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Articolo metodologico

L'approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

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DOI:

10.3791/51220

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11 aprile 2014

 , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

In questo articolo

Sommario

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

Abstract

Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico fatto di DNA e proteine ​​che controlla vari processi DNA-dipendente. Struttura della cromatina e la funzione in regioni specifiche è regolato dalla arricchimento locale della istone post-traslazionale modifiche (hPTMs) e varianti, proteine ​​della cromatina vincolanti, compresi fattori di trascrizione, e la metilazione del DNA. La caratterizzazione proteomica di composizione cromatina in corrispondenza di zone funzionali distinti è stata finora ostacolata dalla mancanza di protocolli efficienti per arricchire tali domini alla purezza e quantità appropriata per la successiva analisi approfondita da spettrometria di massa (MS). Descriviamo qui una strategia proteomica cromatina di nuova concezione, denominato ChroP (cromatografia matin P roteomics), per cui un immunoprecipitazione della cromatina preparativa è utilizzato per isolare le regioni della cromatina distinte le cui caratteristiche, in termini di hPTMs, varianti e co-associati proteine ​​non istoniche, sono analizzati da MS. Illustriamo luire la creazione di ChroP per l'arricchimento e l'analisi delle regioni heterochromatic trascrizionalmente silenti, caratterizzato dalla presenza di tri-metilazione della lisina 9 su istone H3. I risultati ottenuti dimostrano il potenziale di ChroP in fondo caratterizzare il proteoma eterocromatina e dimostrare come una strategia analitica potente per comprendere come i determinanti proteici distinti di cromatina interagiscono e sinergizzare stabilire configurazioni strutturali e funzionali specifici locus.

Introduzione

Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico che è coinvolto come modello primario per tutti i processi di DNA-mediata. Il nucleosoma è l'unità ripetuta di base della cromatina e costituito da un nucleo octameric proteica contenente due molecole di ciascun istone H2A canonica, H2B, H3 e H4, attorno al quale 147 bp di DNA sono avvolte 1,2. Tutti gli istoni fondamentali sono strutturati come un dominio globulare e flessibile N-terminale "coda" che sporge al di fuori del nucleosoma. Uno dei principali meccanismi di regolazione della struttura della cromatina e la dinamica si basa su covalenti modificazioni post-traduzionali (PTM), che si verificano principalmente sulla N-terminali degli istoni 3,4. Modificazioni degli istoni possono funzionare alterando la struttura superiore ordine cromatina, cambiando contatti tra istoni-DNA o tra nucleosomi, e controllando così l'accessibilità di DNA-binding proteine ​​(meccanismi cis), o agendo come DockInSiti g di proteine ​​regolatrici, sia come unità singole o incorporati in complessi multimerici. Tali proteine ​​regolatrici possono esercitare la loro funzione in modi diversi: modulando direttamente l'espressione genica (pe proteine ​​TAF), o alterando il posizionamento nucleosoma (cioè cromatina rimodellamento complessi) o modificando altri residui istoni (ad esempio proteine ​​con metil-transferasi o acetil- attività transferasi) (meccanismi trans) 5. L'osservazione che distinto PTM modelli cluster alla specifica loci cromatina portato all'elaborazione della ipotesi che diverse modifiche al sito di distinte possono sinergizzare per generare un codice molecolare mediare lo stato funzionale del DNA sottostante. Il "codice dell'istone ipotesi" ha ottenuto grandi consensi negli anni, ma la sua verifica sperimentale è stata frenata da limiti tecnici 6,7.

Proteomica basati su spettrometria di massa (MS) è emerso come unpotente strumento per mappare i modelli modificazione degli istoni e caratterizzare-cromatina proteine ​​che legano 8. MS rileva un cambiamento come Δmass specifico tra la massa sperimentale e teorica di un peptide. A livello di singoli istoni, MS fornisce un metodo imparziale e completa per mappare PTM, consentendo l'individuazione di nuove modifiche e il loro concatenamento rivelando tra loro 9-14.

