Anti-Nuclear Antibody screening utilizzando cellule Hep-2

Sommario

Immunofluorescenza indiretta (IIF) saggi sono stati tradizionalmente utilizzati per il rilevamento di anticorpi antinucleo (ANA) nel siero umano. La presenza di questi anticorpi può aiutare nella diagnosi delle malattie autoimmuni sistemiche reumatiche (SARD). Questo protocollo viene illustrato come eseguire efficacemente la tecnica IIF di rilevare con precisione questi autoanticorpi.

Abstract

L'American College of Rheumatology posizione dichiarazione sui test ANA prevede l'uso della IIF come metodo gold standard per lo screening ANA ^1. Anche se IIF è un ottimo test di screening in mani esperte, le difficoltà tecniche di lavorazione e la lettura IIF scivoli - come il lavoro di elaborazione intensiva diapositiva, lettura manuale, la necessità di esperti, tecnici qualificati e l'uso di camera oscura - rendere il metodo IFI difficile da inserire nel flusso di lavoro dei laboratori moderni, automatizzati.

Il primo e fondamentale passo verso lo screening ANA di alta qualità è l'elaborazione di diapositive attenta. Questa procedura è laborioso, e richiede una piena comprensione del processo, così come l'attenzione ai dettagli e l'esperienza.

Lettura diapositiva viene eseguita tramite microscopia a fluorescenza in stanze buie, ed è fatto da tecnici qualificati che hanno familiarità con i vari modelli, nel contesto del ciclo cellularee la morfologia di interfase e cellule in divisione. A condizione che IIF è il primo strumento di screening online per SARD, capire i passaggi per eseguire correttamente questa tecnica è fondamentale.

Recentemente, sistemi di imaging digitale sono stati sviluppati per la lettura automatica di diapositive IIF. Questi sistemi, come il NOVA Visualizza Automated fluorescente Microscopio, sono progettati per semplificare il flusso di lavoro di routine IIF. NOVA View acquisisce e memorizza ad alta risoluzione le immagini digitali dei pozzetti, separando così l'acquisizione di immagini da interpretazione; le immagini vengono visualizzate una interpretazione sui monitor dei computer ad alta risoluzione. Memorizza le immagini per riferimento futuro e sostiene l'interpretazione dell'operatore, fornendo dati di intensità di luce fluorescente sulle immagini. Inoltre categorizza preliminarmente risultati come positivi o negativi, e prevede il riconoscimento di forme per i campioni positivi. In sintesi, si elimina la necessità di camera oscura, e automatizza e semplifica la prontezza IIFworkflow ng / interpretazione. Ancora più importante, aumenta la coerenza tra i lettori e letture. Inoltre, con l'uso di diapositive barcode, errori di trascrizione sono eliminati fornendo tracciabilità campione e identificazione del paziente. Ciò si traduce in una maggiore integrità dei dati del paziente e la sicurezza.

L'obiettivo generale di questo video è quello di dimostrare la procedura IIF, tra cui l'elaborazione di diapositive, l'identificazione di modelli comuni IIF, e l'introduzione di nuovi progressi per semplificare e armonizzare questa tecnica.

Introduzione

Il termine anticorpi antinucleo (ANA) descrive una varietà di autoanticorpi che reagiscono con costituenti dei nuclei delle cellule, tra cui DNA, proteine ​​e ribonucleoproteine ^{​​1, 2.} La cella HEp-2, una matrice proteina nativa con centinaia di antigeni, fornisce un substrato ideale per il rilevamento di ANA ^1. Il rilevamento di ANA nel siero umano è un importante strumento di screening per le malattie del tessuto connettivo, e IIF è il metodo di riferimento per il test ANA ^1. Recentemente, IFI su cellule HEp-2 è stato sostituito in alcuni laboratori con i dosaggi antigene-specifiche e metodi multiplex. A causa di preoccupazioni risultati falsi negativi e la mancanza di trasparenza ai clinici, l'American College of Rheumatology ha formato una task force che ha concluso che IIF utilizzando cellule HEp-2 dovrebbe essere il "gold standard" per ANA di screening ^1.

