Monitoraggio parte dell'Assemblea di una Secreted batterica Virulence Factor Uso site-specific reticolazione

Sommario

Questo articolo illustra l'uso della marcatura radio a caccia di impulsi in combinazione con la fotoreticolazione sito-specifica per monitorare le interazioni tra una proteina di interesse e altri fattori in E. coli. A differenza dei tradizionali metodi chimici di reticolazione, questo approccio genera "istantanee" ad alta risoluzione di un percorso di assemblaggio ordinato in una cellula vivente.

Abstract

Questo articolo descrive un metodo per rilevare e analizzare le interazioni dinamiche tra una proteina di interesse e altri fattori in vivo. Il nostro metodo si basa sulla tecnologia di soppressione dell'ambra originariamente sviluppata da Peter Schultz e colleghi¹. Una mutazione ambra viene introdotta per la prima volta in un codone specifico del gene che codifica per la proteina di interesse. Il mutante ambra è quindi espresso in E. coli insieme a geni che codificano per un tRNA soppressore dell'ambra e un ammino-tRNA sintetasi derivato da Methanococcus jannaschii. Utilizzando questo sistema, l'analogo dell'amminoacido fotoattivabile p-benzoilfenilalanina (Bpa) viene incorporato nel codone ambrato. Le cellule vengono quindi irradiate con luce ultravioletta per legare in modo covalente il residuo di Bpa alle proteine che si trovano entro 3-8 Å. La fotoreticolazione viene eseguita in combinazione con la marcatura a inseguimento di impulsi e l'immunoprecipitazione della proteina di interesse al fine di monitorare i cambiamenti nelle interazioni proteina-proteina che si verificano in una scala temporale da secondi a minuti. Abbiamo ottimizzato la procedura per studiare l'assemblaggio di un fattore di virulenza batterico che consiste di due domini indipendenti, un dominio integrato nella membrana esterna e un dominio traslocato nello spazio extracellulare, ma il metodo può essere utilizzato per studiare molti processi di assemblaggio e percorsi biologici diversi sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche. In linea di principio, i fattori interagenti e anche i residui specifici di fattori interagenti che si legano a una proteina di interesse possono essere identificati mediante spettrometria di massa.

Introduzione

Spesso è essenziale identificare e caratterizzare le interazioni tra una proteina di interesse e altri componenti cellulari per definire il suo ruolo in un percorso biologico, per comprenderne l'assemblaggio o per chiarire il suo meccanismo d'azione. Un'ampia varietà di approcci è comunemente utilizzata per studiare le interazioni proteina-proteina, ma tutti hanno i loro limiti. Il metodo più semplice e imparziale per identificare le proteine che si legano a una proteina di interesse è la copurificazione (o coimmunoprecipitazione), ma questo approccio richiede che un complesso proteico rimanga intatto durante la procedura di purificazione. Le interazioni proteiche deboli o transitorie possono essere stabilizzate attraverso la reticolazione chimica, ma questo metodo richiede tipicamente l'uso di composti che legano le proteine attraverso ammine primarie che sono ampiamente sparse nella sequenza proteica. Possono essere generati modelli di reticolazione complicati e difficili da interpretare, soprattutto quando le proteine di interesse sono componenti di complessi multiproteici. Inoltre, poiché i bracci spaziatori dei reticolanti chimici generalmente superano i 10 Å di lunghezza, i legami covalenti possono essere formati con proteine che si trovano in prossimità ma non interagiscono direttamente con la proteina di interesse, ma non interagiscono direttamente con essa. Anche metodi come la cromatografia di affinità e gli screening a due ibridi sono spesso utili per identificare le interazioni proteina-proteina. Il primo approccio, tuttavia, richiede la riproduzione di condizioni che promuovono interazioni fisiologicamente significative e non possono essere utilizzate per rilevare interazioni deboli. Quest'ultimo approccio richiede che le interazioni di legame possano essere replicate nell'organismo ospite e siano mantenute quando una proteina di interesse e i suoi partner di legame vengono inseriti nel contesto di una proteina di fusione. I metodi a due ibridi tendono anche a generare risultati falsi positivi². Una volta stabilita un'interazione proteina-proteina, è spesso necessario un lavoro considerevole per mappare il sito di interazione. Forse lo svantaggio più significativo degli approcci tradizionali è che non forniscono alcuna informazione sulla sequenza temporale delle interazioni intermolecolari o sulla cinetica del legame.

