Articolo metodologico

L'uso di biosensori ottici privi di etichetta per rilevare modulazione dei canali del potassio da G-recettori accoppiati a proteine

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DOI:

10.3791/51307

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10 febbraio 2014

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

In questo articolo

Sommario

Tecniche biosensore ottico in grado di rilevare variazioni nella massa in prossimità della membrana plasmatica in cellule viventi e consentono di seguire le risposte cellulari in entrambe singole cellule e popolazioni di cellule. Questo protocollo descrive rilevamento della modulazione dei canali del potassio da G recettori accoppiati alle proteine ​​in cellule intatte utilizzando questo approccio.

Abstract

Canali ionici controllano le proprietà elettriche dei neuroni e altri tipi di cellule eccitabili consentendo selettivamente ioni di fluire attraverso la membrana plasmatica 1. Per regolare l'eccitabilità neuronale, le proprietà biofisiche di canali ionici sono modificate da proteine ​​e molecole di segnalazione, che spesso si legano ai canali stessi per formare un complesso eteromerico canale 2,3. Saggi tradizionali esaminare l'interazione tra canali e proteine ​​regolatrici richiedono etichette esogeni che possono potenzialmente alterare il comportamento della proteina e diminuire la rilevanza fisiologica del bersaglio, fornendo poche informazioni sul decorso temporale delle interazioni nelle cellule viventi. Biosensori ottici, come il sistema X-BODY Biosciences BIND Scanner, utilizzano una tecnologia priva di etichetta romanzo, risonanza lunghezza d'onda reticolo (RWG) biosensori ottici, per rilevare i cambiamenti in risonanza luce riflessa nei pressi del biosensore. Questo saggio permette la rilevazione della relativacambiare in massa all'interno della porzione di fondo di cellule viventi aderenti alla superficie biosensore risultanti da ligando cambiamenti indotti nella adesione cellulare e la diffusione, la tossicità, la proliferazione e cambiamenti nelle interazioni proteina-proteina in prossimità della membrana plasmatica. RWG biosensori ottici sono stati utilizzati per rilevare le variazioni di massa vicino membrana plasmatica delle cellule in seguito all'attivazione dei recettori accoppiati a proteina G (GPCR), recettori tirosina chinasi e altri recettori della superficie cellulare. Cambiamenti ligando-indotta nelle interazioni proteina-canale ioni possono essere studiate usando questo test. In questo articolo, descriveremo la procedura sperimentale utilizzato per rilevare la modulazione di Slack-B sodio e potassio-attivata (K Na) canali di GPCR.

Introduzione

Esaminando le cellule viventi nel loro contesto fisiologicamente rilevanti è fondamentale per la comprensione delle funzioni biologiche di bersagli cellulari. Tuttavia, i saggi che esaminano l'interazione tra i canali e le proteine ​​citoplasmatiche normativi, come saggi coimmunoprecipitation, generalmente forniscono poche informazioni sul decorso temporale delle interazioni nelle cellule viventi. La maggior parte dei test cellulari attuali misurare un evento cellulare specifica, come ad esempio la traslocazione di una proteina fluorescente targhetta di interesse. Questi saggi richiedono l'alterazione delle proteine ​​di interesse, che possono potenzialmente alterare il comportamento della proteina e diminuire la rilevanza fisiologica del bersaglio. Saggi cellulari non invasiva, che non richiedono manipolazione del sistema, forniscono una misura continua di attività cellulare e permettono studi di cellule nella loro più fisiologicamente rilevanti stato 4.