Negli ultimi anni, una serie di strategie sono state sviluppate per sezionare la composizione proteomica di cromatina, compresa la caratterizzazione della intatte cromosomi mitotici 15, l'identificazione di solubili Hptm-binding proteins 16-18 e l'isolamento e l'analisi di specifiche regioni della cromatina (ossia telomeri) 19,20. Tuttavia, l'indagine delle sinergie specifico locus tra PTM degli istoni, le varianti, e proteine ​​della cromatina associate è ancora incompleto. Qui, descriviamo un nuovo approccio, denominato ChroP (CHRO matin P roteomics) 21, che abbiamo sviluppato per caratterizzare in modo efficiente i domini di cromatina funzionalmente distinte. Questo approccio si adatta immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), un protocollo ben consolidata utilizzati nella ricerca epigenetica, per l'efficace analisi proteomica basata su MS del campione arricchito. Abbiamo sviluppato due protocolli diversi, a seconda del tipo di cromatina utilizzato come ingresso e la domanda indirizzata da MS; in particolare: 1) circuito integrato di unfixed cromatina nativa digerito con MNase è impiegato per purificare mono-nucleosomi ed a sezionare le hPTMs co-associano (N-ChroP); 2) circuito integrato di cromatina reticolato frammentata mediante sonicazione è usato in combinazione con una strategia basata intergenomica SILAC-caratterizzare tutti co-arricchimento proteine ​​(X-ChroP) vincolante cromatina. Illustriamo qui la combinazione di N-e X-ChroP per l'arricchimento e lo studio eterocromatina, utilizzando H3K9me3 come esca per i passi immunoprecipitazione. L'uso di ChroP può essere estesostudiare sia le regioni distinte su cromatina, o cambiamenti nella composizione della cromatina all'interno della stessa regione durante la transizione a uno stato funzionale diversa, aprendo così la strada a varie applicazioni in epigenetica.

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Protocollo

1. Colture Cellulari

  1. Mezzo standard per ChIP nativo
    1. Crescere cellule HeLa in modificata medio Dulbecco di Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 1% glutammina, 1% Pen / Strep e 10 mM HEPES pH 7.5.
  2. Etichettatura SILAC di reticolazione ChIP
    1. Crescere cellule HeLa in SILAC DMEM, impoverito di lisina e arginina, integrati con il 10% dializzato FBS, 1% glutammina, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7.5 e sia la luce L-lisina (Lys 0) e L- arginina (Arg 0) o loro omologhi pesanti, L-lisina (Lys 8) e L-arginina (Arg 10) (Tabella Materials), alle concentrazioni finali di 73 mg / L e 42 mg / L, rispettivamente.
    2. Crescere le cellule per un massimo di otto generazioni di SILAC medio per garantire la completa aminoacidi isotopi codificato incorporazione. Passare cellule ogni due giorni, quando raggiungono una densità di 1,0-1,5 x 10 6 cellule / ml, li semina in aconcentration di 3 x 10 5 cellule / ml.
    3. Valutare la crescita delle cellule e la vitalità in SILAC medio di individuare ogni possibile alterazione dalla fisiologia che possono derivare dalla composizione più poveri del mezzo SILAC; per fare questo:
      1. Ispezionare visivamente le cellule morfologia al microscopio ogni giorno durante l'etichettatura.
      2. Contare le celle e le curve di crescita trama di cellule che crescono in SILAC contro medie standard.