Questo articolo descrive un metodo semplice che supera alcuni dei limiti di altri approcci utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina. Inizialmente una singola mutazione ambra viene introdotta nel gene che codifica per una proteina di interesse. Il mutante ambra è quindi coespresso con un tRNA soppressore dell'ambra e un ammino-acil-tRNA sintetasi derivato da Methanococcus jannaschii che sono stati ingegnerizzati per incorporare l'analogo dell'amminoacido fotoattivabile p-benzoililalanina (Bpa) solo ai codoni ambrati³. L'irradiazione di cellule con luce ultravioletta (UV) a lunga lunghezza d'onda (~365 nm) facilita quindi la formazione di un legame covalente tra Bpa e proteine che si trovano entro ~3-8 Å^4,5. In alcuni contesti sperimentali, possono anche formarsi legami incrociati tra Bpa attivato e componenti non proteici di cellule come lipidi e acidi nucleici⁶. Le molecole che terminano nel codone ambrato dovrebbero generalmente essere facilmente distinguibili dalla proteina a lunghezza intera su SDS-PAGE e non possono essere reticolate con altre proteine. Sottoponendo le cellule alla radiomarcatura pulse-chase prima del cross-linking e quindi all'immunoprecipitazione o ai prodotti di cross-linking purificanti per affinità, è possibile stabilire la sequenza e la durata delle interazioni proteina-proteina. La capacità di generare informazioni temporali sulle interazioni intermolecolari è particolarmente preziosa per studiare la progressione di una proteina di interesse attraverso qualsiasi assemblaggio multistep ordinato, traffico o via di segnalazione e per identificare gli intermedi della via. Come il cross-linking chimico, il cross-linking sito-specifico rileva le interazioni proteina-proteina che si verificano in condizioni fisiologiche, ma l'introduzione di un cross-linker in una singola posizione facilita l'analisi delle interazioni tra i singoli segmenti di una proteina e altri fattori. Questa caratteristica unica del cross-linking sito-specifico è particolarmente vantaggiosa quando la proteina di interesse ha più segmenti o domini che hanno il potenziale di interagire con partner di legame distinti. Inoltre, il cross-linking sito-specifico può essere utilizzato in combinazione con metodi come la spettrometria di massa per mappare con precisione i residui che mediano le interazioni proteina-proteina. Sebbene questo metodo sia ottimizzato per l'uso in E. coli, l'incorporazione di analoghi fotofruttiferi di amminoacidi nelle proteine mediante soppressione dell'ambra è stata riportata in Mycobacterium, lievito e cellule di mammifero^7-11. Pertanto, in linea di principio, il nostro metodo può essere utilizzato in altri sistemi.