Biosensori ottici sono progettati per produrreuna variazione misurabile in una caratteristica della luce che è accoppiato alla superficie del sensore. Biosensori ottici che utilizzano le onde evanescenti, tra cui risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la risonanza lunghezza d'onda reticolo tecniche (RWG), sono stati principalmente utilizzati per rilevare le affinità e cinetica delle molecole leganti ai loro recettori biologici immobilizzati sulla superficie del sensore. Più recentemente, disponibili in commercio biosensori RWG sono stati sviluppati per consentire il rilevamento della variazione relativa della massa all'interno della porzione di fondo di cellule aderenti alla superficie del sensore ad alta risoluzione spaziale (fino a 3,75 micron / pixel) 5. Questi biosensori in grado di rilevare variazioni di massa in prossimità della membrana plasmatica di cellule viventi che derivano dalla stimolazione, come l'adesione cellulare e la diffusione, la tossicità, la proliferazione e vie di segnalazione indotte da una varietà di recettori di superficie compresa recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR) 6 . Biosensori RWG rilevano la relativa change nell'indice di rifrazione in funzione della variazione relativa della massa entro 150 nm del biosensore 7. Quando le cellule vengono piastrate al biosensore, questa variazione dell'indice di rifrazione riflette il cambiamento della massa in prossimità della membrana plasmatica della cellula risultante da un cambiamento in aderenza cellulare al biosensore. Questo protocollo discuterà la rilevazione delle interazioni proteina-canale utilizzando biosensori RWG.

Sistemi di acquisizione dati RWG costituite da più componenti. Poiché l'X-BODY Biosciences BIND Scanner è stato utilizzato per questi esperimenti, ci riferiremo ai componenti di questo particolare sistema, che consiste in un lettore di piastre, biosensori associati, software di acquisizione BIND Scan, e il software BIND View analisi 8. I biosensori cristallo fotonico, definiti in appresso come biosensori ottici, sono composti da una disposizione periodica di un dielettrico e materiale in 2 o 3 dimensioni che impedisce la propagazione della luce a specifichelunghezze d'onda e direzioni. Strutture a cristallo fotonico si basano su un fenomeno chiamato anomalia di Wood. Prima scoperto da Wood nel 1902, queste anomalie sono effetti osservati nello spettro della luce riflessa da reticoli di diffrazione ottica in cui rapide variazioni di intensità di particolari ordini di diffrazione si verificano in determinate bande di frequenza stretti. Nel 1962, Hessel e Oliner presentato una nuova teoria delle anomalie di legno in cui finita periodo reticolo genera una lunghezza d'onda di risonanza permanente 9. Nei biosensori ottici qui descritti, anomalie del legno sono usati per produrre un biosensore RWG che quando stimolate con luce bianca riflette solo banda molto stretta di lunghezze d'onda (tipicamente tra 850-855 nm).

Biosensori singoli costituiti da un materiale plastico a basso indice di rifrazione con una struttura superficiale periodica che è rivestita con un sottile strato di materiale dielettrico biossido di titanio ad alta rifrazione (TiO 2). Quando le Biosenso è illuminato con una sorgente di luce di lunghezza d'onda ampia, il reticolo ottico di cristalli fotonici riflette una ristretta gamma di lunghezze d'onda della luce che viene misurata mediante uno spettrofotometro nello scanner BIND. L'intensità massima di lunghezze d'onda riflesse (onda di picco di valore, o PWV) viene quindi calcolata dal segnale. La PWV di luce si sposta su una variazione dell'indice di rifrazione per effetto di un aumento o una diminuzione della massa all'interno della vicinanza (~ 150 nm) della superficie biosensore. Biosensori ottici sono incorporati in un Society standard per Scienze Biomolecolari (SBS) micropiastre da 384 pozzetti per i saggi utilizzati in questi esperimenti.

