Questo articolo descrive un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni dell'ippocampo in vitro utilizzando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia super-risoluzione usando SIM fornisce risoluzione di immagine notevolmente oltre il limite di diffrazione della luce in tutte le tre dimensioni spaziali, permettendo l'imaging di singole spine dendritiche con maggiore dettaglio.
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Articolo metodologico
Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell'ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Spine dendritiche sono sporgenze che emergono dal dendrite di un neurone e rappresentano gli obiettivi primari di ingressi postsinaptici eccitatori nel cervello. I progressi tecnologici hanno identificato queste strutture come elementi fondamentali di connettività neuronale e nella plasticità sinaptica. L'analisi quantitativa della morfologia della colonna vertebrale mediante microscopia ottica resta un problema essenziale a causa di limitazioni tecniche connesse con il limite intrinseco di rifrazione della luce. Spine dendritiche possono essere facilmente identificati da confocale a scansione laser microscopia a fluorescenza. Tuttavia, misurando sottili cambiamenti nella forma e dimensioni delle spine è difficile perché le dimensioni della colonna vertebrale diverse lunghezza sono generalmente più piccole rispetto alla risoluzione ottica convenzionale fissata dal limite di risoluzione teorica di microscopia luce di 200 nm.
Diverse tecniche di risoluzione di super sviluppate recentemente sono stati utilizzati per immagine strutture cellulari di dimensioni inferiori a 200 nm, comprese le spine dendritiche. Tueste tecniche sono basate su operazioni di campo lontano classici e consentono quindi l'uso di metodi di preparazione dei campioni esistenti e di immagine oltre la superficie di un campione. Qui descritto è un protocollo di lavoro per applicare la risoluzione strutturata eccellente illuminazione microscopia (SIM) per l'imaging di spine dendritiche in colture di neuroni ippocampali primarie. Le possibili applicazioni di SIM si sovrappongono con quelli della microscopia confocale. Tuttavia, le due tecniche presentano differente applicabilità. SIM offre risoluzione laterale maggiore efficacia, mentre microscopia confocale, grazie all'utilizzo di un pinhole fisica, raggiunge miglioramento risoluzione a scapito della rimozione di fuori fuoco luce. In questo protocollo, neuroni primari sono coltivate su vetrini utilizzando un protocollo standard, trasfettate con plasmidi di DNA codificanti proteine fluorescenti e ripreso con SIM. L'intero protocollo qui descritto dura circa due settimane, perché spine dendritiche vengono esposte dopo 16-17 giorni in vitro, quandosviluppo dendritico è ottimale. Dopo il completamento del protocollo, spine dendritiche possono essere ricostruiti in 3D da una serie di SIM stack di immagini utilizzando software specializzati.
Introduzione
Una spina dendritica è una piccola protrusione della membrana del neurone. Questa caratteristica struttura è specializzata per ricevere tipicamente ingresso di una singola sinapsi e rappresenta l'area di contatto fisico tra due neuroni. La maggior parte delle spine dendritiche funzionalmente maturi sono costituiti da una punta globulare, testa definito, e un collo sottile che collega la testa all'albero dendritica. Tuttavia, spine non sono statici e si muovono attivamente e cambiano la loro morfologia continuamente anche nel cervello adulto 2. Entro un periodo di due settimane di tempo, colture primarie di neuroni dell'ippocampo di ratto deriva....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali su animali sono stati ottimizzati per ridurre la sofferenza degli animali e sono stati approvati dalla Commissione per la Sperimentazione Animale, Università di Amsterdam, il protocollo DEC # DED204 e DED250.
1. Coverslip Preparazione
- Tagliare i coprioggetti a una dimensione di 15 millimetri x 15 mm con un carburo o diamante scriba, in modo che si inseriscono nei pozzetti di una piastra 12 pozzetti.
- Mentre si lavora in una cappa aspirante, avviare rivestimento vetrino coprioggetto immergendo completamente in soluzione di acido nitrico concentrato (70% p / p) in un contenitore di vetro. ....
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Risultati
Qui descritto è un protocollo di lavoro standardizzato per l'imaging spine dendritiche di topo neuroni primari in vitro utilizzando SIM. Il flusso di lavoro protocollo ei suoi passi fondamentali sono illustrati nella Figura 1. Nel complesso, il protocollo richiede circa 2 settimane di lavoro sperimentale separate in una prima fase di preparazione del campione, compresi cultura, sviluppo e trasfezione di neuroni ippocampali di ratto primari e immunoistochimica e seconda fase dell'imaging.......
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Discussione
In questo articolo viene descritto un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di topo neuroni primari in coltura in vitro utilizzando SIM. Il metodo di coltura neurone dell'ippocampo primaria è un adattamento del metodo originale descritto da Kaech e Banker 18. Le differenze principali sono l'uso di Neurobasal/B27 terreno di coltura, che elimina la necessità di culture alimentazione astrogliali, e l'aggiunta del FUDR inibitore mitotico il giorno 3 che promuove la sopravvivenza .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da un numero di licenza VIDI H64.09.016 da L'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) per CPF. CPF è grato al Dott. Silvina A. Fratantoni per i suoi commenti critici e correzioni sul manoscritto finale. GMRDL / emmm sono supportati dagli olandesi Technology Foundation STW (progetto 12151 e 11350), che fa parte del NWO, e che è in parte finanziato dal Ministero degli Affari economici. Ringraziamo l'Catherine Kitts e Peter Drent di Nikon Instruments Europe BV per l'assistenza e il supporto. HX è stato sostenuto dalla Reale Accademia Olandese delle Arti e delle Scienze (sovvenzione 11CDP10) e WT è stata sosten....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinze | |||
| Pinze grandi Forbice | |||
| fine Forbice | |||
| grande | |||
| Spatola | |||
| Microscopio da dissezione con illuminazione | |||
| Microscopio | |||
| 37 & Deg; C bagno | |||
| colture cellulari a flusso laminare | |||
| Forno | |||
| Bruciatore | |||
| Incubatore per colture cellulari (5% CO2, 37 ° C) | |||
| Microcentrifuga | |||
| Agitatore | |||
| [header] | |||
| Configurazione del microscopio a illuminazione strutturata Nikon composta da: | |||
| Microscopio invertito da ricerca Nikon Eclipse Ti con sistema | |||
| Lente dell'obiettivo a olio Nikon CFI Apo TIRF 100x (N.A. 1,49) | |||
| 4 laser allo zaffiro coerenti (lunghezza d'onda di uscita 458, 488, 514 e 561 nm) | |||
| SIM Illuminatore | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE lampada | |||
| al mercurio SIM Microscopio Controllo | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC con Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon' s NiS Elements 6.14 Pacchetto | |||
| Nikon tipo A olio | |||
Riferimenti
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol.
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Ristampe e permessi