Abbiamo utilizzato ampiamente questo metodo per identificare le interazioni intermolecolari che facilitano la biogenesi di EspP, un fattore di virulenza O157:H7 di E. coli. L'EspP è un membro di una superfamiglia di proteine note come "autotrasportatori" che contengono un grande dominio extracellulare N-terminale ("dominio passeggero") e un dominio aC-terminale ("dominio b") che si ripiega in una struttura cilindrica b barrel e ancora la proteina alla membrana esterna (OM)¹². Il meccanismo con cui il dominio del passeggero viene traslocato attraverso l'OM è stato un mistero di lunga data. Come tutte le proteine della superficie cellulare batterica, l'EspP deve essere trasportata attraverso la membrana interna, trasportata attraverso il periplasma (lo spazio tra la membrana interna ed esterna) e indirizzata all'OM in una serie di eventi ordinati. A seguito della sua traslocazione attraverso l'OM, anche il dominio passeggero EspP viene separato dal dominio b da una scissione proteolitica e rilasciato dalla superficie cellulare. Combinando il cross-linking sito-specifico con la radiomarcatura pulse-chase, abbiamo dimostrato che entrambi i domini della proteina interagiscono inizialmente con il chaperone molecolare Skp nel periplasma⁶. Successivamente, segmenti discreti del dominio b interagiscono in modo stereospecifico con i componenti di un eterooligomero chiamato complesso Bam, che catalizza l'integrazione delle proteine b barrel nell'OM batterico attraverso un meccanismo sconosciuto. Forse la cosa più interessante è che abbiamo scoperto che il dominio del passeggero è in contatto con una delle subunità del complesso Bam (BamA) mentre attraversa l'OM¹³. I nostri risultati ci hanno permesso di costruire un modello dettagliato per l'assemblaggio^{dell'autotrasportatore 14} e hanno implicato il complesso Bam nel trasporto del dominio passeggeri attraverso l'OM.

Protocollo

1. Costruzione di plasmidi

1. Dopo aver clonato un gene che codifica per una proteina di interesse in un vettore di espressione appropriato, introdurre mutazioni ambrate nelle posizioni desiderate utilizzando un kit di mutagenesi sito-diretta.
   NOTA: Le informazioni strutturali e le previsioni dell'esposizione superficiale possono servire come guide utili per determinare le posizioni delle mutazioni. Poiché l'efficienza della soppressione dell'ambra e della reticolazione può variare considerevolmente, le mutazioni dell'ambra dovrebbero essere introdotte in più posizioni. Inoltre, poiché il Bpa è un analogo della tirosina e della fenilalanina, cercare di introdurre mutazioni dell'ambra in posizioni che normalmente codificano grandi amminoacidi idrofobici per minimizzare le perturbazioni della struttura e della funzione delle proteine. Infine, quando si sceglie un vettore di espressione, tenere presente che la sovrapproduzione di una proteina di interesse a un livello molto alto potrebbe limitare l'efficienza dell'incorporazione di Bpa.

2. Preparazione alla cultura

1. Utilizzare l'elettroporazione per trasformare un ceppo appropriato di E. coli con un plasmide che codifica per il sistema di soppressione dell'ambra (pDULE-p Bpa; vedi riferimento⁴) e un plasmide compatibile che codifica per la proteina di interesse con una mutazione ambra.
2. Piastre su agar LB contenenti antibiotici appropriati (utilizzare 5 μg/ml di tetraciclina per selezionare pDULE-p Bpa). Incubare le piastre O/N a 37 °C.
3. Il giorno seguente, iniziare le colture O/N da singole colonie in 3-5 ml di terreno M9¹⁴ contenente lo 0,2% di glicerolo, tutti gli L-amminoacidi tranne metionina e cisteina (40 μg/ml) e antibiotici. Incubare a 37 °C.
4. Il giorno successivo, centrifugare le colture O/N a 2.500 x g per 5 minuti a RT su cellule a pellet. Risospendere le cellule in 5 ml di terreno M9 fresco e ripetere la centrifugazione.
   NOTA: Questa fase di lavaggio è fondamentale per mantenere i plasmidi che codificano la resistenza all'ampicillina perché piccole quantità di b lattamasi presenti nel terreno dalle colture O/N degradano l'ampicillina appena aggiunta prima che si verifichi una crescita cellulare significativa.
5. Risospendere le cellule in 2 ml di terreno fresco e misurare la concentrazione cellulare in uno spettrofotometro (OD₅₅₀).
6. Aggiungere le cellule a un pallone di Erlenmeyer da 250 ml contenente 50 ml di terreno M9 e antibiotici con OD₅₅₀=0,03. Incubare le colture a 37 °C in un bagno d'acqua agitante.

