Vi presentiamo un test di scelta per rivelare l'influenza di odoranti sul comportamento Drosophila utilizzando un test Y-labirinto.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Rilevare i segnali dall'ambiente è essenziale per gli animali per garantire la loro sopravvivenza. A questo scopo, usano stimoli ambientali come la visione, mechanoreception, l'udito, e chemoperception attraverso il gusto, attraverso il contatto diretto o attraverso l'olfatto, che rappresenta la risposta ad una molecola instabile che agisce a lungo raggio. Molecole chimiche volatili sono segnali molto importanti per la maggior parte degli animali nella rilevazione di pericolo, una fonte di cibo, o per comunicare tra gli individui. Drosophila melanogaster è uno dei modelli biologici più comuni per gli scienziati di esplorare le basi cellulari e molecolari di olfatto. Al fine di evidenziare le capacità olfattive di questo piccolo insetto, descriviamo un protocollo scelta modificato in base al test Y-maze usato classico con i topi. I dati ottenuti con Y-labirinti forniscono informazioni preziose per comprendere meglio come gli animali che fare con il loro ambiente in perenne mutazione. Introduciamo un protocollo passo-passo per studiare laimpatto della odoranti sul fly risposta esplorativo da questo test Y-labirinto.
Introduzione
Chemoreception attraverso il gusto e l'olfatto è una modalità sensoriale fondamentale per la sopravvivenza degli animali. Dà segnali vitali necessarie per la rivelazione di un pericolo o fonti di cibo, così come per le interazioni sociali. Essa aiuta anche gli animali di trovare un partner sessuale necessaria per la loro riproduzione. Per più di 20 anni, un'intensa attività di ricerca, comprese Nobel vincitore del premio opera di Richard Axel e Linda Buck nel 2004 "per le loro scoperte di recettori olfattivi e l'organizzazione del sistema olfattivo", è stata effettuata per rivelare le basi molecolari e cellulari della olfatto 1,2.
Uno dei modelli animali preferiti per gli scienziati per analizzare la percezione olfattiva è D. melanogaster. Questo insetto condivide una strategia simile odore di codifica cellulari e molecolari con i mammiferi. La comunità scientifica utilizza diversi paradigmi comportamentali per studiare il ruolo di odoranti in questa mosca della frutta. Questi test includono test multimodali come courtshitest p dove le varie modalità sensoriali, tra cui l'olfatto, sono importanti per suscitare corteggiamento maschile 3. Altri saggi sono stati sviluppati anche per affrontare il ruolo di odoranti più specificamente; questi includono T-labirinti, Y-labirinti, saggi trappola, arene quattro campo e wind-tunnel 4,5,6,7,8.
In questo articolo vi presentiamo un semplice modificata test Y-labirinto, che fornisce risposte olfattive robuste con D. melanogaster. Il nostro set-up usi finali suggerimenti in contrasto con un metodo descritto in precedenza 9. Così, la nostra Y-labirinto ha due vantaggi. In primo luogo, evita qualsiasi ritorno nel sistema una volta la mosca ha fatto la sua scelta. In secondo luogo, essa limita lo scambio di odoranti in tutte le aree del Y-labirinto. Quest'ultimo vantaggio è importante poiché Drosophila sono molto sensibili al flusso d'aria che viene spesso utilizzato per evitare la saturazione odorizzante. Per regolare il set-up sperimentale con un flusso d'aria sarebbe tempo e costo consumo. Pertanto, il nostro test Y-labirinto rappresenta un efciente e veloce per testare le prestazioni olfattiva di Drosophila.
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Protocollo
1. Prima di iniziare
- Utilizzare un archivio di riferimento isogenized cuscinetto fenotipi comportamentali stabili e robusti. Non esiste una regola generale per la scelta di questa azione, dal momento che tutti i controlli possibili possono portare sfondo eterogenei alleli.
- Utilizzare questo ceppo di controllo per backcross ogni altra azione necessaria per le fasi successive. Questo passo backcrossing è tipicamente rappresentato da almeno cinque croci successivi di una singola femmina vergine (per permettere possibile crossing-over tra cromosomi omologhi) per 2-3 isogeni maschi di riferimento 5. Questo passo è importante per omogeneizzare il background genetico tra le diverse popolazioni della mosca.
- Mantenere scorte Drosophila su una farina di mais normale (9%), lievito (10%), e agar (1,5%) integrato con antibiotico (0,4% di metile para-idrossi-benzoato) in un ciclo luce / buio di 12 ore a 25 ° C.
- Raggiungere esperimenti chemiosensoriali in una stanza a temperatura controllata (25 ° C) sotto la luce rosso lontano(Per eliminare il contributo dei riferimenti visivi, e di concentrarsi sui segnali chemosensoriali). Rinnovare regolarmente l'aria della camera di ventilare l'area tra ogni esperimento.
2. Risposta olfattiva utilizzando un test Y-maze
- Morire di fame in linea per 16-18 ore a 25 ° C in tubi di vetro contenenti carta asciugamano bagnato prima del test.
