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Articolo metodologico

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

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DOI:

10.3791/51197

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21 maggio 2014

 , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535

In questo articolo

Sommario

Granuli di stress (SGS) sono granuli citoplasmatici RNA contenenti particelle in fase di stallo ribonucleoproteiche (RNP), e importante nella risposta cellulare alle varie sollecitazioni. Dinamica di SG possono essere seguite in cellule vive visualizzando la localizzazione di un componente taggato di SG in cellule primarie transfettate dopo stress.

Abstract

SGs può essere visualizzato in cellule mediante immunocolorazione delle componenti proteici specifici o polyA + mRNA. SG sono altamente dinamico e lo studio del loro assemblaggio e il destino è importante per capire la risposta cellulare allo stress. Il deficit dei fattori chiave della SG come G3BP (RasGAP SH3 dominio Binding Protein) porta a difetti dello sviluppo in topi e alterazioni del Sistema Nervoso Centrale. Per studiare la dinamica di SG in cellule di un organismo, si può cellule primarie di cultura e seguire la localizzazione di un componente etichettato transfettate di SGS. Descriviamo esperimento di time-lapse per osservare-G3BP1 contenente SG in fibroblasti embrionali di topo (MEF). Questa tecnica può anche essere usato per studiare SGS-G3BP contenente neuroni in vivo, che è cruciale come è stato recentemente dimostrato che questi SGs si formano alla insorgenza di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. Questo approccio può essere adattato a qualsiasi altro componente corpo cellulare e proteine ​​granuli, ed eseguitocon animali transgenici, permettendo lo studio vivo di granulati dinamiche per esempio in assenza di un fattore specifico di questi granuli.

Introduzione

Granuli di stress (SGS) sono non-membranosa foci citoplasmatica formata come una risposta protettiva cellulare a stress ambientali, come la temperatura elevata, stress ossidativo, ipossia, shock osmotico, irradiazione UV, deprivazione di glucosio, o infezione virale 1. Essi possono essere indotti chimicamente mediante trattamento con composti come arsenito di sodio, che innesca lo stress ossidativo. SG accumulano in fase di stallo traduzione arrestato messaggero ribonucleoproteina (mRNPs) Complessi 2, sequestrando mRNA dal macchinario traslazionale, e il loro montaggio può essere attivato dalla fosforilazione di eIF2α (fattore di iniziazione eucariotica 2 α). SG sono strutture dinamiche che scambiano i componenti con le polisomi e altri granuli come il P-corpi. Essi costituiscono un "centro di smistamento", dove mRNA sono ordinati ed elaborati sia per la traduzione, reinitiation, il degrado o l'imballaggio in stabili mRNPs non polisomi 3. L'assemblea di SGS è veloce but è un processo graduale, con iniziali numerosi piccoli aggregati che si coagulano in granuli più grandi. L'uso di inibitori chimici che interrompono o stabilizzano i microtubuli mostra che è necessaria rete di microtubuli per dinamiche SG comprendenti processi di assemblaggio, di coalescenza e smontaggio.

L'assembly dinamico di SGS è anche favorito dalla aggregazione di specifici RNA-binding proteins (RNA-BP) come TIA-1 (T-cellulare interna antigene-1) e TIAR (proteina TIA-1-correlati), che sono in grado di dimerize e promuovere polisoma smontaggio e l'instradamento di mRNA in SG 4. G3BP (RasGAP SH3 dominio di binding protein) è tale un RNA-BP che localizza a SGS quando le cellule sono stressati con arsenito o ad alta temperatura e sovraespressione di G3BP defosforilato può indurre SG gruppo 5.