A causa della natura soggettiva dello screening ANA, la qualità delle cellule HEp-2 è integrata di riferimento corretto e sicuro dei risultati. La presenza di un elevato numero di cellule mitotiche, morfologia ottimale delle cellule, confluenza sufficiente, e l'espressione di antigeni rilevanti sono particolarmente importanti. Pattern recognition IIF serve come uno strumento importante per aiutare nella diagnosi del paziente. Comprendere il significato dei vari modelli permette ai medici e personale di laboratorio per eseguire il test di follow-up adeguato per confermare la diagnosi. Ad esempio, omogeneo modello ANA può verificare in presenza di anti-dsDNA o anticorpi cromatina, e può essere associata a lupus eritematoso sistemico (SLE) ^3. Dall'altro lato, è stato recentemente descritto che il cosiddetto modello denso bene a chiazze (DFS) che è comunemente visto in fino al 12% dei campioni di routine, è principalmente stata associata con anticorpi anti-DFS70. Questi autoanticorpi, quando si trova in isolamento (senza altri ANA malattia-specifica) non sono associati con malattie reumatiche autoimmuni sistemiche ^{4-9. In tal modo il test di conferma per gli anticorpi anti-DFS70 può aiutare a ridurre i test reflex inutili, offrire notevoli risparmi sui costi, e facilità l'ansia del paziente.}

Dato che IIF è il primo metodo di screening linea per rilevare autoanticorpi, è fondamentale che l'utente capisce come la selezione dei reagenti e substrati tissutali possono influenzare i risultati. Poiché la tecnica IIF è intrinsecamente personale, è importante che i reagenti utilizzati forniscano risultati di ottima qualità.

Questo obiettivo di questo protocollo video è quello di familiarizzare l'utente con i passaggi corretti necessari per eseguire il metodo IFI, i modelli più comuni associati con ANA, e di introdurre nuovi progressi che possono semplificare il flusso di lavoro del laboratorio e standardizzare i risultati.

Protocollo

1. Preparazione del campione e del substrato di selezione

1. Rimuovere i reagenti dalla confezione e lasciare ogni elemento raggiunga la temperatura ambiente. Preparare i reagenti e diluire siero del paziente secondo l'inserto direzione. Nota: i vetrini NOVA Lite sono di codice a barre e possono essere facilmente integrati in sistemi automatizzati in collaborazione con il Laboratory Information sistema LIS. Questa procedura illustra trasformazione presentazione manuale; laboratori high throughput, tuttavia, possono optare per impianti di lavorazione presentazione automatica.

2. Aggiunta di controlli e campioni

1. Dispensare 1 goccia di controllo positivo e 1 goccia di controllo negativo ai pozzetti di diapositive appropriate. Pipettare 20-25 microlitri di siero diluito del paziente nei pozzetti rimanenti. Elaborare una diapositiva alla volta.
2. Posizionare il vetrino (s) in un contenitore colorazione con un tovagliolo di carta umido sul fondo. Coprire il contenitore e incubare il vetrino (s) per 30 min. Nota: Le condizioni umide sarannoevitare che il substrato si asciughi. L'essiccazione dei pozzi potrebbe causare colorazione artefatta. Durante questo periodo di incubazione, gli anticorpi antinucleari nel siero del paziente si legano agli antigeni delle cellule che sono fissi su ogni bene.
3. Dopo il periodo di incubazione, risciacquare il siero con una leggera corrente di tampone di lavaggio. Al fine di evitare danni al substrato ed evitare cross-over dei campioni tra pozzi, angolo diapositiva leggermente per evitare dirigere il flusso direttamente sui pozzetti. Toccare il tampone di lavaggio in eccesso e posizionare il vetrino in una vaschetta Coplin contenente tampone di lavaggio per circa 5 min.