- Partecipa a un connettore a forma di Y a due fiale di vetro e una fiala di plastica più piccolo (carico flaconcino). Utilizzare 1 ml punte di pipetta che passano attraverso i tappi di schiuma per collegare il connettore al tre fiale, e avere un Y-labirinto ermeticamente chiusi. Tagliate le estremità strette di due punte per pipette (~ 2 mm di diametro, per evitare qualsiasi ritorno della mosca una volta che ha preso la sua decisione) per formare due fiale "trappola", e un grande fine di un puntale per formare il "loading" tubo (Figura 1A).
- Appena prima di collegare i flaconi "trappola" (Figura 1B), mettere un ~ 6 millimetri carta filtro diametroogni flacone. Aggiungere 40 ml di soluzione di odorizzante su una carta da filtro, e 40 ml di solvente corrispondente sulla seconda carta da filtro.
- Introdurre dieci 4-9 linea di un giorno nel flaconcino "loading". Non utilizzare CO 2 anestesia durante questo trasferimento, poiché ha un forte effetto sul comportamento 10. Piuttosto usare breve raffreddamento sul ghiaccio. Manipolazione corretta di mosche anestetizzati è importante limitare lo stress sugli argomenti più possibile.
- Eseguire una serie di test Y-maze a 25 ° C sotto luce rosso lontano (utilizzando lampadine a LED per limitare possibile fonte di riscaldamento) per evitare stimoli visivi per quanto possibile. Prestare attenzione ad alternare gli orientamenti delle Y-labirinti (odorizzante contenente tubo sulla sinistra o sulla destra, e il tubo di carico nella parte anteriore o sul retro; la figura 1C).
- Consentire diverse ore per le mosche di entrare nel flaconcino trappola contenente l'odorizzante o il solvente. Conte vola dopo 24 ore di aumentare la participativia fino a più di 80% e fornire il valore di indice olfattivo massimo (Simonnet, comunicazione personale).
- Calcolare l'indice olfattivo risultante utilizzando la seguente formula: (numero nel tubo odore - Codice nel tubo solvente) / numero totale di mosche caricati.
- Wash Y-maze set-up come segue: immergere la smontato set-up in RBS 35 MD durante la notte. Sciacquare accuratamente con acqua del rubinetto. Infine sciacquare con acqua deionizzata e lasciare asciugare.
3. Analisi statistica dei dati
- Eseguire un t-test, un one-way ANOVA o una ANOVA a due vie a seconda dei dati e variabili.
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Risultati
Figura 1D mostra due risposte di rappresentanza di questo test Y-labirinto. Maschi Canton-S evitare fortemente 10% di acido acetico diluito in acqua distillata, mentre non evitano significativamente il 10% di acido fenilacetico. Questi test sono basati su 10 maschi per replica messi insieme nelle fiale di carico. Questo protocollo volte può portare a un notevole errore standard della media. Se necessario, è possibile ridurre questo inconveniente utilizzando 20 maschi per replicati anziché soltanto 10. M...
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Discussione
Il nostro protocollo Y-labirinto è basato su un protocollo precedentemente descritto 9. Tuttavia, introduciamo due importanti differenze. In primo luogo, usiamo puntali delle pipette strette per evitare che le mosche di tornare una volta che decidono di entrare nel flaconcino contenente il solvente o il solvente più l'odorizzante. Questi suggerimenti strette sono utili anche per limitare la diffusione odorizzante in Y-labirinto. In secondo luogo, usiamo un carico flacone più piccolo per costringere le mos...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo 4 utenti anonimi per il loro lavoro per migliorare il manoscritto. Ringraziamo il Centre National de la Recherche Scientifique per il suo sostegno finanziario alle MBG e YG, e l'Université de Bourgogne e il Ministero della Ricerca francese MMS. La ricerca in laboratorio YG è finanziato dal Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting Grant, GliSFCo-311.403), l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), il Conseil Régional de Bourgogne (Faber), e il CNRS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Drosophila Tubo in polistirene | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm labirinto |
| Y Drosophila Tubo borosilicato | Digione verre | 95 X 25 mm labirinto | |
| a Y Tappo in schiuma | Dutscher | 999038 | labirinto a Y |
| Connettore a forma di Y | Europrix | 11020605 | labirinto a Y |
| 100-1.000 &; l. puntali per pipette | Corning | 4868 | Unire i seguenti puntali per pipette al connettore a forma di Y. Tagliare 2 puntali per pipette a 65 mm dall'estremità larga e collegare l'estremità stretta (con un ∼ 2 mm di apertura) a 2 fiale di test. Queste aperture limiteranno le inversioni a U una volta che le mosche entreranno nei tubi contenenti gli odori. Tagliare 1 punta della pipetta a 35 mm dall'estremità larga e collegarla alla fiala di caricamento. Y-maze |
| Far-Red LED Lampadina | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acido acetico | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Acido fenilacetico | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Lievito | Sensient Aromi Strasburgo | 1018880464 | |
| Farina | di maiseurogerm | Farine de maï s | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Metil idrossi 4 benzoato | VWR international | 25605293 |
Riferimenti
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. The smell of love in Drosophila. Front. Physiol. 4, (2013).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
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