G3BP è evolutivamente conservata RNA-BP che è stato inizialmente caratterizzato attraverso la sua interazione con una proteina attivazione Ras-GTPasi (RasGAP p120 6); ma questa interazione è stato recentemente rivisitato 7. La famiglia G3BP comprende due membri nei mammiferi, G3BP1 (denominato G3BP) e G3BP2 8. Entrambe le proteine ​​colocalize in SGS, quando le cellule sono sottoposte a stress 9. G3BPs comprendono un dominio NTF2 N-terminale suggerito di influenzare la loro localizzazione e oligomerizzazione, seguiti da prolina ricchi (PxxP) motivi, quindi motivi C-terminale associato con RNA vincolante: il canonico RNA-Riconoscimento Motif (RRM) con RNP1 e RNP2 motivi conservati , seguita da un ricco casella arginina-glicina (RGG). È interessante notare che l'analisi delle diverse parti della proteina creando diversi domini fuse ad EGFP dimostrato che il dominio NTF2-simili e il dominio legante l'RNA erano i più efficientemente assunto per SGS, suggerendo l'importanza delle proprietà di dimerizzazione e RNA vincolante l'assemblea di SGS. Diversi modelli hanno rivelato diverse funzioni delle proteine ​​G3BP in vitro 10-13.Interruzione del G3BP nei topi hanno dimostrato l'importanza di questa proteina in crescita dello sviluppo e sopravvivenza 14, così come un ruolo importante per G3BP nel Sistema Nervoso Centrale (SNC), caratterizzata da atassia e difetti nella memoria di lavoro spaziale 15. Carenza G3BP porta ad alterata plasticità neuronale e calcio omeostasi, stabilendo un collegamento diretto tra la formazione di SG e le malattie neurodegenerative 15. È quindi importante poter studiare la dinamica dello SGS in cellule primarie come neuroni.

Questo protocollo fornisce un modo semplice per osservare l'assemblaggio di-G3BP1 contenente SG in cellule primarie in trattamento arsenite. Può essere usato per studiare assembly SGs in condizioni diverse, ad esempio diversi tipi di stress. Può anche essere adattato ad altri granuli o altri costituenti del SGS. Infatti, questo protocollo si concentra sulla G3BP1, ma ci sono altri granuli di stress marcatori come TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (fragile X ritardo mentale Sindrome di proteine) 16, TDP-43 (DNA risposta transattivo binding protein 43) 17 o Staufen 18. In particolare, proteine ​​come TIA-1 / R sono, come G3BP, nucleazione RNA proteine ​​leganti che possono indurre assembly SGs quando overexpressed, anche se le varie SGs formate possono differire in funzione, regolazione e trascrizioni associati. Trasfezione versione fluoroforo-tag di una di queste componenti chiave o nucleatori di SG può essere eseguita per l'immagine particolare assemblaggio e la dinamica SG.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo protocollo sono in stretta aderenza con le linee guida della Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86-609/EEC). Casa dei topi in gruppo, permettendo cibo e acqua ad libitum. Mantenerle in un ambiente controllato (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% di umidità), con una 12 ore: 12 ore di luce: ciclo di buio (luce alle 07:00).