3. Incorporazione Bpa e preparazione per la fotoreticolazione

NOTA: Il protocollo descritto di seguito è per un corso temporale di esempio che ha tre punti temporali (0, 1 e 5 min). Regolare i volumi di conseguenza se si desidera un numero diverso di punti temporali. Uno schema della procedura è illustrato nella Figura 1.

1. Mentre le colture crescono, preparare una soluzione fresca 1 M (1.000x) di Bpa in 1 M NaOH (27 mg di Bpa in 100 μl 1 M NaOH). Usa un tubo a pareti scure per mantenere la soluzione al buio.
2. Quando le colture raggiungono la fase di log iniziale e medio (OD₅₅₀=0,2), aggiungere 50 μl di 1 M Bpa a ciascuna coltura. Aggiungere Bpa una goccia alla volta mentre si agita il pallone per evitare precipitazioni. Quindi, aggiungi tutti gli induttori necessari per guidare l'espressione del mutante ambra. Continuare a incubare le colture a 37 °C per altri 30 minuti.
3. Durante il periodo di induzione di 30 minuti, etichettare sei provette da centrifuga monouso da 15 ml con il punto temporale (0 min, 1 min, 5 min) e "+ UV" o "- UV". Metti i tubi sul ghiaccio.
4. Riempi un secondo secchiello del ghiaccio con ghiaccio e posiziona una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti sopra il ghiaccio.
5. Scongelare un'elevata attività specifica (1.000 mCi/mmol) ³⁵S-metionina e ³⁵S-cisteina (o una miscela preconfezionata dei due composti) per la marcatura degli impulsi e preparare (o scongelare) una soluzione di L-cisteina non radioattiva e L-metionina (100 mM ciascuna) per l'inseguimento.
6. Accendere la lampada UV cinque minuti prima della radiomarcatura.
   NOTA: La lampada deve essere regolabile in modo da poter essere posizionata a ~3-4 cm dai campioni nella piastra multipozzetto.
7. Aggiungere ghiaccio (~2 ml) a ciascuna provetta etichettata "- UV" e a due dei pozzetti della piastra multipozzetto.
   NOTA: Il ghiaccio deve essere aggiunto a un terzo pozzetto immediatamente prima del tempo di 5 minuti. È essenziale posizionare il ghiaccio direttamente nelle provette e nei pozzetti per fermare immediatamente le reazioni intracellulari in ogni momento e ottenere così "istantanee" accurate di una specifica via biochimica.
8. Al termine del periodo di induzione di 30 minuti, trasferire 25 ml di coltura in un pallone monouso preriscaldato da 125 ml. Porre il pallone nel bagnomaria con agitazione a 37 °C.

4. Etichettatura a caccia di impulsi e irradiazione UV

NOTA: Il protocollo di etichettatura a caccia di impulsi e irradiazione UV ha molti passaggi che devono essere eseguiti in modo tempestivo e che richiedono una notevole organizzazione e preparazione anticipata. Tutti i reagenti e le provette devono essere facilmente accessibili. Di seguito viene presentato un protocollo per un esperimento con punti temporali di 0, 1 e 5 minuti.

