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Articolo metodologico

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L'ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

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DOI:

10.3791/51218

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27 gennaio 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

In questo articolo

Sommario

L'attivazione persistente del inibitori G recettori accoppiati alla proteina provoca sensibilizzazione della segnalazione ciclasi ciclasi. Per identificare le vie molecolari essenziali, sono necessari approcci nonbiased, tuttavia, questa strategia richiede lo sviluppo di una base cellulare scalabile saggio cAMP sensibilizzazione. Qui, descriviamo un test di sensibilizzazione per la piccola molecola e lo screening siRNA.

Abstract

Sensibilizzazione di adenilato ciclasi (AC) segnalazione è stata implicata in una varietà di disturbi neuropsichiatrici e neurologici compreso abuso di sostanze e il morbo di Parkinson. L'attivazione acuta di Gαi / recettori o-linked inibisce l'attività AC, mentre l'attivazione persistente di questi recettori provoca sensibilizzazione eterologa di AC e aumento dei livelli di cAMP intracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che questo miglioramento di reattività AC è osservato sia in vitro che in vivo in seguito all'attivazione cronica di diversi tipi di recettori / O-linked Gαi compresi D 2 della dopamina e recettori oppioidi μ. Sebbene sensibilizzazione eterologa di AC è stata segnalata per la prima di quattro decenni fa, il meccanismo (s) che sono alla base di questo fenomeno restano in gran parte sconosciute. La mancanza di dati meccanicistici presumibilmente riflette la complessità di questa risposta adattativa, suggerendo che gli approcci nonbiased potrebbero aiutare a identificarezione delle vie molecolari coinvolti nella sensibilizzazione eterologa di AC. Studi precedenti hanno implicato chinasi e segnalazione Gbγ come componenti che regolano la sensibilizzazione eterologa di AC sovrapposizione. Per identificare gli obiettivi sovrapposti unico e aggiuntivi connessi con la sensibilizzazione di AC, lo sviluppo e la validazione di una soluzione scalabile test cAMP sensibilizzazione è necessaria per una maggiore produttività. Approcci precedenti per studiare sensibilizzazione sono generalmente ingombranti coinvolge cellulare continua cultura manutenzione nonché una complessa metodologia per misurare l'accumulo di cAMP che coinvolge più fasi di lavaggio. Pertanto, lo sviluppo di un saggio basato su cellule robusto che può essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento (HTS) in un formato ben 384 facilitare studi futuri. Utilizzando due modelli cellulari D 2 del recettore della dopamina (ad esempio. CHO-D 2L e HEK-AC6 / D 2L), abbiamo trasformato il nostro saggio di sensibilizzazione a 48 pozzetti (> 20 gradini 4-5 giorni) per un periodo di cinque-step, unico dosaggio giorno in formato 384-bene. Questo nuovo formato è suscettibile di proiezione piccola molecola, e ci dimostrano che questo motivo test può anche essere facilmente utilizzato per la trasfezione inversione di siRNA in previsione di uno screening della libreria siRNA mirati.

Introduzione

Un ciclasi adattativo (AC) di segnalazione di risposta noto come-eterologo o super-sensibilizzazione è stato scoperto nel laboratorio del premio Nobel, il dottor Marshall Nirenberg. Il Dott. Nirenberg proposto che l'aumento della reattività AC osservata dopo l'attivazione dei recettori oppioidi δ cronica era un meccanismo coinvolto nella tolleranza e dipendenza da oppiacei 1. Oltre ai recettori oppioidi δ cronica, questa risposta neuroadaptive di segnalazione AC si verifica anche dopo l'attivazione persistente di diversi altri Gαi / o recettori accoppiati a 2. In particolare, molti di questi recettori sono associati con dolore, disturbi neuropsichiatrici e neurologici, e comprendono μ / κ oppioidi, D 2/4 dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 recettori muscarinici 2. Oltre ai risultati del Dott. Nirenberg, un grande corpo di evidenze esiste collega sensibilizzazione della segnalazione AC all'attivazione cronica dei recettori oppioidi sia in vitro e in vivo 3-7. Sensibilizzazione di AC è stata anche associata con una varietà di malattie che coinvolgono i recettori dopaminergici D 2-come compreso la schizofrenia e il morbo di Parkinson (per una rassegna vedi riferimento 2). Nonostante l'importanza potenziale di sensibilizzazione, il meccanismo preciso (s) associata a persistente / attivazione del recettore Gαi o accoppiato, che porta ad una maggiore reattività AC rimane in gran parte sconosciuta.