2. Native immunoprecipitazione della cromatina (N-Chip)

  1. Preparazione Nuclei di cellule in coltura
    1. Utilizzare 1-2 x 10 8 cellule senza etichetta HeLaS3 per esperimento. Celle di raccolta, rendono aliquota di 50 x 10 6 cellule in 50 ml provette e centrifugare a 340 xg per 10 min a 4 ° C, lavarli con PBS ghiacciato.
    2. Risospendere ogni pellet cellulare in 8 ml di tampone di lisi (Tabella 1) e incubare per 10 min a 4 ° C su una ruota girevole. Versare carefully ciascun lisato cellulare su un cuscino di saccarosio (Tabella 1) e centrifugare in un rotore oscillante, a 3.270 xg per 20 min a 4 ° C, per separare nuclei di citoplasma.
    3. Eliminare surnatanti, tenere pellets nucleari e lavarli due volte in PBS freddo per centrifugazione, scartare il surnatante ad ogni lavaggio.
  2. Micrococcica Nuclease (MNase) digestione (piccola scala) e controllo della qualità della cromatina dopo la digestione
    1. Risospendere il pellet nucleare lavato in 1 ml Digestion Buffer (Tabella 1); dividere in due aliquote di 500 microlitri e tenere in ghiaccio.
    2. Misurare la densità ottica (OD) a 260 nm di una aliquota, diluito 1:200 in 0,2% sodio dodecil solfato (SDS). Nota: OD = 1 corrisponde a circa 50 pg / ml di DNA cromatina. Tipicamente, partendo da 2 x 10 8 cellule, l'OD è nell'intervallo 40-60.
    3. Prendere 1% di nuclei, aggiungere MNase enzima ad una concentrazione finale di 0.005 U di enzima / ml di nuclei e incubare a 37 ° C per diversi ritardi di tempo (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. Ad ogni punto di tempo, raccogliere 4 ml di nuclei digeriti e aggiungere 1 mM EDTA per bloccare la reazione MNase. Tenere su ghiaccio.
    5. Estrarre campioni di DNA da kit di purificazione PCR e eluire in 50 microlitri TE Buffer (Tabella 1).
    6. Prelevare 20 ml di ogni campione di DNA, aggiungere 10 microlitri Loading Buffer (Tabella 1) e caricare i campioni 1% (w / v) gel di agarosio contenente bromuro di etidio, con pennarello PCR come controllo dimensioni.
    7. Controllare la digestione valutare la scala nucleosomi cromatina prodotto da MNase incubazione.
    8. Scegliere il tempo ottimale per la digestione, basato sulla diffusione della mono-nucleosomi nella preparazione. . Tipicamente per 0.005 U di enzima / ml di nuclei il momento ottimale di MNase digestione è 60 min (Figura 1B, pannello di sinistra) Nota: La MNase ottimale concentrazione / tempo di Digestion può essere regolato a seconda del tipo cellulare desiderato e dalla dimensione dei nucleosomi tratto.
  3. Large-scale/preparative MNase digestione e il recupero delle frazioni solubili cromatina
    1. Aggiungere a ciascuna aliquota (vedi 2.2.1) 5 microlitri MNase, corrispondente ad una concentrazione finale di 0,005 U di enzima / ml di nuclei; mescolare delicatamente e incubare a 37 ° C per 60 min (o in generale per l'intervallo di tempo ottimale, in base al test piccola scala).
    2. Aggiungere 1 mM EDTA per bloccare la reazione e tenere in ghiaccio. Pellet nuclei digeriti mediante centrifugazione a 7800 xga 4 ° C per 10 min. Trasferire il surnatante (frazione S1) in una nuova provetta e conservare a 4 ° C. Nota: S1 contiene la prima frazione solubile di cromatina, comprendente mono-nucleosomi. Aggiungere gli inibitori della proteasi (Tabella 1).
    3. Pellets sospendere nuovamente con cautela in 1 ml di Dialisi Buffer (Tabella 1) e Dializzare notte a 4 ° C (cut fuori del tubo di dialisi è 3,5 kDa), in 3 L Dialisi Buffer, mescolando costantemente mite. Raccogliere il materiale dializzato e centrifugare a 7800 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante (frazione S2) in una nuova provetta Eppendorf e conservare a 4 ° C. Nota: S2 comprende di-EPTA-nucleosomi, a seconda della digestione misura MNase.
  4. Controllo di qualità della cromatina prima immunoprecipitation