1 Culture di cellule murine primari:. Fibroblasti embrionali di topo (MEF)

  1. Autoclave pinze sottili, così come pinze curve e forbici dissezione. Conservare in un contenitore sterile. Utilizzare sterile D-PBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Preparare mezzo completo MEF: modificata mezzo Eagle Dulbecco (DMEM) / F12 supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1 mM L-glutammina, 1 mM piruvato di sodio, 1% di amminoacidi non essenziali, e 0,5 mM 2-mercaptoetanolo e caldo a 37 ° C.
  2. Euthanize un topo in stato di gravidanza (a 13,5 giorni post-coitum (DPC)) Per dislocazione cervicale. Rimuovere le corna uterine dal mouse igienizzato con il 90% EtOH. Sotto una cappa sterile e pulito, mettere le corna con gli embrioni nel 37 ° C preriscaldata D-PBS. Aprire la corna, posto gli embrioni in una plastica sterile capsula di Petri 100 mm, li ripulire dal materiale cordone ombelicale e lavarli con acqua calda D-PBS per rimuovere l'eccesso di sangue. Sotto un binocolo, rimuovere gli arti dell'embrione, gli organi interni e la parte superiore della testa contiene il cervello.
  3. In un nuovo piatto di Petri, tritare il embrioni in pezzi molto piccoli con un chirurgico sterile lama o forbici (almeno per 1 min). Nel caso di embrioni di diversi genotipi, stare attenti a mettere ogni embrione nelle singole piastre di Petri e mantenere la coda o la testa superiore per la genotipizzazione.
  4. Coprire l'embrione con 1x tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 1 mM EDTA). Incubare per 30 minuti a 1 ora a 37 ° C incubatore. Aggiungere 10 ml di completoMEF mezzo per fermare la reazione tripsina. Pipettare su e giù per rimuovere tutti gli aggregati. Lasciare riposare la sospensione cellulare in una provetta 50 ml (riempito con mezzo completo) per 10 min, e centrifugare il surnatante per 5 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in mezzo completo (6 ml per 1 embrione). Cellule nucleate vitali possono essere contati utilizzando trypan blu (Circa 5 x 10 6 cellule può aspettare da un embrione). Piatto 3 ml per 60 millimetri piatto di Petri.
  5. Cambiare il mezzo il giorno successivo e permettono alle cellule di crescere fino a quando i piatti sono confluenti. Molti tipi di cellule possono essere visti, ma solo fibroblasti sopravviverà sottocultura.
  6. Dividere le celle e permettono loro di crescere in 35 piatti mm con fondo di vetro (importante per esperimento lasso di tempo), fino al 50-70% di confluenza per la trasfezione. Test per Mycoplasma e agenti patogeni mouse.

2. Culture Adaptations nel caso di neuroni

  1. Il giorno prima la cultura, cappotto di 35 millimetri di vetro fondo piastre di Petri con poli-L-lisina (200 ml di 0,1 mg / ml) sotto una cappa sterile e pulito, e lasciare tutta la notte.
  2. La mattina successiva, sciacquare con acqua pura sterile, due volte per 5 min e una volta per 45 minuti a 1 ora. Sostituire con 2 ml di DMEM + 10% FBS medie e tenere in un incubatore a 37 ° C.
  3. Sezionare embrioni a 18,5 dpc. Sotto una cappa sterile e pulito, mettere le corna con gli embrioni in freddo sterile HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) a 100 millimetri piatto di Petri. Cuccioli neonatali possono anche essere utilizzati al posto di embrioni al fine di preservare la durata della diga e consentirgli di produrre più discendenti, soprattutto nel caso di animali transgenici che possono essere difficili da ottenere. Nei singoli piatti Petri, prendere ogni embrione o neonato e tagliare la testa con le forbici. Tenere la testa inserendo pinze curve negli occhi, tagliare la pelle e aprire con cautela il cranio molle dal retrodella testa fino agli occhi, su ciascun lato della testa. Tagliare i nervi ottici ed il tronco cerebrale, rimuovere il cervello, e metterlo in un nuovo piatto di Petri contenente HBSS. Sotto uno stereoscopio, rimuovere tutte le meningi con due pinze sottili. Separare ippocampi, la corteccia o qualsiasi altra parte del cervello in funzione della struttura di studiare.
  4. Immergere la struttura del cervello sezionato in 4,5 ml di HBSS freddo preparato in precedenza in provette da 15 ml e tenere in ghiaccio fino digestione con tripsina. Aggiungere 0,5 ml di 2,5% tripsina e incubare a 37 ° C per 15 min a 20 min. Sciacquare il 3x tripsina con HBSS, essere estremamente attenti a non scartare le parti del cervello digeriti.
  5. Risospendere in 500 microlitri (ippocampo) a 1 ml (corteccia) DMEM + 10% FBS e pipettare su e giù parecchie volte con un ml micropipetta 1 dotato di una punta di 1 ml, quindi dotato di 1 ml più 200 consigli microlitri, finché non ci sarà nessun aggregato visibile.
  6. Distribuire 100-200 ml di sospensione cellulare ad ogni botto vetro 35 millimetrim piatto contenente DMEM + 10% FBS e lasciare che i neuroni aderiscono a 37 ° C per almeno 3 ore. Sostituire con neurone preriscaldata mezzo completo (Neurobasal mezzo supplementato con 250 mM L-glutammina e NS21, preparato come descritto in Chen et al. 19) e lasciato a 37 ° C per permettere la crescita neuronale. Transfettare i neuroni a 5 a 14 giorni in vitro (div) (l'efficienza di trasfezione è più elevato dopo un paio di connessioni sinaptiche div, ma sono meglio stabilito 7-10 div).

