La stampa Sommerso di celle su una superficie modificata utilizzando un flusso di Microspotter continua

Summary

Questa tecnologia di stampa microfluidica 3D stampa array di cellule su superfici sommerse. Descriviamo come gli array di cellule vengono erogati microfluidicamente in celle a flusso 3D su superfici sommerse. Stampando su superfici sommerse, sono stati prodotti microarray cellulari che consentono lo screening dei farmaci e la valutazione della citotossicità in una moltitudine di aree.

Abstract

La stampa di cellule per applicazioni di microarray presenta sfide significative, tra cui il problema di mantenere un fenotipo cellulare fisiologicamente rilevante dopo la stampa, una scarsa organizzazione e distribuzione delle cellule desiderate e l'incapacità di fornire farmaci e/o nutrienti ad aree mirate nell'array. La nostra tecnologia di stampa microfluidica 3D è in grado di sigillare e stampare array di celle su superfici sommerse in modo automatizzato e multiplexato. Il design della fluidica 3D MFCA (Microfluidic Cell Array) consente di abbassare la punta della testina di stampa in un pozzetto o in un piatto riempito di liquido e di comprimerla contro una superficie per formare una guarnizione. La punta in silicone morbido della testina di stampa si comporta come una guarnizione ed è in grado di formare una tenuta reversibile applicando pressione o allontanandosi. Altre tecnologie di stampa a celle, come le stampanti a spillo o a getto d'inchiostro, non sono in grado di stampare in applicazioni sommerse. La stampa su superficie sommersa è essenziale per mantenere i fenotipi delle cellule e per monitorare queste cellule su una superficie senza disturbare le caratteristiche della superficie del materiale. Stampando su superfici sommerse, vengono prodotti microarray cellulari che consentono lo screening dei farmaci e la valutazione della citotossicità in una moltitudine di aree, tra cui cancro, diabete, infiammazione, infezioni e malattie cardiovascolari.

Introduction

I recenti progressi nel settore farmaceutico hanno portato ad un crescente interesse nell'utilizzo di microarray cellulari nel processo di scoperta della droga per lo screening di farmaci e analisi cytotoxicological ^1,2,3. Lo sviluppo di test in vitro in high-throughput e metodi di screening utilizzando microarrays di cellule faciliterebbe lo sviluppo rapido ed efficace di farmaci candidati, così come anticipo la comprensione fondamentale della cella ^1,4. L'approccio tradizionale allo screening con celle utilizza piattaforme e piastre convenzionali; tuttavia questo approccio è limitata a causa del costo elevato, produttività limitata, e la limitata capacità di informazioni quantitative sulla funzione delle cellule ^1,5. A causa di queste limitazioni, la ricerca nel campo delle tecnologie di microarray cellulare è fiorente per la caratterizzazione molecolare biologica, ingegneria dei tessuti, e la droga lo screening ^1,6. I vantaggi di microarrays cellulari includono l'uso campione più piccolo, effetti minimi difenotipo cellulare eterogeneità mascheratura informazioni, e soprattutto la capacità di automatizzare saggi per più applicazioni high-throughput ^1,7,8.

L'industria farmaceutica utilizza attualmente high-throughput cell-based test di screening con colture monostrato di cellule 2D per lo screening di stupefacenti in pozzetti microtiter ^9. Cellule multiplexing in pozzetti di piastre microtiter offre la possibilità di throughput più elevato con opzioni di sperimentazione uniche. Inoltre, le attuali tecnologie di microarray cellulari permettono alle cellule di asciugare in grado di modificare radicalmente il fenotipo delle cellule in vivo ^10,11. Per superare questi problemi, la MFCA è stata progettata ed è mostrato in Figura 1. Il disegno dei fluidica MFCA 3D consente la punta della testina di stampa di figura 1 per essere abbassato in un bagno e compresso contro una superficie per formare un sigillo. La punta morbido silicone della testina di stampa si comporta come unguarnizione e forma una guarnizione reversibile. La tecnologia MFCA è in modo unico adatta per interfacciarsi con superfici sommerse, che è richiesto per entrambe le colture cellulari e sistemi fetta dei tessuti, ed è difficile o impossibile con la maggior parte degli altri approcci. Pins o stampa ink-jet non funzionano, e dispositivi microfluidici 2D non sono adatti per la deposizione o l'interfacciamento con grandi array di punti discreti. Inoltre, da miniaturizzazione e localizzare l'esperimento - il microarray cellulare - il MFCA supera i principali problemi connessi con high-throughput a base di cellule test di screening.