Questi studi forniscono il razionale per l'esame dei meccanismi di sensibilizzazione della ciclasi come un importante obiettivo neurobiologica. Analogamente, la rilevanza fisiologica di AC segnalazione 8 e l'importanza che le singole isoforme AC tengono in questa risposta adattativa dovrebbero essere riconosciuti 2,9,10. Nel contesto della nostra ricerca, le caratteristiche generali associati sensibilizzazione eterologa delle isoforme ricombinanti di AC paralleli tali caratteristiche described per studiare le isoforme endogeni di AC. In particolare, la ricerca precedente ha scoperto che l'attivazione di Gαi / o proteine ​​e subunità successivo rilascio / riassestamento βγ sono requisiti importanti per il recettore indotta sensibilizzazione di tutte le isoforme AC. Inoltre, diversi studi suggeriscono che la segnalazione di proteine ​​chinasi e subunità Gβγ sono coinvolti nella sensibilizzazione 2,11-13. AC individuali mostrano anche i modelli di sensibilizzazione uniche e distinte 12. Per esempio, l'esposizione persistente di D 2 recettori agonisti è associata con sensibilizzazione di AC1 e AC8 di Ca 2 + / calmodulina stimolazione 14,15, mentre la strettamente correlata AC3 non è sensibilizzata 2. AC2, AC4 e AC7 sono strettamente correlati, però, solo l'attività AC2 PKC-stimolata è robusto sensibilizzato dopo una prolungata esposizione di D 2 recettori agli agonisti 7,14,16,17. Inoltre, AC5 e AC6 mostrano una marcata grado di hetersensibilizzazione ologous a gas e forskolina stimolata cAMP accumulo a seguito di attivazione dei recettori D2 14,18-20, ma sembrano differire nella loro esigenza di Gβγ subunità-AC INTERAZIONI 21. Sebbene la maggior parte degli studi di sensibilizzazione AC hanno utilizzato linee cellulari modello (ad esempio cellule HEK293 che esprimono le singole isoforme di AC), sembra che questi risultati si traducono in modelli cellulari neuronali nativi 4,22. Più recentemente, gli effetti della isoforma AC selettivi piccole molecole inibitrici identificati in cellule HEK293 esprimenti isoforme CA possono anche essere tradotti in studi comportamentali in vivo 23.

La mancanza di un meccanismo molecolare identificato per la sensibilizzazione eterologa probabilmente riflette la complessità della risposta adattativa nonché le uniche proprietà regolazione individuale isoforme AC 12. Dipanare tale complessità è ulteriormente complicata dall'utilizzo di ingombrante metodologia tCappello ha limitato ricercatori accademici da impiegare approcci imparziali. Ad esempio, i nostri precedenti studi meccanicistici comportato l'utilizzo di modelli cellulari continuamente coltivate con 24 - e 48-ben formato coltura di tessuti 15. Cellule in coltura erano tipicamente coltivate per 48 ore e quindi sottoposti a trattamento farmacologico con agonisti (2-18 ore) seguito da una serie di lavaggi cellulari e incubazione (Figura 1). Protocolli accumulo di cAMP specifico AC-isoforma erano poi impiegato seguita dalla misurazione di accumulo di cAMP utilizzando un laborioso e richiede tempo [3 H] cAMP metodologia 15,24 vincolante. La durata dall'inizio alla fine di ciascun saggio generalmente richiesto un totale di quattro o cinque giorni da placcatura cella per l'analisi dei dati (Figura 1). L'applicazione di nuove tecnologie e l'automazione ha portato a miglioramenti marcati per gli studi di sensibilizzazione in ambiente industriale e HTS centro. Ad esempio, un gruppo di lavoro con il Centro Nazionale per Chemical Genomics ha riportato una due giorni HTS procedura di analisi per l'identificazione di piccole molecole inibitrici di μ recettori oppioidi sensibilizzazione indotta in formato 1.536-ben 25.