    1. Prelevare un 'aliquota corrispondente a 5 mg di S1 ​​e S2 frazioni cromatina (quantificato misurando la densità ottica a 260 nm in un sistema NanoDrop). Estrarre il DNA da kit di purificazione PCR ed eluire in 50 microlitri TE Buffer (Tabella 1).
    2. Prelevare 20 ml di S1 e S2 DNA, mescolare con 10 microlitri Loading Buffer (Tabella 1) e caricarli su 1% (w / v) di gel di agarosio. Controllare la qualità e l'efficienza dei MNase digestione mediante ispezione visiva della scala nucleosomi. Nota: Frazione S1 è altamentearricchito in mono-nucleosomi, mentre frazione S2 contiene principalmente poli-nucleosomi (Figura 1B, pannello di destra).
  5. L'incubazione della cromatina con anticorpi
    1. Conservare a -20 ° C 50 ml di frazione S1 per la successiva analisi spettrometria di massa.
    2. Aggiungere 1 volume di ChIP tampone di diluizione (Tabella 1) per frazione S1.
    3. Aggiungere l'anticorpo contro il Hptm (o proteine) di interesse; Incubare per una notte su una ruota girevole a 4 ° C. Nota: In genere, utilizzare 10 mg a 20 mg di anticorpo per 2 x 10 8 cellule. Il rapporto ottimale tra quantità di anticorpo e il numero di partenza cellule deve essere attentamente impostata caso per caso, a seconda della abbondanza del Hptm / proteina usata come esca all'interno del campione e sull'efficienza anticorpo. Ottimizzazione è sperimentale, sulla base delle seguenti prove:
      1. Confrontare la quantità di Hptm / proteina di interesse tra ingresso e deflusso (FT,vedi 2.7.2) mediante Western Blot o MS per verificare che il immunoprecipitazione arricchisce una parte significativa della specifica regione cromatina. Nota: Questo è generalmente ottiene quando almeno il 50% delle esche Hptm / proteina è esaurita nel FT (Figura 1C) .
      2. Verificare che la proteina di interesse immunoprecipitato è rilevabile su SDS-PAGE gel, che assicura che una quantità sufficiente di materiale è disponibile per l'analisi MS Nota:. La presenza sul gel delle bande corrispondenti alle quattro istoni base alla stechiometria corretto indica che il nucleosoma intatto è stato immunoprecipitato da N-ChroP (Figura 1D). La mancanza di una corretta stechiometria è infatti indicativa di interruzione parziale / svolgimento del nucleosoma.
    4. In parallelo, preparare le sfere magnetiche proteina G accoppiati (vedi 2.6).
  6. Equilibration e blocco di proteine ​​sfere magnetiche G-coupled
    1. Equilibrare 100 ml di proteina G-biglie magnetiche accoppiate liquami in Blocking Solution (Tabella 1), si lava tre volte e incubare durante la notte a 4 ° C su una ruota girevole. Nota: Seguendo la capacità di legame di perline, utilizzare 100 ml di slurry per 2-20 mg di anticorpo.
    2. Lavare le perline bloccate una volta con Blocking Solution e poi due volte con il circuito integrato tampone di diluizione (Tabella 1).
  7. Isolamento di cromatina utilizzando biglie magnetiche
    1. Aggiungere 100 ml di perline bloccati al campione cromatina S1 e incubare su una ruota girevole a 4 ° C per 3 ore. Centrifugare a 340 xg per 1 minuto a girare giù il campione dal coperchio delle punte. Mettere in un rack magnetico per far sedimentare le perline.
    2. Trasferire il surnatante in una nuova provetta Eppendorf. Questo è il flusso attraverso (FT), cioè la frazione di cromatina che non legano all'anticorpo.
    3. Lavare le perline quattrovolte in lavaggio Buffer (Tabella 1) l'aumento della concentrazione di sale ad ogni lavaggio (75, 125 e NaCl 175 mm).
    4. Per eluire la cromatina immunoprecipitato, incubare le perline in 30 ml di LDS Sample Buffer, integrati con ditiotreitolo 50 mm (DTT) per 5 minuti a 70 ° C. Separare le proteine ​​eluite su Bis-Tris acrilammide SDS-PAGE prefabbricati gel gradiente 4-12% e macchiare il gel con kit di colorazione Coomassie colloidale (Figura 1D).