Il CFM utilizza le reti di canali 3D per ciclo di piccoli campioni di fluido del volume oltre riprese piatte microscopici su una superficie di ^12,13. Mediante stampa con flusso, biomolecole, cellule e altri reagenti sono mantenuti in un ambiente liquido durante il processo di stampa, consentendo la stampa di biomolecole e cellule sensibili senza esposizione all'aria, che ostacola le tecniche di stampa cella corrente. E 'anche possibile stampare direttamente da materiale grezzo come ibridoma o surnatanti forniti vi è un meccanismo di cattura sulla superficie dell'array. L'obiettivo di questo manoscritto è spiegare in dettaglio la stampa sommersa di due tipi di cellule su una superficie.

Protocol

1. Cella Cultura Preparazione

1. Conservare le scorte di cellule NIH/3T3 in azoto liquido fino al momento dell'uso.
2. Preparare completa supporti per cellule NIH/3T3 utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 10 mM tampone HEPES, 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina.
3. Scongelare cellule per 2-3 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C.
4. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzo completo e centrifugare a 1500 xg per 3 min.
5. Rimuovere il surnatante cellulare senza disturbare il pellet.
6. Risospendere le cellule in 5 ml di media e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
   1. Rimuovere 10 ml di sospensione cellulare e posto in una provetta da 0,5 ml.
   2. Aggiungere 10 ml di Trypan Blue alla sospensione cellulare e mescolare con la punta della pipetta.
   3. Pipettare 10 ml di cellule colorate in una camera emocitometro.
   4. Contare le celle in emocitometro a 10xingrandimento.
      1. Contare le cellule vive (piccole palline bianche) per 4 dei 9 grandi piazze. Contare solo le cellule vive che non appaiono blu scuro dalla macchia Trypan Blue.
      2. Calcolare il numero medio di cellule per piazzale, causando il numero di cellule x 10 ⁴ cellule / ml nel cellule sospensione originale.
      3. Alveoli ad una densità di 1 x 10 ⁵ cellule / ml con un totale di 5 ml in ciascuna beuta T25.
   5. Cellule di coltura tra il 70% e l'80% di confluenza prima degli esperimenti di inizio. Aggiorna i media ogni 2-3 giorni o secondo necessità.

2. Stampa Preparazione della superficie

1. Mark un rettangolo con pennarello sul fondo di una cultura trattati tessuto polistirene (TCTPS) 12 pozzetti la dimensione della testina di stampa (7 mm x 19 mm).
2. Pipettare 50 microlitri di siero fetale bovino in area rettangolare e diffonderla sull'intera regione con la punta.
3. Lasciare la piastra di Petriin una sterile biosicurezza cappuccio O / N per consentire al posto del siero si asciughi completamente. Queste piastre devono essere preparati non più di due giorni prima dell'uso.

3. Stampa sommerso

1. Lavare la testina di stampa con acqua distillata.
   1. Riempire una capsula di Petri 60 mm Con acqua distillata e ancorare la testina di stampa sulla superficie.
   2. Fluire acqua distillata attraverso ciascuna delle linee per 2 min a 150 ml / min usando una pompa pneumatica.
   3. Eliminare l'acqua dalla piastra di Petri e riempirlo con acqua pulita.
   4. Spostare la testina di stampa su e giù in acqua 3 volte.
2. Ancorare il centro della testa di stampa sul posto siero rivestite in 12 piastra ben pre-preparati.
3. Prime la testina di stampa con i media completi pre-riscaldato, 300 ml per canale.
4. Stampa cellule sospeso ad una concentrazione di 50.000 cellule / ml sulla superficie e 60 microlitri / min, 100 microlitri per canale.
5. Posizionare la testina di stampa, a sinistra ancorata contro ilsuperficie, e il collettore in un incubatore di coltura cellulare impostato a 5% di CO ₂ e 37 ° C per 2 h.
6. Dopo l'incubazione 2 ore, rimuovere la testina di stampa e posizionare il coperchio sul piatto di coltura. Il momento in cui la testina di stampa rimosso è considerato il punto di tempo 0 ore.