3. Aggiunta di coniugato fluorescente

1. Uno per uno, rimuovere le diapositive dalla tampone di lavaggio e picchiettare delicatamente per rimuovere l'eccesso di tampone di lavaggio. Applicare 1 goccia di coniugato fluorescente (FITC marcato anti-IgG umane) su ciascun pozzetto. Incubare i vetrini per 30 minuti nel contenitore umidificata, ed essere sicuri di sostituire la colorazionecoperchio del contenitore. Nota: Per il test ANA, si consiglia l'uso di un coniugato IgG specifiche Fc. Il coniugato è sensibile alla luce, e la copertura proteggerà i vetrini da esposizione alla luce oltre a mantenere l'ambiente umidificato. Durante questo periodo di incubazione, il coniugato si legano agli anticorpi anti-nucleari del paziente che sono legati agli antigeni cellulari. Questo coniugato vincolante risultati in presenza di fluorescenza nei pozzetti.
2. Risciacquare e lavare la diapositiva come descritto sopra.
3. Posizionare un vetrino su un tovagliolo di carta e applicare il mezzo di montaggio in una linea continua al bordo inferiore del vetrino.
4. Rimuovere ogni diapositiva dal tampone di lavaggio e toccare delicatamente il vetrino per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Toccare il bordo inferiore della slitta al bordo del vetrino.
5. Abbassare delicatamente il vetrino sul vetrino coprioggetti in modo tale che il mezzo di montaggio sul vetrino scorre al bordo superiore del vetrino senza formazione di bolle d'aria. Nota: Coverslipping, anche utilizzando la quantità ottimale di mezzo di montaggio, è una tecnica che si pratica per perfezionare.

4. Identificazione dei risultati positivi e negativi

Interpretazione manuale

1. Visualizza i vetrini con un microscopio a fluorescenza, che si trova in una stanza buia. Eseguire scansione dell'intero bene con un obiettivo 20X o 25X per valutare la distribuzione e l'uniformità di fluorescenza delle cellule
2. Passare a un obiettivo 40X per rendere l'interpretazione finale per quanto riguarda la positività e modello.
3. Guardate i controlli positivi e negativi. Grade positività utilizzando una scala di valutazione di reattività da 1 + a 4 +. Nota: Il controllo negativo non può apparire completamente buio, ma spesso mostrano bassi livelli di fluorescenza non specifica. Il controllo positivo mostrerà mela brillante fluorescenza verde nel nucleo (Figura 1).

Interpretazione automatizzata

Nota: In additia interpretazione manuale, del carico e diapositive scansione di NOVA Visualizza Automated microscopio a fluorescenza o altro strumento di imaging digitale automatizzata; nessuna camera oscura è necessario. Dopo aver creato un progetto selezionando il tipo di presentazione del caso, lo strumento acquisisce e memorizza ad alta risoluzione immagini digitali di cellule in ogni pozzetto. Inoltre, NOVA View misura l'intensità della luce fluorescente, e categorizza i risultati come positivi o negativi, e prevede il riconoscimento di forme per i campioni positivi. Le immagini vengono visualizzate dall'operatore su un monitor ad alta risoluzione, consentendo interpretazione finale, la revisione e la conferma di NOVA View risultato. I report possono essere generati sui risultati confermati. Microscopia digitale deve essere usato in combinazione con un tecnico di laboratorio esperto in quanto destinato a facilitare l'interpretazione dei risultati.

Risultati

Quando si valutano i risultati della colorazione delle cellule per Hep-2, cinque principali modelli nucleari sono più comunemente riportati: omogeneo, maculato, centromere, nucleolare, e puntini nucleari. Questi modelli sono il risultato di autoanticorpi legandosi a specifici componenti del nucleo. Anche se i test ANA è specifico per le strutture nucleari, i modelli citoplasmatici associati autoanticorpi contro strutture citoplasmatiche possono anche essere osservati. In alcuni casi, diversi autoanticorpi possono essere presenti in un campione, e l'immagine può apparire come un modello misto.

Ci sono altri, meno frequentemente osservata, e spesso modelli specifici del ciclo cellulare che possono essere rilevati dal metodo IFI; più di recente, il cosiddetto denso bene motivo maculato, con particolare rilevanza clinica è stata descritta in alcuni ANA sieri positivi.

Omogeneo modello

Per identificare un pattern omogeneo, la scansione del bene e identificare mitotica o demarcazionecellule. La cromatina condensata delle cellule mitotiche (Figura 2, freccia arancione) presenta solido, fluorescenza uniforme che è spesso più pronunciata che nella cella riposo nuclei.In il pattern omogeneo, il riposo cellule mostra uniforme, fluorescenza diffusa dell'intero nucleo (Figura 2, freccia bianca). Questo modello caratteristico è spesso il risultato di anticorpi anti-dsDNA ^10.