3. Trasfezione di EGFP-G3BP1 Construct

Trasfezione delle cellule con un vettore contenente il cDNA della proteina di interesse (qualsiasi componente di SGS) fuso con un marcatore fluorescente (GFP, YFP, ecc), utilizzando 3 pg di plasmide purificato per piastra da 35 mm.

  1. Transfettare il MEF utilizzando un metodo commerciale, seguendo il protocollo del produttore (Vedi Tabella dei materiali / reagenti).
  2. Transfettare i neuroni con un calcioMetodo di fosfato adattato da Xia et al 20 brevemente.:
    1. Preparare le soluzioni: DMEM-wash: DMEM contenente 25 mM KCl; soluzione di trasfezione: DMEM-lavaggio contenente 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, rosso fenolo); e la soluzione choc: HeBS 1x, DMKY 1x, e DMSO 2% (v / v); e tenerli a 37 ° C.
    2. Rimuovere il supporto dai neuroni, filtrato, e la tiene a 37 ° C. Lavare con DMEM-wash quindi sostituire con terreno di trasfezione e mantenere a 37 ° C durante la preparazione dei calcio fosfato plasmide precipitati DNA.
    3. In una provetta da 1,5 ml, aggiungere (in questo ordine) Braun acqua (volume finale di 50 ml), 5 ml di CaCl 2 2,5 M e 3 microgrammi di plasmide DNA. Cadere questo mix su 50 ml di HeBS 2x già introdotti in un tubo tondo fondo in polipropilene. Mescolare il tubo dalla rotazione insieme con l'eliminazione. Lasciare la forma precipitato a temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Aggiungere il precipitate goccia a goccia sui neuroni e lasciare a 37 ° C durante 30 a 50 min.
    5. Sostituire con una soluzione shock per 1 minuto, quindi risciacquare con DMEM-wash e, infine, reintrodurre il mezzo precondizionato. Conservare le cellule a 37 ° C.