1. Al tempo 0:00 (min:sec) trasferire 25 ml di coltura in un matraccio da 125 ml.
2. Al tempo 0:30 aggiungere 30 μCi/ml di amminoacidi radioattivi; agitare rapidamente per mescolare. Immergere il matraccio nel bagnomaria con agitazione a 37 °C.
3. Al minuto 1:00 aggiungere 250 μl della soluzione 100 mM di metionina-cisteina; agitare rapidamente per mescolare.
   1. Pipettare immediatamente 4 ml di coltura in uno dei pozzetti della piastra multipozzetto refrigerata che contiene ghiaccio. Pipettare una seconda aliquota da 4 ml nella provetta da 15 ml etichettata "0 min - UV". Rimettere il pallone nel bagnomaria.
4. Alle ore 2:00 pipettare 4 ml di coltura nel secondo pozzetto della piastra multipozzetto raffreddata che contiene ghiaccio. Pipettare un'altra aliquota da 4 ml nella provetta da 15 ml etichettata "1 min - UV". Rimettere il pallone nel bagnomaria.
5. Alle 6:00 pipettare 4 ml di coltura nel terzo pozzetto della piastra multipozzetto raffreddata che contiene ghiaccio. Pipettare un'altra aliquota da 4 ml nella provetta da 15 ml etichettata "5 min - UV".
6. Posizionare il secchiello del ghiaccio con la piastra multipozzetto sotto la lampada UV preriscaldata e irradiare ogni campione singolarmente per 4 min.
   NOTA: Negli esperimenti in cui i punti temporali sono distanziati di almeno 4 minuti l'uno dall'altro, ogni campione deve essere irradiato non appena viene pipettato nella piastra multipozzetto.
7. Trasferire le cellule nelle provette refrigerate da 15 ml etichettate "0 min +UV", 1 min +UV", ecc.
8. Centrifugare le celle a 2.500 x g per 10 minuti a 4 °C.
9. Risospendere ogni campione in 300 μl di terreno M9 o PBS e aggiungere 33 μl di acido tricloroacetico freddo (TCA) al 100% per precipitare le proteine. Centrifugare il TCA precipita in microfuga alla massima velocità per 10 minuti e rimuovere il surnatante. A questo punto i campioni possono essere conservati a - 20 °C.

5. Immunoprecipitazione e rilevamento di prodotti reticolanti

1. Aggiungere 50 μl di tampone di solubilizzazione (15% di glicerolo, 200 mM di Trisbase, 15 mM di EDTA, 4% di SDS, 2 mM di PMSF) a ciascun campione e riscaldare agitando a 95 °C per 5 minuti per solubilizzare la proteina precipitata.
2. Aggiungere 1 ml di tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% desossicolato, 0,1% SDS) ed eseguire immunoprecipitazioni standard¹⁵ utilizzando da un quinto alla metà di ciascun campione.
   NOTA: Igepal CA-630 (ottilfenil-polietilenglicole) viene utilizzato al posto di NP-40, che non è più disponibile in commercio. I due composti sono chimicamente indistinguibili.
3. Risolvere le proteine immunoprecipitate mediante SDS-PAGE. Colorare, decolorare e asciugare i gel.
4. Esporre i gel a uno schermo al fosforo O/N e rilevare le proteine radioattive (compresi i prodotti reticolanti) con un phosphorimager.

Risultati

Abbiamo utilizzato la fotoreticolazione sito-specifica per identificare le proteine che interagiscono con EspP durante il suo viaggio verso l'OM. Negli esperimenti che sono mostrati qui, i codoni di fenilalanina ai residui 1113 e 1214 sono stati sostituiti con codoni ambrati. Entrambe le posizioni si trovano nel bdomain, che si integra nell'OM e funge da ancoraggio a membrana. La struttura cristallina del dominio¹⁶ di EspPβ mostra che i due residui si trovano sul lato periplasmatico del barilotto b ma sono sep...

Discussione

Questo articolo descrive un metodo che combina la fotoreticolazione sito-specifica con l'etichettatura pulse-chase per esaminare la dinamica delle interazioni tra una proteina di interesse e altri componenti di una cellula vivente. Il metodo è particolarmente utile per studiare processi a più fasi in cui la proteina interagisce in sequenza con altri fattori. A differenza dei tradizionali approcci chimici di reticolazione, la fotoreticolazione sito-specifica fornisce informazioni dettagliate sullo stato dei singoli segmen...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
QuikChange II Kit per mutagenesi sito-specifica	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-LABEL, reagente per marcatura metabolica (35S-L-metionina e 35S-L-cisteina, >1.000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spectroline SB-100P Lampada UV ad altissima intensità, 365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Lampadina di ricambio per spettrolina 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Piastra per coltura tissutale Falcon	353046		laboratorio Becton Dickinson
Pallone monouso da 125 ml	Corning	430421
Innova 3100 Bagno d'acqua agitante	Nuovo Brunswick Scientific	n.a.