3. Reticolazione immunoprecipitazione della cromatina (X-ChIP)

  1. La reticolazione di cellule con formaldeide
    1. Aggiungere 0,75% formaldeide alle cellule SILAC marcato, mescolare brevemente e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Estinguere la formaldeide con l'aggiunta di glicina 125 mM e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Dividere celle in 5 x 10 7 aliquote; sciacquare tre volte con PBS freddo per centrifugazione a 430xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante dopo ogni lavaggio. All'ultimo lavaggio, scartare il surnatante e mantenere il pellet. Nota: Una volta che le cellule sono reticolati, possono essere conservati a -80 ° C, se non utilizzato immediatamente.
  2. Preparazione Nuclei
    1. Risospendere ogni pellet cellulare in 10 ml di tampone di lisi (Tabella 1). Incubare per 10 minuti a 4 ° C con rotazione. Centrifugare a 430 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante; mantenere pellet nucleari.
    2. Risospendere ogni pellet nucleare in 10 ml di lavaggio Buffer (Tabella 1). Incubare a temperatura ambiente per 10 min su una ruota girevole.
    3. Centrifugare a 430 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante e raccogliere le palline.
    4. Risospendere ogni pellet nucleari in 3 ml ChIP tampone di incubazione (Tabella 1). Tenere su ghiaccio.
  3. Sonicazione della cromatina e controllo di qualità
    1. Ultrasuoni ch. romatin a 200 W (cicli di 30 sec "a" e 1 min "off"), in una Bioruptor raffreddato, a frammentare cromatina Nota: il numero di cicli e intervalli sonicazione dipende dal tipo di cellula e sulla durata media di nucleosomal allungare lo desideri. Tipicamente, 30 min di sonicazione necessari per generare frammenti di DNA di 300-500 bp in lunghezza, corrispondenti a tri-nucleosomi di-e. La scelta delle dimensioni frammenti dipende dal tipo di dominio cromatina in esame.
    2. Take 2% dell'input totale, invertire la reticolazione mediante incubazione a 65 ° C per almeno 1 ora in ChIP tampone di incubazione. Estrarre il DNA dai kit di purificazione PCR, eluire in 50 microlitri TE Buffer e caricare il DNA su gel di agarosio per verificare la cromatina frammentazione.
  4. L'incubazione della cromatina con anticorpi
    1. Aggiungere 1/10 del volume del 10% Triton X-100 di cromatina sonicato. Centrifugare a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare debris.
    2. Salvare 50 ml di ingresso cromatina dalle cellule pesanti per testare il livello di incorporazione di aminoacidi SILAC in cellule marcate e per le proteine ​​profilatura.
    3. Aggiungere l'anticorpo di scelta per il restante cromatina sonicato pesante e leggera etichettati e incubare una notte a 4 ° C sulla ruota rotante. Nel canale luce, aggiungere anche una piega eccesso del peptide solubile. Incubare per una notte a 4 ° C su una ruota girevole. Note: La condizione ottimale tra il pg di anticorpo e il materiale di partenza di cellule viene scelto caso per caso, come discusso in 2.5.3. L'ottimale piega molarità eccesso del peptide solubile rispetto alla anticorpo deve essere titolata attentamente caso per caso.
  5. Isolamento di cromatina utilizzando biglie magnetiche
    1. Equilibrare e bloccare proteine ​​sfere magnetiche G-accoppiati seguendo i passaggi descritti in 2.6 e utilizzando ChIP tampone di incubazione.
    2. Aggiungere 100 ml di blocco beads ai campioni cromatina e incubare su una ruota girevole per 3 ore a 4 ° C. Centrifugare a 340 xg per 1 minuto a girare giù il campione dal coperchio delle punte. Mettere in un rack magnetico per far sedimentare le perline. Il supernatante è il flusso attraverso (FT), contenente nucleosomi non legati. Lavare Perle quattro volte nel lavaggio Buffer (Tabella 1) con concentrazione salina crescente (due lavaggi a 150 mm e due in NaCl 300 mM).
    3. Incubare perline in 30 microlitri SDS-PAGE Loading Sample Buffer (Tabella 1) e per 25 min a 95 ° C sia a defluire e de-reticolazione delle proteine ​​immunoprecipitate. Proteine ​​separate sul 4-12% Bis-Tris acrilammide SDS-PAGE gel prefabbricati (Figura 3D).