Biosensori RWV sono utilizzati per rilevare cambiamenti dopo l'aggiunta di segnali esogeni in cellule viventi 10. Le cellule sono coltivate direttamente sulla superficie di un biosensore RWG e la variazione dell'indice locale della rifrazione è monitorata in seguito al trattamento con stimoli specifici. La direzione del cambiamento in massa al biosensore può esseredeterminata perché un aumento dell'indice di rifrazione locale di risultati da un aumento della massa vicino al biosensore e viene misurata come un aumento PWV. Viceversa una diminuzione della massa produce una diminuzione della PWV. La variazione rilevata PWV può derivare da numerosi eventi cellulari, inclusi i cambiamenti di adesione cellulare, la proteina assunzione / release, endocitosi e riciclaggio, esocitosi, l'apoptosi, e del citoscheletro riassetto. Per esempio, il dosaggio può essere rilevare cambiamenti nelle interazioni proteina-canale fra i canali del potassio e altri componenti citoplasmatici o citoscheletro. L'evento, tuttavia, deve avvenire all'interno della zona di rilevamento nm ~ 150 vicino al biosensore, e nel caso di una cella a schiera, in prossimità della membrana plasmatica. Acquisizione di risposte cellulari viene eseguita con software BIND Scan e viene generata una rappresentazione di immagine di ciascuna delle 384 pozzetti nella piastra SBS. Questo sistema ha una risoluzione fino a 3,75 micron / pixel, permettendo la rilevazione di eventi in singole cellule, epossono essere utilizzati sia con linee cellulari (quali cellule HEK293 o CHO) o con cellule primarie più fisiologicamente rilevanti. L'analisi delle immagini con BIND Vista software permette l'individuazione di risposte cellulari sia in popolazioni di cellule individuali e. Come biosensori sono incorporati in standard SBS 384 pozzetti, il sistema è facilmente adattabile a screening ad alto rendimento (HTS).

Resonance d'onda reticolo biosensori ottici sono stati precedentemente utilizzati per rilevare variazioni di massa vicino membrana plasmatica delle cellule dopo l'attivazione del GPCR 11. Il nostro laboratorio ha clonato due canali di sodio e potassio-attivata (K Na), Slack-B e Slick 12. L'attività di entrambi i canali Slack-B e Slick ha dimostrato di essere molto fortemente influenzato da attivazione diretta della proteina chinasi C (PKC) 13. Attivazione di Gα proteine ​​q recettori accoppiati, come il recettore muscarinico M1 e la mGluR1 glutammato metabotropici receptor, regola potentemente l'attività dei canali attraverso l'attivazione della PKC. Questi canali K Na contribuiscono all'adattamento neuronale durante la stimolazione costante e regolano la precisione dei tempi di azione Potenziali 14. Canali Slack sono noti per interagire con una varietà di molecole di segnalazione citoplasmatici, tra cui FMRP, la proteina Fragile X Ritardo Mentale 15,16. Mutazioni nel risultato Slack in più crisi parziali Migrazione dell'Infanzia (MMPSI), una forma ad esordio precoce di epilessia che si traduce in grave ritardo dello sviluppo 17.

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Protocollo

1. Colture Cellulari (Adattato da Fleming ed Kaczmarek 18,)

  1. Cellule di coltura in mezzi appropriati per maggiore di 2 ma meno di 10 passaggi prima di utilizzare questo test. Non trasfettate cellule HEK-293 e cellule HEK-293 che esprimono stabilmente ratto proteina Slack-B vengono coltivate in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco una metà e una metà di Leibovitz L-15 integrato con calore inattivato siero bovino fetale al 10% e antibiotici. 500 mcg / ml Geneticin (G418) è aggiunta cellule HEK-293 che esprimono stabilmente Slack-B per selezionare per l'espressione del canale Slack. Cellule Passage a confluenza del 70-90% per dissociazione da piatti con una soluzione di tripsina-EDTA 0,25%.

2. Matrice extracellulare (ECM) Rivestimento del TiO 2 384 pozzetti Piastra biosensore ottico con fibronectina e Ovalbumina

