Monitoraggio parte dell'Assemblea di una Secreted batterica Virulence Factor Uso site-specific reticolazione

Sommario

Questo articolo illustra l'uso della marcatura radio a caccia di impulsi in combinazione con la fotoreticolazione sito-specifica per monitorare le interazioni tra una proteina di interesse e altri fattori in E. coli. A differenza dei tradizionali metodi chimici di reticolazione, questo approccio genera "istantanee" ad alta risoluzione di un percorso di assemblaggio ordinato in una cellula vivente.

Abstract

Questo articolo descrive un metodo per rilevare e analizzare le interazioni dinamiche tra una proteina di interesse e altri fattori in vivo. Il nostro metodo si basa sulla tecnologia di soppressione dell'ambra originariamente sviluppata da Peter Schultz e colleghi¹. Una mutazione ambra viene introdotta per la prima volta in un codone specifico del gene che codifica per la proteina di interesse. Il mutante ambra è quindi espresso in E. coli insieme a geni che codificano per un tRNA soppressore dell'ambra e un ammino-tRNA sintetasi derivato da Methanococcus jannaschii. Utilizzando questo sistema, l'analogo dell'amminoacido fotoattivabile p-benzoilfenilalanina (Bpa) viene incorporato nel codone ambrato. Le cellule vengono quindi irradiate con luce ultravioletta per legare in modo covalente il residuo di Bpa alle proteine che si trovano entro 3-8 Å. La fotoreticolazione viene eseguita in combinazione con la marcatura a inseguimento di impulsi e l'immunoprecipitazione della proteina di interesse al fine di monitorare i cambiamenti nelle interazioni proteina-proteina che si verificano in una scala temporale da secondi a minuti. Abbiamo ottimizzato la procedura per studiare l'assemblaggio di un fattore di virulenza batterico che consiste di due domini indipendenti, un dominio integrato nella membrana esterna e un dominio traslocato nello spazio extracellulare, ma il metodo può essere utilizzato per studiare molti processi di assemblaggio e percorsi biologici diversi sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche. In linea di principio, i fattori interagenti e anche i residui specifici di fattori interagenti che si legano a una proteina di interesse possono essere identificati mediante spettrometria di massa.

Introduzione

Spesso è essenziale identificare e caratterizzare le interazioni tra una proteina di interesse e altri componenti cellulari per definire il suo ruolo in un percorso biologico, per comprenderne l'assemblaggio o per chiarire il suo meccanismo d'azione. Un'ampia varietà di approcci è comunemente utilizzata per studiare le interazioni proteina-proteina, ma tutti hanno i loro limiti. Il metodo più semplice e imparziale per identificare le proteine che si legano a una proteina di interesse è la copurificazione (o coimmunoprecipitazione), ma questo approccio richiede che un complesso proteico rimanga intatto durante la procedura di purificazione. Le interazioni proteiche deb....

Protocollo

1. Costruzione di plasmidi

1. Dopo aver clonato un gene che codifica per una proteina di interesse in un vettore di espressione appropriato, introdurre mutazioni ambrate nelle posizioni desiderate utilizzando un kit di mutagenesi sito-diretta.
   NOTA: Le informazioni strutturali e le previsioni dell'esposizione superficiale possono servire come guide utili per determinare le posizioni delle mutazioni. Poiché l'efficienza della soppressione dell'ambra e della reticolazione può variare considerevolmente, le mutazioni dell'ambra dovrebbero essere introdotte in più posizioni. Inoltre, poiché il Bpa è un analogo della tirosina e della fenilalanina, cercare di....

Risultati

Abbiamo utilizzato il photocrosslinking sito-specifico per identificare le proteine che interagiscono con EspP durante il suo tragitto verso la membrana esterna (OM). Negli esperimenti qui mostrati, i codoni di fenilalanina nei residui 1113 e 1214 sono stati sostituiti con codoni ambra. Entrambe le posizioni si trovano nel dominio β, che si integra nella membrana esterna e funge da ancoraggio di membrana. La struttura cristallina del dominio β di EspP¹⁶ mostra che i due residui si trovano sul lato periplasmati.......

Discussione

Questo articolo descrive un metodo che combina la fotoreticolazione sito-specifica con l'etichettatura pulse-chase per esaminare la dinamica delle interazioni tra una proteina di interesse e altri componenti di una cellula vivente. Il metodo è particolarmente utile per studiare processi a più fasi in cui la proteina interagisce in sequenza con altri fattori. A differenza dei tradizionali approcci chimici di reticolazione, la fotoreticolazione sito-specifica fornisce informazioni dettagliate sullo stato dei singoli segmen.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
QuikChange II Kit per mutagenesi sito-specifica	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-LABEL, reagente per marcatura metabolica (35S-L-metionina e 35S-L-cisteina, >1.000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spectroline SB-100P Lampada UV ad altissima intensità, 365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Lampadina di ricambio per spettrolina 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Piastra per coltura tissutale Falcon	353046		laboratorio Becton Dickinson
Pallone monouso da 125 ml	Corning	430421
Innova 3100 Bagno d'acqua agitante	Nuovo Brunswick Scientific	n.a.

, da a 6 pozzetti