High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

Sommario

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

Abstract

Virus a RNA sono responsabili di gravi malattie umane come l'influenza, bronchite, dengue, epatite C o il morbillo. Essi rappresentano anche una minaccia emergente a causa di un aumento degli scambi mondiali e le popolazioni umane che penetrano sempre più ecosistemi naturali. Un buon esempio di tale situazione emergente è epidemie di virus chikungunya del 2005-2006 nell'Oceano Indiano. I recenti progressi nella nostra comprensione delle vie cellulari che controllano la replicazione virale suggeriscono che i composti di targeting funzioni della cellula ospite, piuttosto che il virus stesso, potrebbe inibire un grande pannello di virus a RNA. Alcuni composti antivirali ad ampio spettro sono stati identificati con ospite analisi mirate. Tuttavia, misurando l'inibizione della replicazione virale in colture cellulari con riduzione degli effetti citopatici come visualizzatore ancora rappresenta una strategia di screening fondamentale. Tali schermi funzionali sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus ricombinanti che esprimono giornalista enzimi capable della bioluminescenza come la luciferasi. Nella presente relazione, abbiamo dettaglio un gasdotto high-throughput screening, che combina il morbillo ricombinanti e virus chikungunya, con saggi di vitalità cellulare, per identificare i composti con un profilo antivirale ad ampio spettro.

Introduzione

Virus a RNA sono responsabili di una grande varietà di infezioni umane, e hanno un enorme impatto sulle popolazioni di tutto il mondo, sia in termini di salute pubblica e di costo economico. Vaccini efficaci sono stati sviluppati contro diversi virus a RNA umano, e sono ampiamente utilizzati come trattamenti profilattici. Tuttavia, vi è ancora una mancanza critica di farmaci terapeutici contro infezioni da virus RNA. Infatti, i vaccini non sono disponibili efficaci contro i principali agenti patogeni umani, come il virus della dengue, il virus dell'epatite C o da virus sinciziale respiratorio umano (HRSV). Inoltre, i virus a RNA sono responsabili per la maggior p....

Protocollo

1. Preparazione di 96 pozzetti Piastre figlia con composti

1. Spostare piastre madri a 96 pozzetti contenenti 10 mM soluzioni madre di composti chimici in DMSO da -20 ° C a temperatura ambiente. Diluire composti 5x in DMSO per ottenere piastre di diluizione a 96 pozzetti intermedi a 2 mm. Diluizione si ottiene pipettando 5 ml in 20 ml di DMSO e miscelazione.
2. Dispensare 1 ml di piastre di diluizione nei pozzetti secchi di bianco, coltura tissutale con codice a barre piastre da 96 pozzetti. Questa prima serie di piastre figlia (D1) viene utilizzato per valutare la tossicità dei composti ad una concentrazione finale di 20 mM. Piastre figlia Conservare ....

Risultati

Questo gasdotto di screening si basa in primo luogo sulla selezione dei composti che inibiscono la replicazione MV e non mostra alcuna tossicità cellulare significativa (Figura 1, schermo primario). Sfrutta saggi basati luciferasi per determinare la tossicità cellulare e l'inibizione della replicazione virale. Tutte le fasi di pipettamento e acquisizione dati può essere eseguita in un ambiente ad alta produttività con una piattaforma robotica.

Tossicità cellulare dei com.......

Discussione

La pipeline di screening qui descritto mira a selezionare i composti con un profilo adatto come inibitori ampio spettro di virus a RNA. Quando una libreria di 10.000 composti è stato proiettato con questo protocollo e sono stati applicati criteri di filtraggio di cui sopra, cioè l'inibizione della replicazione MV superiore al 75%, 40 composti (0,4%) ha ottenuto positive. Inoltre, circa la metà di loro ha mostrato una certa tossicità nel saggio di redditività basati luciferasi, e sono state disattese per que.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piattaforma Freedom EVO	Piattaforma robotica	TECAN
Micropiastre per colture cellulari in polistirene a 96 pozzetti, bianche	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare luminescente	Promega	G7570	Saggio di vitalità basato sulla luciferasi
Bright-Glo Sistema di saggio della luciferasi	Promega	E2610	Reagente contenente luciferasi di lucciola substrato
Renilla-Glo luciferasi Sistema di dosaggio	Promega	E2710	Reagente contenente Renilla luciferasi substrato
Britelite più Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagente contenente lucciola luciferasi. Può essere utilizzato in alternativa al reagente Brigh-Glo per determinare l'attività della luciferasi.