  1. Preparazione della miscela fibronectina ECM e soluzione bloccante ovalbumina
    1. Preparare una soluzione di lavoro di fibronectin in tampone fosfato salino (PBS) con una concentrazione finale di 5 mg / ml di fibronectina in 20,0 ml di PBS. Da una concentrazione magazzino 1,0 mg / ml, aggiungere 100 ml a 20,0 ml di PBS per una diluizione di 200 volte. La soluzione di lavoro di fibronectina può essere suddiviso in aliquote e conservato a -20 ° C dopo la preparazione.
    2. Preparare una soluzione madre 5% di ovoalbumina inattivato al calore in acqua sterile. Diluire ovalbumina in tessuto acqua di grado coltura sterile per una soluzione al 5% e al calore inattivare per 30 min a 60 ° C. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e filtrare la soluzione sterile. Aliquota della soluzione ovoalbumina 5% e conservare a 4 ° C.
    3. Preparare una soluzione di lavoro 2% di ovoalbumina diluendo la soluzione di riserva 5% in PBS. Ad esempio, aggiungere 12,0 ml di soluzione al 5% ovoalbumina azionario per 18,0 ml di PBS per un volume finale di 30,0 ml.
  2. 384 pozzetti rivestimento piastra biosensore ottico
    1. Idratare la piastra TiO 2 con 20,0 microlitri / pozzettoacqua sterile grado coltura tissutale per 15 min. Le seguenti operazioni devono essere eseguite con una pipetta a 16 canali.
    2. Lavare 1x piastra con 50.0 ml di PBS per pozzetto.
    3. Aggiungere 20,0 ml di soluzione di lavoro fibronectina a ciascun pozzetto ed incubare per 2 ore a temperatura ambiente per creare la ECM.
    4. Lavare 1x piastra con 50.0 ml di PBS per pozzetto.
    5. Aggiungere 40,0 ml di soluzione di lavoro ovoalbumina a ciascun pozzetto e incubare overnight a 4 ° C per bloccare la piastra.
    6. Lavare 3x piatto con 50.0 ml di PBS per pozzetto. Piastre rivestite ECM possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 48 ore.

3. Semina delle cellule sulla 384 pozzetti biosensore ottico Piatto

  1. Rimuovere mezzi di crescita dalle cellule e aggiungere tripsina per staccare le cellule dalla piastra. Raccogliere le cellule e centrifugare a 1000 xg per 1 min. Rimuovere i supporti tripsina e risospendere le cellule in terreno di coltura.
  2. Utilizzando un emocitometro o un automatizzatocontatore di cellule, determinare la concentrazione delle cellule.
  3. Per minimizzare gli effetti di evaporazione durante l'incubazione, verrà utilizzato 50,0 ml di mezzo di crescita per pozzetto. Le cellule devono essere diluite per ottenere il numero desiderato di cellule per pozzetto in un volume di 50,0 ml di mezzo di crescita. Per questi esperimenti, 1000 cellule / pozzetto sono state piastrate sul biosensore.
  4. Lasciare le cellule inseminate da incubare una notte in mezzo di crescita a 37 ° C in aria / 5% di CO 2.

4. Preparazione del biosensore e composte Piastre per il dosaggio RWG ottica Biosensor

  1. Rimuovere la piastra dall'incubatore e rimuovere i supporti la crescita delle cellule. Lavare le cellule 1x con Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS). Aggiungere 25,0 ml di HBSS ad ogni pozzetto.
  2. Posizionare la piastra biosensore sullo scanner BIND e permettono alle cellule di portare a temperatura ambiente per 1-2 ore.
  3. Preparare un piatto composto di separato da cui ligandi di interesse saranno annuncioded alla piastra biosensore durante il dosaggio. Per questi saggi, 25,0 ml di soluzione contenente composto stati aggiunti a ciascun pozzetto della piastra biosensore per un volume totale di 50,0 microlitri. Come tale, composti in soluzione sono stati preparati in 2x la concentrazione finale desiderata.

5. Eseguire il test RWG Optical biosensore

  1. Prendere una misura di base con il sistema Scanner per pozzi A1-P12 (metà piastra a 384 pozzetti SBS) usando la massima risoluzione di 3,75 micron / pixel per la centrale 1,5 mm ogni pozzetto usando il software BIND Scan. Questa scansione di base richiede circa 30 min.
  2. Aggiungere 25,0 ml di soluzioni composti a ciascun pozzetto per pozzetti A1-P12.
  3. Prendete una misura di base di pozzi A13-P24.
  4. Aggiungere 25,0 ml di soluzioni composti a ciascun pozzetto per pozzi A13-P24.
  5. Prendete una misura aggiunta del composto incarico per pozzi A1-P12, e ripetere per pozzi A13-P24.