Pattern maculato

Nel modello chiazze grossolana, le cellule mitotiche mostrano alcuna colorazione delle regioni cromosomiche abbreviato (Figura 3, arancione freccia). Le cellule quiescenti presentano una fluorescenza granulare durante l'intero nucleo. La pezzatura nucleare può essere definito come grossolano o fine. Il modello di pezzatura grossolana è spesso il risultato di anti-Sm e anti-RNP ^11.

Nel modello a chiazze sottili, le cellule quiescenti mostrano pezzatura fine o diffusa in tutto i nuclei, in genere in uniforme dISTRIBUZIONE (Figura 4, freccia bianca). Il modello a chiazze sottili è spesso il risultato di anti-SSAand anti-SSB ^12.

Dense Belle macchiato modello

E 'ormai riconosciuto che l'ammenda modello chiazze dense (DFS) è comune nei test di routine, e ben il 12% dei campioni sono positivi per autoanticorpi anti-DFS70. Tuttavia, questi autoanticorpi, quando si trovano in isolamento, non sono associati con malattie reumatiche autoimmuni sistemiche ^{4 -6.} Questi anticorpi sono prevalenti nei soggetti e pazienti portatori di malattie non correlate al SARD ⁶ sani. Test di conferma per gli anticorpi anti-DFS70 può aiutare a ridurre i test reflex inutili, offrire notevoli risparmi sui costi, e facilità l'ansia del paziente.

Dal momento che il modello DFS è difficile da identificare e ANA positività può causare ansia sia per i pazienti e medici, si consiglia vivamente di eseguire un test di conferma dopo identi fying un modello suggestivo di anticorpi anti-DFS70 per chiarire il significato clinico di ANA positivty ^5,6.

In questo modello, le cellule in mitosi (Figura 5, arancione freccia) mostrano positivo colorazione a chiazze della cromatina metafase, mentre riposa nuclei delle cellule (Figura 5, freccia bianca) mostrano chiazze sottili distribuiti uniformemente su tutto il nucleo.

Centromere modello

Per identificare il modello centromero, la scansione dei pozzi e identificare mitotico o cellule in divisione. In cellule in mitosi (Figura 6, Freccia arancione), queste chiazze discrete diventano strettamente associati in quello che viene spesso descritto come un "bar metafase". Nel modello centromero, cellule quiescenti (Figura 6, freccia bianca) mostrano circa 40-60 chiazze discrete distribuiti i nuclei. Il modello centromero è il risultato di anti-CENP A, B, C anticorpi ^13.

passo "> Nucleolare Motivo

Alcuni modelli nucleolari sono associati con diffusa colorazione citoplasmatica in cellule mitotiche (Figura 7, freccia arancione) e regione cromosomica negativo, mentre altri modelli nucleolear mostrano colorazione positiva della regione cromosomica. Il pattern nucleolare è associato con colorazione omogenea o chiazze dei nucleoli (Figura 7, freccia bianca), oltre a chiazze o debole colorazione omogenea del nucleoplasm. Questi modelli sono associati con l'anti-RNA polimerasi III, anti-fibrillarina, anti-Th/To e anti-PM/Scl anticorpi ^14,15.

Nucleare modello di puntino

La serie di punti nucleare è associato negativi cellule mitotiche metafase (Figura 8, arancione freccia) e con poche chiazze discrete nei nuclei cellulari riposo (Figura 8, freccia bianca). Questo modello caratteristica è spesso il risultato di sp-100, PML, o p80 Colin autoanticorpi. Questi anticorpi sono spettivi con cirrosi biliare primaria ed epatite autoimmune ^16.

. Figura 1 Controllo negativo (a sinistra): le cellule mostrano bassi livelli di fluorescenza non specifica, ma nessuna colorazione nucleare specifica di controllo positivo (a destra):. Cellule monitor Apple fluorescenza nucleare verde.

Figura 2. Modello omogeneo. Cellule mitotiche (orangearrow) mostrano fluorescenza solido. Cellule quiescenti mostrano anche, colorazione diffusa (whitearrow).

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Figura 3. Grossolano maculato schema. Cellule mitotiche (freccia arancione) mostrano colorazione negativa. Cellule quiescenti mostrano una macchia maculato distinto (freccia bianca).

Figura 4. Belle motivo maculato. Cellule mitotiche (freccia arancione) mostra colorazione negativa. Cellule quiescenti mostrano una colorazione finemente maculata distinto (freccia bianca).