4. Standard di coltura cellulare

1. Aggiungere 1 ml di supporti preriscaldata a una piastra TCTPS 12 pozzetti siero-spotted preparato al punto 2.
2. Prelevare 1 ml della sospensione cellulare residua dal passaggio 2 e pipetta in un singolo pozzetto di una 12 pozzetti TCTPS piastra. Ciò produrrà una coltura contenente 50.000 cellule nel piatto.
3. Posizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore a 37 ° C per 2 h.
4. Dopo l'incubazione 2 hr iniziare il cronometraggio; coerenza tra campioni stampati e di semina, questo è considerato il punto di tempo 0 ore.

5. Culture Visualization

1. Dopo 0, 2, 24, e 48 hr cellule prese da ciascuno dei due metodi described sopra e immagine utilizzando un microscopio invertito standard.
   1. Colorare le cellule con ioduro di propidio, una macchia rosso fluorescente che è incorporato solo nel nucleo delle cellule morte.
      1. Lavare delicatamente le cellule 3 volte con 1 ml di tampone fosfato isotonico con calcio e magnesio (PBS + +) per rimuovere eventuali detriti.
      2. Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato PBS + + a ciascun recipiente di coltura.
      3. Aggiungere 1 ml di soluzione di ioduro di propidio magazzino (1 mg / ml) per ogni nave cultura.
      4. Incubare le cellule colorate con ioduro di propidio a 37 ° C per 10 min.
   2. Immagine le cellule utilizzando un microscopio invertito a 10x e 40x di ingrandimento.
2. Eliminare le celle in un contenitore a rischio biologico appropriato.

Results

Le cellule NIH/3T3 linea cellulare di fibroblasti sono stati stampati o seminate su una superficie immersa. Le cellule sono state coltivate ad una densità di 5 x 10 ⁴ cellule per ml. Le cellule sono state seminate utilizzando tecniche di coltura cellulare tradizionali. Le cellule sono state stampate usando una grande formato, dodici flusso testina cella in cui i canali sono più grandi (~ 500 micron) che l'CFM usato per proteine ​​e altre biomolecole. Le cellule sono state stampate o seminate su una superficie...

Discussion

La tecnologia di stampa 3D microfluidica qui descritta è l'unica in grado di stampa microfluidically array di celle in un liquido riempito bene, cioè una superficie sommersa. Stampando sulle superfici sommerse, microarray di cellule possono essere prodotti che mantengono il fenotipo cellulare fisiologicamente rilevanti di cellule così come la capacità di multiplex cellule sul fondo di un singolo pozzetto Figura 4. I risultati di questo studio mostrano che microfluidically stampa cellule ris...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microspotter a flusso continuo	Wasatch Microfluidics
Celle NIH/3T3	ATCC	CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	Terreni di base per cellule
tampone HEPES	Invitrogen	15630-080	Additivo per terreni cellulari (pH di controllo)
Piruvato di sodio	Invitrogen	11360-070	Additivo per terreni cellulari
Penicillina-streptomicina	Invitrogen		Additivo per terreni cellulari
Trypan blue	Invitrogen	15250-061	Cellule coloranti per il conteggio
Emocitometro	Fisher	267110	Camera cellulare per contare le cellule
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Utilizzato per controllare le celle
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Utilizzato per la raccolta di immagini
Soluzione salina tamponata con fosfato (con calcio e magnesio)	Invitrogen	14040-133	Risciacquo delle cellule prima del passaggio e prima della colorazione con PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	Utilizzato per rimuovere le cellule dalla superficie