6. Lanalisi di Assay dati con BIND Vista

  1. Aprire i dati di analisi BIND per la misurazione di riferimento in Windows, e fare clic sul pulsante "Grid Editor" per consentire la selezione delle cellule. Il software calcolerà le metriche di interesse definiti dall'utente.
  2. Aprire la "Plug-in", che comprendono il "Finder Cella" e funzione "Baseliner". Impostare i parametri in "Finder cella" in modo che le cellule sono distinguibili dallo sfondo del biosensore.
  3. Esportare il file di mappa cellula che contiene i dati "Finder cellulare" per la misurazione di riferimento.
  4. Ripetere i passaggi 6,1-6,2 per i dati post-addizione composto.
  5. Aprire il "Baseliner" plug-in e importare la mappa cella dalla misurazione di riferimento. Il software calcolerà lo spostamento PWV tra i dati di base e composti posta.
  6. Seleziona "Δ cellulare media" per l'uscita dello spostamento medio in PWV per le cellule. I dati possono poi essere esportati in Microsoft Excel per ulteriori analisi.

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Risultati

Slack-B stabilmente transfettate cellule HEK-293 e controllano untransfected HEK-293 cellule sono state seminate a 1.000 cellule / pozzetto in 384 e-ECM, rivestite RWG piastre biosensore. Immagini dal centro di 1,5 mm 2 del biosensore sono stati registrati con una risoluzione di 3,75 micron / pixel (Figura 1). Mappe gradiente di densità di massa sono stati generati pre e 30 minuti dopo aggiunta del composto con il software BIND Scan. Il BIND View software è stato utilizzato per determinare il...

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Discussione

Il primo Z (Z ') fattore è un metodo statistico comune per quantificare la qualità di un alto-capacità di screening assay 20, e poiché lo screening degli agonisti GPCR in questo saggio si è verificato in un saggio compatibile 384 pozzetti SBS, fornisce un'eccellente misura della robustezza e la validità di questo test 21. Valore AZ 'di 1 indica un saggio teoricamente ideale, con un numero infinito di punti dati con deviazioni standard inesistenti. Valore AZ 'compresa tra 0,5-1 è con...

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Dichiarazioni

Steven M. Shamah è un dipendente di X-BODY Biosciences.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati al Dr. Yangyang Yan nel laboratorio del Dr. Fred Sigworth alla Yale University per la generosa donazione di cellule HEK293 stabilmente esprimenti ratto proteina Slack-B. Inoltre, gli autori sono grati al Dott. Sigworth per crio-elettroni modello di microscopia omologia di Slack visualizzato nel video introduttivo. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH DH067517 e NS073943 a LKK

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM, Tecnologie perla vita11965-092
Tecnologie per la vita media L-15 di Leibovitz11415-064
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)Tecnologie per la vita15140-122
Geneticina G-418 SolfatoAB05057Bioanalitico
HBSSLife Technologies14025-092
Fibronectina dal plasma umanoSigma-AldrichF0895
Albumina dall'albume d'uovo di gallinaSigma-AldrichA5378
DPBSLife Technologies14190-144
Emocitometro di fase Bright-Line di HausserFisher Scientific02-671-6
Cloruro di carbamilcolinaSigma-AldrichC4382
SFLLR-NH2 sale trifluoroacetatoSigma-AldrichS8701
Finnpipette (5-50 µ l)Thermo Scientific4662090
Sistema di scansione BINDX-BODY BiosciencesN/A
Piastre rivestite TiO2 a 384 pozzettiX-BODY BiosciencesTiO-96-CM
ad alto glucosio Americano

Riferimenti

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