4. Visualizzazione G3BP contenenti SGs Montaggio e Dynamics

  1. Sostituire il medium delle cellule che contiene rosso fenolo da terreno privo di rosso fenolo.
  2. Utilizzare un microscopio confocale equipaggiato con fluorescenza per le acquisizioni. Accendere i sistemi microscopio: lampada a mercurio, computer e laser. Riscaldare la camera a 37 ° C per almeno 20 minuti prima dell'inizio delle acquisizioni.
  3. L'espressione sopra del G3BP induce la formazione spontanea di un tipo di SGS. Le cellule possono quindi essere osservati per l'assemblaggio di SGs 24 ore dopo la trasfezione, senza induzione di stress. In alternativa, lo stress può essere indotto a indurre ulteriormente l'assemblaggio della SGS. Aggiungere 0,5 mM arsenito di sodio e di stellet dell'acquisizione subito dopo l'aggiunta del composto (granuli saranno ben formate entro 1 ora).
  4. Aggiungere olio l'obiettivo ad immersione (usare 40X o 63X obiettivi) e installare la piastra di Petri rispetto all'obiettivo nel supporto microscopio 35 millimetri adattato, stabilizzato sul supporto palco. Verificare che il piatto è piatto altrimenti le acquisizioni verranno alterati. Accendere la luce di fluorescenza secondo il fluoroforo rilevante e visualizzare le cellule trasfettate. Spegnere fluorescenza volta che una cellula di interesse nel settore al fine di minimizzare il candeggio e citotossicità.
  5. Nella "acquisire scheda", selezionare i laser in funzione della lunghezza d'onda di eccitazione del fluoroforo tag (488 nm nel nostro protocollo che utilizza G3BP EGFP-tag) e seleziona la lunghezza emissione adattato per la PMT (tubo fotomoltiplicatore). Regolare la potenza del laser (di solito non più del 10%) per ridurre il rumore e sovrasaturazione nonché tossicità, e impostare il guadagno e offset di modificare il rapporto segnale-rumore.Scansione veloce (1,000 Hz), al fine di minimizzare la durata di esposizione laser (line media 2, media telaio 1). Se lo si desidera, impostare i parametri per la pila Z per poter ricostruire l'immagine in 3D (una fase Z di 1 micron di solito va bene con le cellule). Determinare l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione: intervalli più piccoli permettono di ottenere un film più coerente ma questo può indurre fotoscolorimento e tossicità (un intervallo di 20 secondi è stato usato negli esperimenti descritti). Durata di acquisizione totale può variare a seconda del tipo di stress. Molti SGS-G3BP contenente si formano molto rapidamente sotto trattamento arsenito e sono ben visibili dopo 1 ora di trattamento: in tal caso, scegliere rapidamente le cellule per filmare e avviare le acquisizioni a destra dopo lo stress, con una durata complessiva di acquisizioni di 15 - 20 min ampiamente sufficiente per osservare l'assemblaggio di diversi SGS.
  6. Salvare le immagini e ricostruire le pile e film utilizzando il software ImageJ.

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Risultati

Formazione stress granulo è importante nella risposta delle cellule allo stress, permettendo un adattamento cellulare con traduzione in stallo, finché lo stress ha autorizzato, associata alla prevenzione dell'apoptosi. Permette questo test per studiare SGS in cellule primarie, seguendo la localizzazione delle principali componenti proteiche SGS (Figura 1). G3BP, un fattore chiave di montaggio SGS, è presente piuttosto diffusamente nel citoplasma di MEF coltivate o neuroni (Figura 2A A

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Discussione

I passaggi più critici del protocollo riguardano la trasfezione e più in particolare le acquisizioni lasso di tempo, che devono essere attentamente monitorati al fine di abbassare la citotossicità.

Coltura di cellule primarie non è una parte difficile, finché le condizioni sterili sono mantenute e cautela è presa per evitare danni durante le fasi di dissezione e dissociazione cellulare. MEF può essere mantenuto congelato alle brevi passaggi. Neuron trasfezione con fosfato di calcio ha dimost...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare la piattaforma Montpellier Rio Imaging (MRI) in cui sono state effettuate le acquisizioni. Ringraziano Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget per il loro aiuto in diverse parti del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/F12Gibco21331Preriscaldamento a 37 gradi C
Piruvato di sodioGibco11360
Aminoacidi non essenzialiGibco11140
L-GlutamminaGibco25030
TripsinaGibco15096
Fondo di vetro B-35Greiner627860/627861Trattato o no (trattato: aumenta l'adesione delle cellule aderenti)
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP2636
DMEMGibco31966Preriscaldamento a 37 ° C
HeBSSigma-Aldrich51558
Gibconeurobasale21103Preriscaldare a 37 gradi; C
2-mercaptoetanoloGibco31350
PinzeBiotekDU-110-AMolto sottile, punte 0,1 mm (utili per rimuovere le meningi)
Pinze curveBiotekP-110-BUFMolto sottile, punte 0,1 mm
Forbici piccoleBiotekCM-85-BSPuò essere utile per rimuovere ippocampi
Polyplus trasfezione Reagente JetPEI Trasfezione Ozyme101-10MEF, seguire il protocollo diretto
Microscopio confocale a scansione laser invertitaLeicaSP5

Riferimenti

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