Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.
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Articolo metodologico
Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun
In questo articolo
Sommario
Abstract
Al fine di indirizzare una singola proteina a più organelli subcellulari, piante tipicamente duplicare i geni rilevanti, ed esprimono ogni gene separatamente utilizzando complesse strategie di regolamentazione, tra cui promotori differenziali e / o sequenze di segnali. Ingegneri metaboliche e biologi sintetici interessato a colpire enzimi per un particolare organello trovano ad affrontare una sfida: per una proteina che è da localizzare a più di un organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte. Si presenta una soluzione a questa strategia: sfruttando splicing alternativo dell'mRNA. Questa tecnologia sfrutta cloroplasto stabilito e dei perossisomi mira sequenze e li combina in un unico mRNA che viene alternativamente impiombata. Alcune varianti di splicing vengono inviati al cloroplasto, alcuni al perossisoma, e alcuni al citosol. Qui il sistema è progettato per multipli organello targeting con splicing alternativo. In questo lavoro, GFP si aspettava di essere espressed nei cloroplasti, citosol, e perossisomi da una serie di razionalmente progettati 5 'tag mRNA. Questi tag hanno il potenziale per ridurre la quantità di clonazione necessaria quando i geni eterologhi devono essere espressi in più organelli subcellulari. I costrutti sono stati progettati in opera precedente 11, e sono stati clonati usando Gibson assembly, un metodo di clonazione indipendente legatura che non richiede enzimi di restrizione. I plasmidi risultanti sono stati introdotti in Nicotiana benthamiana celle foglia epidermica con un protocollo Gene Gun modificato. Infine, foglie trasformate sono state osservate con microscopia confocale.
Introduzione
Questo lavoro è un progetto di ingegneria / biologia sintetica metabolica in cui le cellule vegetali sono progettati per esprimere una proteina reporter in diversi organelli ma solo con un singolo costrutto di DNA.
Un approccio per proteine bersaglio a più di una posizione comporta clonazione più copie genetiche, ciascuna contenente un diverso peptide localizzazione. Ogni copia deve essere introdotto da successive ritrasformazione, o, in alternativa, da backcrossing singole trasformazioni 1. Ciò comporta la clonazione supplementare, ed è limitata da un tag di localizzazione per ogni terminale.
Un ....
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Protocollo
1. Progettazione di sequenze alternativa-splicing per multipla Organelle Targeting
- Determinare i siti per l'espressione finale di proteine. Per questo lavoro, l'interesse è in mira la cloroplasti, perossisomi, e citosol.
- Utilizzare la letteratura per identificare proteine e DNA sequenze note di indirizzare le proteine per organelli di interesse. In questo caso un cloroplasto di targeting sequenza di Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferasi 6,15, e un perossisomi mira sequenza di Arabidopsis thaliana transthyretin come S-allantoina sintasi 16,17 sono stati determinati....
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Risultati
Lo sforzo progettuale è stato il risultato di una pianificazione significativa. Novel di questo progetto è l'uso di splicing alternativo per creare un pre-mRNA che viene tradotto in proteine differenzialmente espressi. Queste proteine sono espresse in diversi organelli, in questo caso il cloroplasti, perossisomi e / o citosol. Abbiamo adattato gene Arabidopsis naturale che viene alternativamente impiombato 6, e collocato conosciuti cloroplasto 6 e perossisomi 17 mira seq.......
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Discussione
In questo studio, strategie semplici sono descritti per la localizzazione di una singola proteina transgenica a più compartimenti cellulari nelle piante. L'obiettivo era di progettare costrutto che esprimesse un singolo gene in più di un organello in Nicotiana benthamiana. Le strategie includono progettazione razionale di base di GFP-costrutti di DNA, il montaggio Gibson, la consegna dei plasmidi a celle foglia con il Gene Gun, e l'osservazione dei risultati con microscopia confocale.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Jen Sheen del Massachusetts General Hospital per la generosa donazione di piantine di Nicotiana benthamiana. Jen Bush ci ha aiutato molto nella consulenza in coltivazione di piante e la creazione di una zona di camera di crescita. Tom Ferrante dell'Istituto Wyss offerto aiuto cruciale con microscopia confocale. Gli autori desiderano soprattutto ringraziare Don Ingber del Children Hospital di Boston e l'Istituto Wyss per la generosa donazione di una pistola Gene e relative forniture. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito attraverso un accordo di cooperazione con il Dipartimento dell'Energia Advanced....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Primer per oligonucleotidi | IDT | (personalizzato) | Design specifico per il costrutto |
| GeneBlocks | IDT | (personalizzato) | 500 bp oligonucleotidi |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Utilizzato per purificare i prodotti PCR |
| Kit QIAprep spin miniprep | Qiagen | 27104 | Utilizzato per preparare quantità adeguate al clonaggio di plasmidi |
| Phusion Master Mix con tampone GC NEB | M0532S | Utilizzato per amplificare con PCR il gene di interesse Miscela di | |
| reazione di assemblaggio Gibson | NEB | E2611L | Master mix dei seguenti 9 ingredienti |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Miscela di assemblaggio Gibson |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Miscela di montaggio Gibson |
| Miscela dNTP | Fermentas | R0192 | Miscela di assemblaggio Gibson |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Miscela di assemblaggio Gibson |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Miscela di assemblaggio Gibson |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Miscela di assemblaggio Gibson |
| Esonucleasi T5 | Epicentro | T5E4111K | Miscela di assemblaggio Gibson |
| Phusion polimerasi | NEB | F530S | Miscela di assemblaggio Gibson |
| Taq DNA ligasi | NEB | M0208L | Miscela di assemblaggio Gibson |
| Gibthon.org | Sito web per semplificare i calcoli | ||
| Plasmide PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Utilizzato per preparare il DNA per i proiettili della pistola genetica Sistema |
| pistola genetica | BioRad | 165-2451 | Include tutte le parti necessarie |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Dono di Jen Sheen, MGH |
| Microscopio confocale | Leica | SP5 X MP | Imaging delle cellule risultanti |
| Vetrini a pozzetti profondi Microscopia | elettronica | Scienze 71561-01 | Utilizzato per l'imaging confocale |
| Un editor di plasmidi (ApE) | Università dello Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Calcolatore | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Riferimenti
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A.
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Ristampe e permessi
