Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l'aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l'isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino.
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Articolo metodologico
Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Attualmente non esiste un protocollo standard per l'isolamento delle cellule T DN dai tessuti non linfoidi nonostante il loro coinvolgimento sempre segnalato in varie risposte immunitarie. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è stato implicato nella regolazione delle risposte immunitarie e la tolleranza e autoimmuni di allotrapianto 1-6. Cellule DN T sono, tuttavia, rare nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e linfonodi), ma sono i principali abitanti del rene normale. Molto poco si sa circa la loro funzione fisiopatologico 7 a causa della loro scarsità in periferia. Abbiamo recentemente descritto una vasta analisi fenotipica e funzionale di questa popolazione nel rene 8 in stato stazionario e durante ischemia riperfusione. Analisi della funzione delle cellule T DN sarà notevolmente migliorata con lo sviluppo di un protocollo per il loro isolamento dal rene.
Qui, descriviamo un nuovo protocollo che consente isolation di CD8 + cellule altamente puri ab CD4 + T e le cellule T DN dal rene murino. In breve, abbiamo digerire tessuto renale con collagenasi e isolare le cellule mononucleate del rene (KMNC) dal gradiente di densità. Questo è seguito da due passaggi per arricchire cellule T ematopoietiche dal 3% al 70% dal KMNC. La prima fase consiste in una selezione positiva di cellule ematopoietiche CD45 + utilizzando un kit di isolamento. Nella seconda fase, le cellule T sono DN negativamente isolati mediante rimozione delle cellule non desiderati utilizzando CD4, CD8, e MHC di classe II anticorpi monoclonali e CD1d α-GalCer tetramero. Questa strategia porta ad una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. Colorazione della superficie con gli anticorpi suddetti seguita mediante analisi FACS è utilizzato per confermare la purezza.
Introduzione
Periferico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppio negativo cellule (DN) T sono suddivisi in vari sottogruppi che possiedono fenotipi e funzioni 1-4 distinte. Cellule DN T sono poco conosciuti, ma sempre più spesso coinvolti nelle risposte immunitarie fisiopatologiche in differenti modelli di malattia 4-6.
Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è sempre più coinvolto nella regolazione delle varie risposte immunitarie e autoimmuni e la modulazione della tolleranza allotrapianto. 4-6, 9 sono rari nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari ....
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Protocollo
1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e reagenti
- Strumenti: Preparare i reagenti in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare.
- Preparare 1 L di terreno di coltura RPMI, aggiungere 5% di siero fetale bovino, 2,1 g di bicarbonato, 10 ml glutammato 100x, 10 mg di HEPES, 1 mg di piruvato di sodio e 10 ml di 100x penicillina / streptomicina.
Nota: il terreno di coltura tissutale raccomandata, RPMI, è intercambiabile con DMEM. - Preparare soluzione al 5% di collagenasi "D" (5 ml di collagenasi "D" a 9 ml di terreno di coltura tissutale).
- Preparare la soluzione di Percoll a tre diverse concentraz....
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Risultati
Wild type C57BL / 6 (B6) rene contiene circa 1,5-2,1 x 10 6 cellule mononucleate al rene. Circa meno del 10% sono CD45 + cellule ematopoietiche. Per la preparazione di cellule mononucleate rene (KMNC), i reni sono tagliati in piccoli pezzi, come mostrato in Figura 1 seguito da digestione con collagenasi 5%.
Questo è seguito eseguendo una centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere KMNC strato (figura 2, pannello di sinistra).
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Discussione
Vi è un crescente interesse in cellule T DN poiché sono stati implicati in diverse condizioni patologiche, come disturbi autoimmuni, il cancro, la tolleranza del trapianto e malattie primarie di rene compresa insufficienza renale acuta (AKI), glomerulonefrite 8, 13. Pertanto, non vi è necessità di comprendere meglio e caratterizzare le funzioni fisiopatologiche delle cellule T DN. Tuttavia, attualmente non vi è una mancanza di comprensione della funzione di queste cellule rispetto ai CD4 e le cellule T CD8. U.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal NIH PBS (R21 AI095484). Ringraziamo core facility tetramer NHI per CD1d tetramero.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cappa a flusso laminare | Baker Company, Inc | O attrezzature equivalenti | |
| Centrifuga | Beckman Coulter | o attrezzatura equivalente | |
| Emocitometro | Microscopia elettronica | Scienze 63514-11 | |
| Incubatore ad atmosfera controllata | Fisher Scientific | ( 37 gradi C con 5% CO2 | |
| )Citometro a flusso analitico | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenasi D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Siero fetale bovino | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0,1% sodio azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato tampone (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA tampone | Colonne Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS | Microsfere MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ Microsfere | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Microsfere di biotina | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Blu del Pacifico (catena ab, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinilato (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinilato (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC classe II (I-A b) biotinilato | BD | 553609 | |
| AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL / 6J topi | Jackson Labs | 000664 | Reni - Piastra di Petri per linfonodi |
| BD Biosciences | 356517 | ||
| 70 μ m filtro | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Stantuffo | O apparecchiature equivalenti | ||
| Provette GeneMate 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | O attrezzatura equivalente |
| GeneMate Provette 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | O attrezzatura equivalente |
| CD1d α-galcer tetramero | NHI |
Riferimenti
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
