Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente.
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Articolo metodologico
Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante i rapidi progressi nella microscopia a high-throughput, saggi basati su immagini quantitativi pongono ancora sfide significative. Mentre una varietà di strumenti di analisi di immagine specializzati sono disponibili, la maggior parte dei flussi di lavoro basati-image-analisi tradizionali hanno curve di apprendimento ripide (per la messa a punto dei parametri di analisi) e determinano tempi lunghi di consegna tra imaging e di analisi. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in un'immagine, è un serio ostacolo al riguardo.
Qui vi presentiamo un supplente, workflow cellulare privo di segmentazione basata su PhenoRipper, una piattaforma software open-source progettato per l'analisi rapida ed esplorazione di immagini di microscopia. Il gasdotto qui presentato è ottimizzato per le immagini di microscopia di immunofluorescenza su colture cellulari e richiede un intervento minimo da parte dell'utente. Dopo mezz'ora, PhenoRipper può analizzare i dati da un tipico esperimento 96 pozzetti e generare profili immagine. Gli utenti possonopoi esplorare visivamente i dati, effettuare il controllo di qualità sul loro esperimento, garantire una risposta alle perturbazioni e verificare la riproducibilità dei replicati. Questo facilita un ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, che è fondamentale durante l'ottimizzazione del dosaggio. Questo protocollo è utile non solo come una prima analisi pass per il controllo di qualità, ma anche può essere usato come una soluzione end-to-end, in particolare per lo screening. Il flusso di lavoro qui descritto scalabile per grandi insiemi di dati come quelli generati da schermi high-throughput, e ha dimostrato di condizioni sperimentali raggruppare fenotipo con precisione su una vasta gamma di sistemi biologici. L'interfaccia PhenoBrowser fornisce un quadro intuitivo per esplorare lo spazio fenotipica e si riferiscono immagine proprietà alle annotazioni biologiche. Nel loro insieme, il protocollo qui descritto abbasserà le barriere per l'adozione di analisi quantitativa di schermi immagini based.
Introduzione
Negli ultimi dieci anni, i rapidi progressi nella tecnologia di imaging hanno dato molti laboratori la capacità di effettuare la microscopia high-throughput. La sfida è ora spostato da una delle immagini di una delle analisi. Come possiamo caratterizzare, confrontare ed esplorare il torrente di complessi fenotipi ancora sottili generati da uno schermo di immagini high-throughput tipico?
Un certo numero di piattaforme di image-analisi e informatici hanno dato degli utenti toolbox sofisticati 1-3 per l'estrazione di informazioni biologiche da grandi raccolte di immagini. Eppure molti ostacoli significativi rimangono in analis....
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Protocollo
1. Campioni Preparazione e Imaging
- Coltura cellulare
- Split culture di routine e mantenere al 20-70% di confluenza. Un giorno prima dell'esperimento, crescere cellule HeLa in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, vedi Tabella dei Materiali) e completata con il 10% FBS (siero fetale bovino) e 1x penicillina / streptomicina.
- Il giorno dell'esperimento, le celle divise in crescita in coltura (circa il 50% confluenti).
- Lavare le cellule con PBS (Phosphate Buffered Saline), esporre a circa 2 ml di tripsina / EDTA (Etilendiammintetraacetato) per alcuni secondi. Aspirare eccesso tripsina / EDTA e mantenere le cellule immerse in....
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Risultati
Qui abbiamo testato la capacità di questo flusso di lavoro per i farmaci del gruppo in base al loro meccanismo d'azione. Cellule HeLa sono state seminate in 30 pozzetti di una piastra da 384 pozzetti e colorate per DNA / actina / α-tubulina. Gli anticorpi specifici primari, anticorpi secondari fluorescenti marcate, e altre macchie fluorescenti che sono stati utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Wells sono stati trattati con 15 farmaci appartenenti a tre classi meccanicistici (istone deacetilasi inib.......
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Discussione
Il flusso di lavoro qui descritto consente la caratterizzazione e comparazione di immagini di microscopia facile e veloce. In primo luogo abbiamo dimostrato come questo flusso di lavoro può aiutare l'ottimizzazione esperimento, per esempio eseguire rapidamente il controllo di qualità sulle immagini di microscopia. Successivamente, abbiamo dimostrato il suo potenziale per l'analisi high-throughput dati di screening: siamo stati in grado di droghe raggruppare in base al loro meccanismo d'azione. Il raggruppame.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Adam Coster e tutti gli altri membri dei laboratori Altschuler e Wu per il feedback utili e discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Health concede R01 GM085442 e CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), e la Welch Fondazione I-1619 (SJA) e I-1644 (LFW).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM, Alto glucosio | Invitrogen | 11965 | Alto glucosio, L-glutammina |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Colorazione del DNA, diluizione 1:2.000 di 5 mg/ml |
| stock Marker falloidina-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Fallotossina coniugata, diluizione 1:200 |
| Anticorpo primario &alfa;-tubulina | Sigma | T9026 | Ab primario, topo monoclonale, diluizione 1:200 |
| Antivody secondario anti-topo TRITC | Jackson | 115-025-166 | Ab secondario coniugato, 0,5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glicerolo |
| Aldosterone | concentrazione utilizzata: 0,2 μ M | ||
| Concentrazione di apicidina | utilizzata: 20 μ M | ||
| Concentrazione di colchicina | utilizzata: 0,16 μ M | ||
| Concentrazione di cortisolo | utilizzata: 0,2 μ M | ||
| Concentrazione di desametasone | utilizzata: 0,2 μ M | ||
| Concentrazione di docetaxel | utilizzata: 0,2 μ M | ||
| M344 | concentrazione utilizzata: 20 μ M | ||
| MS-275 | concentrazione utilizzata: 5 μ M | ||
| Concentrazione di nocodazolo | utilizzata: 0,3 μ M | ||
| Concentrazione di prednisolone | utilizzata: 0,2 μ M | ||
| RU486 | concentrazione utilizzata: 0,2 μ M | ||
| Concentrazione Scriptaid | utilizzata: 70 μ Concentrazione di M | ||
| Taxol | utilizzata: 0,3 μ M | ||
| Concentrazione di tricostatina A | utilizzata: 0,2 μ M | ||
| Concentrazione di vinorelbina | utilizzata: 0,3 μ M |
Riferimenti
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., ....
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Ristampe e permessi