Figura 5. Dense bel modello a chiazze. Cellule mitotiche (freccia arancione) mostra una bella colorazione solido granulare. Cellule quiescenti mostrano una molto fine, diffusa macchia maculato (whitearrow).

Figura 6. Modello Centromere. Cellule mitotiche (orangearrow) mostra uniforme, chiazze discrete. Cellule quiescenti (whitearrow) mostra 40-60 chiazze discrete per nucleo delle cellule.

Figura 7. Modello Nucleolar. Cellule mitotiche (orangearrow) appaiono come grandi cluster di colorazione granulare. Riposo cellule nucleishows fluorescenza nei nucleoli (whitearrow).

Figura 8. Dot pattern nucleare. Cellule mitotiche (orangearrow) appaiono negative. Cellule quiescenti mostrano alcuni DISCRmacchioline ete nel nucleo (whitearrow). Inoltre, il modello di puntino Nucleari possono coesistere con colorazione citoplasmatica associata ad autoanticorpi diretti contro antigeni mitocondriali (freccia rossa).

Discussione

Lo screening con cellule HEp-2 è un primo passo fondamentale nella diagnosi dei pazienti con SARD. Tuttavia, i metodi IIF mancano di armonizzazione. Le fonti di variabilità includono la preparazione dei vetrini, la specificità coniugata e l'efficienza del microscopio a fluorescenza e l'esperienza del lettore. Nonostante queste preoccupazioni, l'IIF rimane il "gold standard" per i test ANA. Le cellule HEp-2 contengono una grande varietà di autoantigeni e forniscono il substrato ideale per la rilevazione di questi autoanticorpi. In alcuni laboratori, l'IIF è stato sostituito con metodi di screening in fase solida come il test multiplex o l'ELISA. Il difetto di tali test è che non mostrano l'intera gamma di antigeni per essere sufficientemente sensibili. Di conseguenza, i pazienti veri positivi possono essere persi, il che può avere conseguenze deleterie. Oltre ai problemi di ritardo del trattamento e diagnosi errata, possono verificarsi costi sanitari aggiuntivi a causa della ripetizione di test di conferma o indagini diagnostiche non necessarie. Date le sfide intrinseche all'IIF, è fondamentale eseguire correttamente questa tecnica per evitare la soggettività nei risultati.

Per garantire un'interpretazione e una refertazione accurate dei risultati per lo screening ANA, è fondamentale utilizzare un substrato di altissima qualità. Quando si seleziona un substrato HEp-2, è fondamentale che le cellule siano ottimizzate per esprimere epitopi clinicamente rilevanti nel loro stato proteico nativo. Le linee cellulari HEp-2 trasfettate o altrimenti modificate potrebbero non consentire un corretto legame anticorpo-antigene. Inoltre, quando sono presenti contemporaneamente diversi autoanticorpi, le cellule ricombinanti possono mascherare uno o più modelli. Nel substrato dovrebbe essere presente anche un numero elevato di cellule mitotiche. Un numero adeguato di cellule mitotiche consente un'identificazione rapida e accurata dei modelli.

Oltre alle caratteristiche del substrato, l'obiettivo di questo protocollo video è quello di descrivere la tecnica IIF mostrando passaggi critici come l'aggiunta del campione, il lavaggio dei vetrini, l'aggiunta di coniugato, lo scivolamento della copertura e la determinazione dei risultati positivi e negativi. I risultati possono essere compromessi se non viene utilizzata la tecnica corretta per ciascuno di questi passaggi. Un lavaggio adeguato è importante per rimuovere tutti gli anticorpi non legati. Alcuni pazienti mostrano quantità molto elevate di autoanticorpi e in questi casi è importante lavare il siero dai pozzetti in modo che non contamini altri pozzetti.

Sebbene l'IIF sia stato tradizionalmente un metodo di laboratorio molto laborioso e soggettivo, le nuove tecnologie come i processori di vetrini, i vetrini con codici a barre e la microscopia digitale automatizzata possono semplificare notevolmente il flusso di lavoro, aumentare la coerenza e ridurre le fonti di variabilità dell'interpretazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NOVA Lite HEp-2 IgG (coniugato DAPI)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics LINK019