4. Preparazione del campione Prima di MS

  1. In-Gel digestione degli istoni arricchite da N-chip
    Nota: Durante la digestione delle proteine ​​e di estrazione peptide passi prendono curaper minimizzare contaminazioni di cheratina che interferiscono con LC-MS/MS, come descritto in precedenza 22, 23.
    1. Tagliare le fette di gel corrispondente alle istoni principali bande (Figura 1D). De-macchiare i pezzi di gel con il 50% acetonitrile (ACN) in DDH 2 O, in alternanza con il 100% ACN per ridurre il gel. Ripetere fino gel pezzi sono completamente de-colorate e asciugarli in una centrifuga a vuoto.
    2. Aggiungere D 6-anidride acetica 01:09 (v / v) in 1 M di bicarbonato di ammonio (NH 4 HCO 3) (tipicamente il volume finale è 60-100 microlitri) e 3 microlitri di acetato di sodio (CH 3 COONa), come catalizzatore. Incubare per 3 ore a 37 ° C con forte agitazione Nota:. Il campione può generare bolle nei primi minuti dopo l'assemblaggio della reazione: importante maneggiare con cautela e rilasciare il gas generato, apertura di volta in volta i tubi durante l'incubazione.
    3. Sciacquare i pezzi di gel più volte with NH 4 HCO 3, alternate con ACN ad aumentare percentuale (dal 50% al 100%), al fine di eliminare completamente i residui di D anidride 6-acetico.
    4. Shrink i pezzi di gel di 100% ACN; asciugarli in una centrifuga a vuoto per garantire la completa de-idratazione. Reidratare pezzi di gel con ghiaccio-freddo 100 ng / ml soluzione di tripsina in 50mM NH 4 HCO 3 e incubare una notte a 37 ° C. Nota: La combinazione di modificazione chimica di lisine utilizzando deuterato anidride acetica e tripsina digestione genera un "Arg- C come: "in gel digestione modello di istoni 21,24.
    5. Eliminare la soluzione in eccesso e aggiungere un volume di 50 mM NH 4 HCO 3 per coprire completamente i pezzi di gel; incubare una notte a 37 ° C.
    6. Raccogliere solubili peptidi digeriti in una nuova provetta Eppendorf. Liofilizzare peptidi. Li Risospendere nello 0,5% acetico acid/0.1% di acido trifluoroacetico (TFA). Desalt e concentrarsipeptidi su fase inversa "sandwich" C 18 / carbonio e cromatografia a scambio ionico (SCX) su microcolonne fatti a mano (StageTip) 25.
    7. Preparare le microcolonne StageTip mettendo in teflon dischi reticolo contenenti immobilizzato C 18 / Carbon ("sandwich") e SCX perline in consigli di 200 microlitri. Ottenere il "sandwich" caricando il C 18 microcolonna sulla sommità di una seconda punta caricato con filtro Carbon Nota:. I peptidi molto brevi, che non trattenute sul filtro C 18, passare il flusso continuo che viene caricato direttamente sulla Carbon Tip, che li cattura in genere. StageTips SCX possono arricchire peptidi specifici, come H3 (3-8) peptide, non efficacemente trattenuto mediante cromatografia in fase inversa.
    8. Carico 50% di peptidi sulla "StageTip sandwich" C 18 / carbonio e 50% sul SCX StageTips. Li eluire dalle punte C 18 / carbonio con 80% ACN/0.5% ac aceticoid e dalle punte SCX con idrossido di ammonio 5% (NH 4 OH) / 30% di metanolo. Dopo peptidi liofilizzazione, risospendere in 0,1% FA e analizzare da LC-MS/MS.
  2. In-gel digestione delle proteine ​​immunopurified
    In-gel digestione delle proteine ​​viene effettuata come descritto in precedenza 22, con piccole modifiche.
    1. Tagliare ogni corsia in dieci sezioni (Figura 3D) e ogni fetta a cubetti di 1 mm 3. De-macchiare i pezzi di gel con il 50 NH mm 4 HCO 3/50% di etanolo e aggiungere etanolo assoluto per ridurre i gel. Ripetere l'operazione fino a quando i gel sono completamente de-colorate.
    2. Aggiungere tampone riduzione (Tabella 1) per i pezzi di gel per 1 ora a 56 ° C, seguito dall'aggiunta di tampone alchilazione (Tabella 1) per 45 min a temperatura ambiente, al buio. Lavate e asciugate i pezzi di gel in centrifuga a vuoto.
    3. Reidratare i pezzi gel con ghiaccio freddo 12.5 ng / mL tripsina solution in 50 mM NH 4 HCO 3 e incubare in ghiaccio fino a completa reidratazione dei pezzi di gel. Rimuovere tripsina in eccesso.
    4. Aggiungere 50 NH mm 4 HCO 3 a coprire completamente i pezzi di gel. Incubare una notte a 37 ° C.
    5. Raccogliere la parte liquida. Aggiungere il tampone di estrazione (Tabella 1) per i pezzi di gel; incubare con forte agitazione per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere due volte.
    6. Incubare i pezzi di gel in ACN per 10 min con una forte agitazione. Ripetere due volte e piscina tutti surnatanti.
    7. Liofilizzare i peptidi. Risospendere peptidi secchi nello 0,5% acetico acid/0.1% TFA.
    8. Desalt e concentrarsi peptidi su fase inversa C 18 StageTip, come descritto 26, 27.
    9. Eluire peptidi dalla C 18 StageTip all'80% ACN/0.5% di acido acetico. Rimuovere il solvente organico per evaporazione in una centrifuga a vuoto e risospendere le peptidi nello 0,1% FA (tipicamente 5-10 &# 181; l), quando è pronto per l'analisi MS.

