Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

Sommario

Degradazione delle proteine ​​mirata rappresenta un importante meccanismo di regolazione per la funzione delle cellule. Essa si verifica attraverso una via ubiquitina-proteasoma conservati, che attribuisce catene polyubiquitin alla proteina bersaglio che poi servire "tag" molecolari per il proteasoma 26S. Qui, descriviamo un saggio semplice e affidabile senza cellula per proteasoma degradazione delle proteine.

Abstract

Il pathway ubiquitina-proteasoma per la degradazione delle proteine ​​è emerso come uno dei meccanismi più importanti per la regolazione di un ampio spettro di funzioni cellulari in quasi tutti gli organismi eucarioti. In particolare, nelle piante, il sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regola la degradazione delle proteine ​​e contribuisce significativamente allo sviluppo di una vasta gamma di processi, compresa la risposta immunitaria, lo sviluppo e la morte cellulare programmata. Inoltre, sempre più evidenze suggeriscono che numerosi agenti patogeni delle piante, quali Agrobacterium, sfruttano l'UPS di accoglienza per l'infezione efficiente, sottolineando l'importanza della continuità nelle interazioni pianta-patogeno.

La specificità di substrato della UPS è raggiunto dalla ubiquitina ligasi E3 che agisce di concerto con la E1 e E2 ligasi di riconoscere e marcare molecole proteiche specifici destinati a degradazione da dandole catene di molecole di ubiquitina. Una classe delle ligasi E3 è la SCF (Skp1 / Cproteina Ullin / F-box) complessa, che riconosce specificamente i substrati UPS e obiettivi per l'ubiquitinazione attraverso la sua componente proteica F-box. Per studiare il ruolo potenziale di UPS in un processo biologico di interesse, è importante mettere a punto un saggio semplice e affidabile per degradazione proteica UPS-mediata. Qui, descriviamo un tale saggio usando un sistema acellulare pianta. Questo test può essere adattato per lo studio dei ruoli di degradazione delle proteine ​​regolamentato in diversi processi cellulari, con un focus particolare sulle interazioni proteina-substrato F-box.

Introduzione

Il proteasoma percorso ubiquitin/26S sta emergendo come un meccanismo diffuso per il controllo di diverse reazioni biologiche, tra cui regolazione trascrizionale, la progressione del ciclo cellulare e trasduzione del segnale, recettori down-regulation o endocitosi, tra gli altri processi ^1-4. In questo percorso, la proteina bersaglio viene etichettato da ubiquitina residui che vengono prima collegati tramite un legame thiolester to-ubiquitina attivando l'enzima E1 e poi traslocato a un residuo di acido cisteina amino ubiquitina-coniugazione enzima E2, infine, E2 interagisce con ubiquitina ligasi E3 , con conseguente polyubiquitination del subs....

Protocollo

1. Espressione della proteina

1. Scelta del sistema di espressione
   Selezionare il sistema, cioè, vettori e vettore metodo di consegna, più adatto per l'espressione della proteina di interesse nella organismo modello / cella specifica. Si noti che il nostro test richiede l'espressione delle proteine ​​testate in quantità facilmente rintracciabile, che è meglio ottenere con la trasformazione temporanea di un gran numero di cellule. Nelle piante, per esempio, questo è migliore, utilizzare plasmidi binari come vettori di espressione e Agrobacterium come sistema di consegna.
2. Costruzione di vettori di espressione bi....

Risultati

Figura 1, adattato da Zaltsman et al. ^17, illustra esperimenti rappresentativi per il rilevamento di degradazione del proteasoma in un sistema acellulare. In particolare, dimostriamo destabilizzazione di un impianto destinato alla difesa proteina VIP1 dalla proteina F-box VBF attraverso la via SCF ^VBF in N. benthamiana. Arabidopsis VBF e VIP1 (HA-VIP1) proteine ​​HA-tagged stati transitoriamente coespressi, e HA-VIP1 proteina contenuto all'in.......

Discussione

Questo test si basa sulla espressione delle proteine ​​testati in tessuti vegetali, quindi, il potenziale processo di degradazione proteasoma avviene ovviamente già all'interno dei tessuti viventi. Abbiamo protein assay destabilizzazione, tuttavia, solo negli estratti, con il tempo di campionamento di zero che serve come punto di riferimento iniziale. Quindi, definiamo come un saggio privo di cellule.

Un aspetto importante per il successo di questo test è la corretta scelta del vettore d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di dosaggio delle proteine	Bio-Rad	500-0001
Cocktail di inibitori della proteinasi	Sigma-Aldrich	S8820
Sistema Mini-Proteiforme	Bio-Rad	165-8000
Sistema di elettrotrasferimento SD con western blotting	semi-secco Bio-Rad	170-3940
Affinità Coniglio purificato Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Capra IgG Perossidasi coniugato	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT membrana di trasferimento di nitrocellulosa	Pall Corporation	27377-000
Substrato HRP chemiluminescente occidentale Immobilon	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lattacistina	Sigma-Aldrich	L6785
Kit di macchie occidentali rapide Thermo Scientific Pierce, Pierce		35055	del substrato ECL