Il presente articolo descrive i nostri sforzi per sviluppare un test HTS per studi di sensibilizzazione eterologa utilizzando tecnologie che sono disponibili presso la maggior parte degli istituti di ricerca universitari. Questa strategia è stata realizzata incorporando l'uso di cellule crioconservati da modelli cellulari eterologhi che esprime il recettore dopaminergico D 2 in combinazione con endogeni o singoli ricombinanti isoforme ciclasi (CHO-D 2L o HEK-AC6 / D 2 L). Per migliorare il nostro rendimento, abbiamo ridisegnato la nostra sensibilizzazione test ben 48 (ca.> 20 passi oltre 4-5 giorni) per un periodo di cinque step, test solo giorno in formato 384-bene che era essenzialmente "mix e leggere". Il nuovo formato utilizza un tempo omogeneo disponibile in commercio fluorescenza risolta (HTRF) test per misurare cAMP accumulation in cellule intatte con un lettore di piastra a più modalità. Il test è robusto e suscettibili di proiezione piccola molecola, e può essere efficacemente applicata a screening per inibitori di sensibilizzazione eterologa. Inoltre, forniamo i dati che permettono l'uso di questo test con trasfezione inversione di siRNA a una vasta libreria di siRNA lo screening mirati o del genoma con solo una piccola modifica per l'impostazione generale.

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Protocollo

1. Espansione e crioconservazione delle cellule Assay pronti

  1. Cultura CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) le cellule su una cella piatto 15 centimetri 2 cultura dei media F12 di Ham integrato con 1.0 mM L-glutammina, 800 mg / mL G418, 300 mg / igromicina ml, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, e siero bovino fetale al 10% (FBS).
  2. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono 90-95% confluenti. Lavare le cellule con 10 microlitri tampone fosfato isotonico (PBS), e raccogliere le cellule aggiungendo 3 ml di tampone di dissociazione cellulare per 5 min a 37 ° C. Risospendere le cellule con 12 ml di media cultura e contare le celle utilizzando trypan blu.
  3. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzi di congelamento (10% dimetilsolfossido, 90% FBS). Diluire la sospensione cellulare per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata (ad esempio 1-20 x 10 6 cellule / ml).
  4. Aliquota 1,0 ml di soluzione di cella per ogni esageratamente. Incubare le cryovials in un contenitore cella di congelamento a -80 ° C per una notte. Trasferire le cryovials ad un serbatoio di liquido N 2 per conservazione a lungo termine.

2. Placcatura del saggio Cellule pronte (e Reverse Transfezione Option)

  1. Rapidamente scongelare un esageratamente congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 °. Una volta che le cellule vengono scongelate, trasferire le cellule in una provetta da 15 ml contenente 9 ml di Opti-MEM, e mescolare per inversione 3-5x.
  2. Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in 1 ml Opti-MEM.
  3. Contare le cellule utilizzando trypan blu per determinare la vitalità cellulare e diluire le cellule vitali, se necessario (ad es. 3 x 10 5 cellule / ml concentrazione) inOpti-MEM. La tavola 10 microlitri / pozzetto di cellule di una coltura tissutale trattata piastra a 384 pozzetti usando una pipetta multicanale.
  4. Effettuare diluizioni seriali di cAMP in Opti-MEM per generare una curva standard per stimare la produzione di cAMP da parte delle cellule (secondo le manifatture raccomandazioni - vedere la sezione 7). Aggiungere 10 microlitri / pozzetto delle norme cAMP alla piastra Nota:. Un'unica curva standard può essere preparato su una piastra separata o pozzi in bianco su una delle piastre di saggio.
  5. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 1 ora.

3. Invertire la trasfezione di siRNA Opzione *

Questa sezione è facoltativa e pertinente alla figura 3.

  1. Preparare una soluzione di siRNA in DDH RNase-free 2 O (ad esempio 0,4 pmol / ml). Aggiungere 5 microlitri a singoli pozzetti della piastra a 384 pozzetti, e centrifugare la piastra a 100 xg per 15 SEc a temperatura ambiente.
  2. Diluire Lipofectamine 2000 Opti-MEM di un fattore 0.006 (es aggiungere 6 ml di Lipofectamine 2000 a 1000 ml di Opti-MEM), e mescolare pipettando su e giù.
  3. Incubare la soluzione Lipofectamine 2000/Opti-MEM per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 5 ml di soluzione diluita Lipofectamine 2000/Opti-MEM a singoli pozzetti della piastra a 384 pozzetti che contiene già siRNA. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente.
  4. Incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Saggio Piatto cellule pronte come descritto in precedenza (sezione 2). Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente.
  6. Ritorno piastra di saggio di incubatore umidificato a 37 ° (CO 5% 2) C per 48-96 ore, come determinato per il gene targeting abbattere (vedi la discussione).

4. Piccolo Screening Molecola

  1. Diluire il farmaco di interesse (es. inibitori. Piccole molecole) in Opti-MEM a 6x le concentrazioni finali desiderati. Diluizioni seriali possono essere completate con pipette a mano o una stazione di gestione dei liquidi.
  2. Aggiungere 2,5 ml / pozzetto di composto di prova o tampone contenente veicolo (ad es DMSO) al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
  3. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente (incubazione è opzionale).