5. LC-MS Analysis

  1. Cromatografia liquida
    1. Riempire la colonna analitica in 15 centimetri fusa emettitore silice (75 micron di diametro interno, diametro esterno 350 micron), con fase inversa (RP) C 18, 3 micron resina in metanolo, ad una pressione costante di elio (50 bar) utilizzando un Dispositivo bomba-loader, come descritto in precedenza 28.
    2. Coppia emettitore imballato (C 18 RP colonna) direttamente all'uscita della valvola a 6 porte della HPLC attraverso una (25 micron di diametro interno) 20-cm lungo silice fusa senza utilizzare precolonna o un dispositivo di divisione.
    3. Caricare i peptidi digeriti in C 18 RP colonna al flusso di 500 nl / min fase mobile A (0,1% FA / 5% ACN, in DDH 2 O).
    4. Dopo il caricamento del campione, separare i peptidi utilizzando i seguenti gradienti:
      1. Applicare 0-40% fase mobile B (0,1% FA/99% ACNin DDH 2 O) a 250 Nl / min oltre 90 min seguito da un gradiente di 40-60% in 10 min e 60-80% in 5 min, per eluizione dei peptidi derivanti da istoni (vedi 2).
      2. Applicare 0-36% fase mobile B a 250 Nl / min, con oltre 120 min seguita da una pendenza del 36-60% in 10 minuti e il 60-80% più di 5 min, per l'eluizione dei peptidi derivanti da proteine ​​immunopurified (cfr. 3).
  2. Analisi di spettrometria di massa utilizzando LTQ-FT-ICR-Ultra spettrometro di massa
    1. Operare in una acquisizione dati dipendente mode (DDA) di passare automaticamente tra gli Stati membri e l'acquisizione MSMS. MS spettri a scansione totale sono acquisiti, tipicamente nel range m / z da 200-1,650, si acquisisce con risoluzione R = 100.000 a 400 m / z. I cinque (Top5) ioni più intensi sono isolati per frammentazione nella trappola ionica lineare utilizzando una dissociazione indotta da collisione (CID) a un valore target di 5.000.
    2. Utilizzare i parametri elencati nella Tabella 2 for il file di acquisizione "Sintonia".
    3. Configurare le impostazioni di acquisizione standard elencate nella Tabella 2.

6. Analisi dei dati

  1. Etichettare libero quantificazione delle modificazioni degli istoni co-arricchiti in domini di cromatina
    1. Convertire i file raw acquisiti in file MGF utilizzando il software Raw2msm (versione 1.10) 29.
    2. Cerca le modificazioni degli istoni con Mascot Deamon (versione 2.2.2), impostando i parametri descritti nella tabella 3.
    3. Sulla lista peptide uscita Mascotte, rimuovere i peptidi con punteggio inferiore a 15 o con più di 5 PTMs putativi 29. Nota: Per ogni singolo ID peptide, selezionare il peptide con il punteggio più alto e mascotte filtrare tutti gli altri peptidi ridondanti con lo stesso ID .
    4. Costruire i cromatogrammi ionici estratti (XIC) per ogni precursore corrispondente ad ogni peptidi modificati, based il valore m / z, usando l'QualBrowser. Calcolare l'area sotto la curva (AUC) per ciascun picco (Figura 2A).
    5. Convalida ciascuno peptidi individuati contenenti modifiche di ispezione visiva degli spettri MS / MS utilizzando la QualBrowser (Figura 2B).
    6. Calcolare l'abbondanza relativa di ogni peptide modificato. Calcolare il relativo arricchimento di ogni cambiamento nel materiale ChIP-Ndr:. Abbondanza relativa viene calcolato come rapporto tra l'AUC di ciascun peptide modificato specifico sulla somma di AUC di tutte le forme modificate e non modificate del peptide stesso, mentre relativa arricchimento come rapporto tra l'abbondanza relativa della modifica specifica nel chip sull'ingresso (Figura 2C).
  2. Quantitativa analisi proteomica delle proteine ​​co-associati all'interno dei domini di cromatina
    1. Per le proteine ​​identificazione e la quantificazione utilizzano il pacchetto MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configurare il motore di ricerca integrato "Andromeda" con il AndromedaConfig.exe 31 e impostare i parametri di ricerca elencati nella Tabella 3.
  3. Test Incorporation
    1. Stimare il grado di incorporazione di amminoacidi nelle proteine ​​pesanti in ingresso cromatina pesante marcato, utilizzando software MaxQuant, come segue:
      1. Impostare i parametri come descritto in 6.2, ma disabilitando l'opzione re-quantificare.
      2. Calcolare la percentuale di incorporazione applicando la seguente formula per rapporti di peptidi non ridondanti:. Incorporation (%) = rapporto (H / L) / Rapporto (H / L) + 1 × 100 (Figura 3B) Nota: Accetta solo se incorporazione> 95 %.

