Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Summary

Descriviamo un disegno di esperimenti approccio che può essere utilizzato per determinare e modellare l'influenza del transgene elementi regolatori, parametri di crescita e sviluppo delle piante, e condizioni di incubazione sulla espressione transiente di anticorpi monoclonali e proteine ​​reporter nelle piante.

Abstract

Le piante offrono molteplici vantaggi per la produzione di biofarmaci tra cui bassi costi, scalabilità e sicurezza. Espressione transiente offre il vantaggio supplementare di brevi tempi di sviluppo e di produzione, ma i livelli di espressione può variare notevolmente tra i lotti dando così luogo a preoccupazioni di regolamentazione nel contesto delle buone prassi di fabbricazione. Abbiamo usato un disegno degli esperimenti (DoE) approccio per determinare l'impatto dei principali fattori, quali elementi di regolamentazione del costrutto di espressione, la crescita delle piante e parametri di sviluppo, e le condizioni di incubazione durante espressione, sulla variabilità di espressione tra i lotti. Abbiamo testato piante che esprimono un modello anti-HIV anticorpo monoclonale (2G12) e una proteina marcatore fluorescente (DsRed). Discutiamo il razionale per la selezione di alcune proprietà del modello e identificare i suoi potenziali limiti. L'approccio generale può essere facilmente trasferito ad altri problemi perché i principi del modello unre ampiamente applicabile: la selezione dei parametri basata sulla conoscenza, la riduzione della complessità suddividendo il problema iniziale in moduli più piccoli, l'installazione guidata dal software di combinazioni ottimali di esperimento e graduale aumento del design. Pertanto, il metodo non è solo utile per caratterizzare l'espressione della proteina nelle piante, ma anche per la ricerca di altri sistemi complessi privi descrizione meccanicistica. Le equazioni predittive che descrivono l'interconnettività tra i parametri possono essere utilizzati per stabilire modelli meccanicistici per altri sistemi complessi.

Introduction

La produzione di proteine ​​biofarmaceutiche nelle piante è vantaggiosa perché le piante sono economici a crescere, la piattaforma può essere scalata solo crescendo più piante e patogeni umani sono in grado di replicare ^1,2. Strategie espressione transiente basate per esempio sulla infiltrazione di foglie con Agrobacterium tumefaciens offre ulteriori vantaggi perché il tempo tra il punto di consegna del DNA e la consegna di un prodotto purificato è ridotto da anni a meno di 2 mesi ^3. Espressione transiente è utilizzato anche per l'analisi funzionale, ad esempio per testare geni per la loro capacità di complementare perdita di f....

Protocol

1. Pianificazione di una strategia DoE

1. Identificare i fattori e le risposte pertinenti per l'inclusione nel progetto.
   1. Definire una o più risposte per la misura. Qui, sono stati usati i livelli di espressione 2G12 e DsRed (mcg / ml), compresa la differenza minima rilevabile considerate pertinenti (10 e 20 mg / ml, rispettivamente) e un valore approssimativo per la deviazione standard stimata del sistema (4 e 8 mg / ml, rispettivamente) sulla base di esperimenti precedenti.
   2. Utilizzare la letteratura disponibile, i dati provenienti da esperimenti precedenti o motivi di screening specializzati (ad esempio, un disegno fattoriale, ved....

Results

Un modello descrittivo per l'accumulo DsRed durante espressione transiente utilizzando diversi promotori e 5'UTRs

Fluorescenza DsRED in estratti di foglie è stato usato per indicare il livello di espressione della proteina ricombinante e quindi è stato usato come la risposta nella strategia DoE. La differenza minima rilevabile abbiamo considerato rilevante era di 20 mcg / ml e la deviazione standard stimata del sistema era di 8 mg / ml in base a esperimenti iniziali. Fattori.......

Discussion

Ogni esperimento richiede un'attenta pianificazione, perché le risorse sono spesso scarse e costose. Ciò è particolarmente vero per le strategie DoE perché errori durante la fase di pianificazione (ad esempio la selezione di un modello di base che non copre tutte le interazioni significative dei fattori) possono diminuire sostanzialmente il potere predittivo dei modelli risultanti e quindi svalutare l'intero esperimento. Tuttavia, questi errori possono essere facilmente evitati seguendo procedure di bas.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.DoE	software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Componente del terreno
Estratto di lievito	Carl Roth GmbH	2363.2	Componente del supporto
Cloruro di sodio	Carl Roth GmbH	P029.2	Componente del supporto
Ampicillina	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotico
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Componente del
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Microrganismo
pPAM	GenBank	AY027531	Vettore di clonazione/espressione;
Plasmide NucleoSpin	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Kit di isolamento del DNA plasmidico
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Kit di purificazione del DNA plasmidico
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.Spettrofotometro
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrizioneendonucleasi
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrizioneendonucleasi
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrizioneendonucleasi
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Tampone endonucleasi di restrizione
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Componente del terreno
Tetraborato di disodio	Carl Roth GmbH	4403.3	Componente del terreno
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Componente del supporto
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Componente del supporto
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Indicatore di colore
Xilene cianolo	Carl Roth GmbH	A513.1	Indicatore di colore
Glicerolo	Carl Roth GmbH	7530.2	Componente multimediale
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Camera per elettroforesi su gel
Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microrganismo
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Estratto di manzo	Carl Roth GmbH	X975.2	Componente del fluido
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Componente del supporto
Saccarosio	Carl Roth GmbH	4621.2	Componente del supporto
Solfato di magnesio	Carl Roth GmbH	0261.3	Componente
Carbenicillina	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotico
Kanamicina	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotico
Rifampicina	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotico
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.CCT	CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.CCA	AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Termociclatore	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	Università di Vienna	n.a.Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizzante
Grodan Rockwool Cubs 10 x10 cm	Grodan	n.a.Rockwool	block
Serra	n.a.n.a.Per		la coltivazione
di piantePhytotron	Ilka Zell	n.a.Per	la coltivazione di piante
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Siringa
Sali di Murashige e Skoog	Duchefa	M 0222.0010	Componente del terreno
Glucosio	Carl Roth GmbH	6780.2	Componente del supporto
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
Biofotometro plus	Eppendorf	6132 000.008	Fotometro
Osram bianco freddo 36 W	Osram	4930440	Sorgente luminosa
Fosfato disodico	Carl Roth GmbH	4984.3	Componente multimediale
Centrifuga 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuga
Forma -86C Congelatore ULT	ThermoFisher	88400	Congelatore
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Lettore di piastre a fluorescenza
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.SPR	dispositivo
Protein A	Life Technologies	10-1006	Proteina legante gli anticorpi
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Componente multimediale
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Componente multimediale
2G12 anticorpo	Anticorpo di riferimento Polymun	AB002