5. Persistente Agonista Trattamento

  1. Preparare una 600 nm (per esempio. 6 volte la concentrazione finale desiderata di 100 nm) soluzione quinpirole in Opti-MEM.
  2. Aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione quinpirole 600 nM al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
  3. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 2 h.

6. La stimolazione di cAMP Accumulation

  1. Durante l'incubazione 2 ore, prepara le stimulatisulla soluzione Opti-MEM. La soluzione di stimolazione è composto da 40 mM forskolina, 2 mM 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), e 4 mM spiperone (tutte le concentrazioni nel passaggio 6 sono 4x la concentrazione finale desiderata).
  2. Aggiungere 5 microlitri / pozzetto della soluzione stimolazione al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
  3. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.

7. Tempra e stima di cAMP Accumulation

  1. Produzione di cAMP da parte delle cellule è misurata utilizzando il kit dinamico 2 cAMP secondo le istruzioni del produttore. In breve, ricostituire anti-cAMP-criptato e cAMP-d2 in acqua distillata. Congelare aliquote a -20 ° C per la conservazione a breve termine.
  2. Diluire un'aliquota di anti-cAMP-criptato e un'aliquota di cAMP-d2 separatamente nel tampone di lisi secondo le istruzioni del produttore per rendere soluzioni di lavoro.
  3. Lagg 10 microlitri / pozzetto della soluzione di lavoro anti-cAMP-criptato e 10 microlitri / pozzetto della soluzione di lavoro cAMP-d2 alla piastra a 384 pozzetti usando una pipetta multicanale.
  4. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Leggere la piastra in un lettore di piastre a fluorescenza (impostazione scala automatica della sensibilità), utilizzando una eccitazione di 337 nm, e misurare le emissioni a 620 nm e 665 nm per manufatti istruzioni.
  6. Applicare analisi raziometrica per valutare curva standard cAMP produce per le istruzioni. Utilizzando i valori risultanti, estrapolare l'accumulo di cAMP stima nei pozzetti utilizzando il software di analisi dei dati.

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Risultati

Parte I. Lo sviluppo di una 384 ben eterologa saggio di sensibilizzazione per l'identificazione di piccole molecole inibitrici utilizzando un modello cellulare disponibile in commercio.

Per studiare sensibilizzazione eterologa in un modello cellulare, abbiamo fatto una serie di miglioramenti che ci hanno permesso di snellire l'analisi in un formato "mix e leggere". Varie modifiche chiave sono evidenziati di seguito, e sono descritti in maggior dettaglio nel...

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Discussione

Nel tentativo di facilitare gli studi di sensibilizzazione eterologa, abbiamo ampiamente modificato il nostro metodo precedente realizzare una struttura snella "mix e leggere" formato che è modificabile a high-throughput screening e il meccanismo di esame azione. Le principali modifiche al nostro protocollo possono essere riassunti come segue: 1) l'uso di cellule crioconservate come reagenti di saggio "pronto", 2) la miniaturizzazione del dosaggio in 384 pozzetti, e 3) l'utilizzazione della m...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il signor Richard Zink e Todd Wiernicki per la formazione metodologica e di orientamento dosaggio. Ringraziamo anche Giovanni Paolo Spence un'attenta lettura e proposte editoriali. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company attraverso il Research Award Program Lilly (LRAP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CHO-K1-DRD2L celleDiscoveRx930579C2
Ham' s F12 mediaVWRSH30026fs
Siero fetale bovinoVWRSH3007003
G418SigmaA1720
IgromicinaFisher50-230-5556
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15070063
piatti da 15 cmBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
Tampone di dissociazione cellulareLife Technologies13150016
Soluzione salina tamponata con fosfatoLife Technologies10010-049
CriovialiFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
piastre a 384 pozzetti trattate con TCPerkin-Elmer6007688
Kit HTRF cAMP Dynamic 2Cisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6Software GraphPadNA
3-Isobutil-1-metilxantinaSigmaI5879
(±)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapinaSigmaC6305
AloperidoloSigmaH1512
S-(-)SulpirideSigmaS112
Lipofectamina 2000 reagente di trasfezioneInvitrogen11668019
Trypan blueLife TecnologieT10282
senza acqua, DNasi e RNasiBiomedicals821739
Ga siRNADharmaconpersonalizzato siRNA
Controllo non miratoDharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02
MP

Riferimenti

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