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Risultati

Cromatina immunoprecipitazione è una potente tecnica utilizzata per profilare la localizzazione di una proteina o una modificazione degli istoni lungo il genoma. In un equivalente di proteomica, ChIP è seguito da proteomica basati su MS per identificare qualitativamente e quantitativamente le hPTMs, varianti istoniche e proteine ​​della cromatina vincolanti che sono immunoprecipitati con la modifica o la proteina di interesse, utilizzati come "esca". Nell'approccio N-ChroP, illustrato in Figura 1A,...

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Discussione

Abbiamo recentemente descritto ChroP, una strategia quantitativa per la caratterizzazione su larga scala dei componenti proteici della cromatina. ChroP combina due approcci complementari utilizzati in campo epigenetico, Chip e MS, approfittando loro punti di forza e superando i rispettivi limiti. ChIP accoppiato al sequenziamento profondo (ChIP-Seq) consente la mappatura genoma di modificazioni degli istoni alla risoluzione di alcune nucleosomi 35. Pur vantaggiosa per la loro sensibilità, saggi basati su anti...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Mol Proteomica cellulari. Soldi M. Bonaldi T. La Proteomica Indagine della cromatina domini funzionali rivela Nuove sinergie tra distinte Eterocromatina Componenti MCP. 2013; 12: 64-80. © Società Americana per la Biochimica e Biologia Molecolare. Ringraziamo Roberta Noberini (Istituto Italiano di Tecnologia e IEO, Italia) per la lettura critica del manoscritto. Lavoro TB è sostenuto da finanziamenti della Fondazione Armenise-Harvard Career Development Program Giovanni, l'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro e il Ministero della Salute italiano. Lavoro MS è stato sostenuto da una borsa di studio FIRC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dializzato FBSInvitrogen26400-044
Lisina 0 (12C6 14N2 L-lisina)Sigma AldrichL8662
Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)Sigma AldrichA6969
Lisina 8 (13C6 15N2 L-lisina)Sigma Aldrich68041
Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)Sigma Aldrich608033
Micrococcal Nuclease Roche10 107 921 001
Compresse da cocktail complete di inibitori della proteasi senza EDTA Roche04 693 132 001
Tubo per dialisi Spectra/Por 3, 3,5K MWCO, larghezza piatta 18 mm, lunghezza50 piediSpectrumlabs132720
Kit di purificazione PCR QIAquickQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-metilato K9-ChIP gradoAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-metil K9 Abcamab1773
Dynabeads proteina GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                                                      Bis-Tris Gel KitInvitrogen NP0335BOX
InvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anidride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Acido formicoSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetammide ≥ 99% (HPLC), cristallinoSigma AldrichI6125
DL-DitiotreitoloSigma Aldrich43815
Tripsina modificata di grado di sequenziamento, congelata 100 μ g (5 &volte; 20 μ g)PromegaV5113
Nanospray OD 360μ m x ID 75μ m, punte ID 8 μ m non rivestito Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µ m    15% C Dr. Maisch GmbHr13.aq.
Disco di estrazione del carbonio, 47 mmAgilent Technologies12145040
Disco di estrazione del cationeAgilent Technologies66889-U
di colorazione blu colloidale

Riferimenti

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