nota: La capsula appare come uno strato trasparente che circonda il rene e parzialmente coperta da tessuto adiposo perirenale. - Rimuovere il rene sinistro tagliando le navi peduncolo con una forbice chirurgica.
- Ripetere la stessa procedura per il rene destro.
Nota: Il rene destro è più craniale e più vicino alla linea mediana (pedicelli sono più corti).
- Posizionare il rene nel piatto di Petri.
- Tagliare il tessuto renale in piccoli pezzi (1-2 mm di dimensione) utilizzando una normale lama formatura dei metalli e disporre i pezzi nella soluzione di collagenasi per 30-45 min in incubatore a 37 ° C (Figura 1).
3. Preparazione di cellule mononucleate del rene (KMNC) dalla digestione rene
- Ottenere una sospensione di cellule di renedigestione interrompendo meccanicamente il tessuto utilizzando un filtro (70 micron) e risospendere in 25 ml di terreno di coltura tissutale e mescolare.
- Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare la sospensione cellulare.
- Risospendere il pellet in 4 ml di 40% soluzione di Percoll e delicatamente sovrapporre su 4 ml di 80% soluzione di Percoll con una pipetta di plastica trasferimento, molto lentamente e con attenzione. Questo comporta due fasi nettamente separate da uno strato traslucido. Sulla parte superiore sarà uno strato giallo corrispondente ai lipidi.
- Centrifugare a 1500 xg per 30 min a temperatura ambiente con la centrifuga in modalità off freno.
- Rimuovere con aspirazione lo strato superiore di colore giallo e denso (circa 1-2 ml).
- Raccogliere solo il leggero strato biancastro traslucido dall'interfaccia delle due fasi con una pipetta di trasferimento. Trasferire molta attenzione questa sospensione in una provetta conica da 15 ml contenente 2 ml di terreno di coltura tissutale e quindi aggiungere 13 ml di terreno per fare un volume totale di15 ml.
- Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C.
- Risospendere i campioni in 1 ml del mezzo.
- Contare il numero di KMNC utilizzando trypan blu su un emocitometro ed esprimere i risultati come numero di KMNC per ml al rene.
- Risciacquare una volta come sopra.
4. Isolamento del emopoietiche (CD45 +) Celle dal KMNC (Fase I)
- Risospendere le cellule fino a 10 7 in 90 ml di tampone di corsa.
- Aggiungere 10 ml di microsfere CD45 e incubare per 15 min a 4 ° C.
- Aggiungere 1 ml di tampone di corsa per arrestare la reazione. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in 500 ml di tampone di corsa.
- Preparare la colonna magnetico mettendo a magnete e risciacquare con 3 ml di tampone di corsa.
- Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica e raccogliere le cellule non marcati che passano attraverso la colonna.
- Lavare le cellule tre volte con 3 ml di Running buffer. Poi raccogliere l'effluente.
- Rimuovere la colonna dal separatore e pipetta 5 ml di tampone di corsa sulle colonne e scovare la frazione etichettato immediatamente. Questa frazione contiene le cellule CD45 +. Contare le cellule.
- Per calcolare il numero assoluto di linfociti T diversi sottoinsiemi in reni moltiplicare il numero totale di KMNC per la percentuale di cellule positive determinata mediante citometria di flusso (Figura 2).
5. Isolamento di DN cellule T CD45 + da Preparazione per selezione negativa (Fase II)
- Aggiungere 2,5 ml (0,5 mg / ml, 1,25 microgrammi) di ciascuno dei seguenti anticorpi biotinilati: anti-CD4 e anti-CD8, anti-recettore Fc (CD16/32), anti-MHC di classe II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetramer ogni 10 cellule ematopoietiche 7.
- Incubare le cellule per 30 minuti nella camera fredda.
- Aggiungere 1 ml microsfere anti-biotina.
- Incubare per 30 min in una camera fredda.
- Porre il tubo in tegli magnete e procedere a esaurimento.
- Contare le cellule vitali per determinare il numero totale di cellule T DN nella frazione negativa utilizzando un emocitometro.
- Controllare la purezza delle cellule DN T con citometria a flusso seguendo questa strategia di gating: primo cancello CD45 +, secondo cancello TCRαβ +. Escludi + cellule CD1d. Plot CD4 + CD8 + vs identificare cellule DN T (Figura 3).
- Moltiplicare il numero totale per la percentuale determinata in purezza.
Nota: utilizzando questo protocollo i risultati in una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T.
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Risultati
Wild type C57BL / 6 (B6) rene contiene circa 1,5-2,1 x 10 6 cellule mononucleate al rene. Circa meno del 10% sono CD45 + cellule ematopoietiche. Per la preparazione di cellule mononucleate rene (KMNC), i reni sono tagliati in piccoli pezzi, come mostrato in Figura 1 seguito da digestione con collagenasi 5%.
Questo è seguito eseguendo una centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere KMNC strato (figura 2, pannello di sinistra).
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Discussione
Vi è un crescente interesse in cellule T DN poiché sono stati implicati in diverse condizioni patologiche, come disturbi autoimmuni, il cancro, la tolleranza del trapianto e malattie primarie di rene compresa insufficienza renale acuta (AKI), glomerulonefrite 8, 13. Pertanto, non vi è necessità di comprendere meglio e caratterizzare le funzioni fisiopatologiche delle cellule T DN. Tuttavia, attualmente non vi è una mancanza di comprensione della funzione di queste cellule rispetto ai CD4 e le cellule T CD8. U...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal NIH PBS (R21 AI095484). Ringraziamo core facility tetramer NHI per CD1d tetramero.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cappa a flusso laminare | Baker Company, Inc | O attrezzature equivalenti | |
| Centrifuga | Beckman Coulter | o attrezzatura equivalente | |
| Emocitometro | Microscopia elettronica | Scienze 63514-11 | |
| Incubatore ad atmosfera controllata | Fisher Scientific | ( 37 gradi C con 5% CO2 | |
| )Citometro a flusso analitico | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenasi D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Siero fetale bovino | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0,1% sodio azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato tampone (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA tampone | Colonne Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS | Microsfere MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ Microsfere | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Microsfere di biotina | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Blu del Pacifico (catena ab, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinilato (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinilato (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC classe II (I-A b) biotinilato | BD | 553609 | |
| AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL / 6J topi | Jackson Labs | 000664 | Reni - Piastra di Petri per linfonodi |
| BD Biosciences | 356517 | ||
| 70 μ m filtro | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Stantuffo | O apparecchiature equivalenti | ||
| Provette GeneMate 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | O attrezzatura equivalente |
| GeneMate Provette 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | O attrezzatura equivalente |
| CD1d α-galcer tetramero | NHI |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
