Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Summary

L'attacco dei virioni a una superficie è un requisito per l'imaging a virione singolo mediante imaging a fluorescenza a super risoluzione o microscopia a forza atomica (AFM). Qui dimostriamo un metodo di preparazione del campione per l'adesione controllata di virioni a superfici di vetro adatte all'uso nell'AFM e nell'imaging a fluorescenza a super risoluzione.

Abstract

L'immobilizzazione dei virioni sulle superfici di vetro è un passo fondamentale nell'imaging a virione singolo. Qui presentiamo una tecnica adottata da test di imaging a singola molecola che consente l'adesione di singoli virioni a superfici di vetro con specificità. Questa preparazione si basa sull'innesto della superficie del vetro con una miscela di PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-Biotin, aggiungendo uno strato di avidina e infine creando ancoraggi virione attraverso l'attacco di anticorpi specifici del virus biotinilato. Abbiamo applicato questa tecnica in una serie di esperimenti tra cui la microscopia a forza atomica (AFM) e l'imaging a fluorescenza a super risoluzione. Questo metodo di preparazione del campione si traduce in un'adesione di controllo dei virioni alla superficie.

Introduction

Le interazioni non specifiche basate sulla carica sono usate abitualmente per l'adesione dei virioni nella microscopia a forza atomica^1,2. Queste tecniche funzionano particolarmente bene se utilizzate su virioni non ineveloped con tappi molto^{rigidi 3-6}. Sebbene queste tecniche siano molto efficaci nell'immobilizzare il campione, non impediscono il legame non specifico delle proteine alla superficie. Il legame non specifico può creare un problema quando si tenta di immaginare virioni con AFM e tecniche di fluorescenza a super risoluzione che richiedono incubazioni del campione con vari anticorpi. Qui delineamo un metodo di preparazione del campione per l'immobilizzazione specifica dei virioni.

Il poli(glicole etilenico) (PEG) innestato in poli(L-lisina) (PLL) e adsorbito su una superficie di vetro fornisce un blocco significativo per le interazioni elettrostatiche delle proteine con il vetro⁷. I test a singola molecola che richiedono l'immobilizzazione di singole molecole su superfici di vetro hanno approfittato di questa proprietà e l'hanno utilizzata per creare una specifica tecnica di immobilizzazione a singola molecola basata su PEG^8-10. Questa preparazione è stata utilizzata anche per immobilizzare le gabbie di clatrarina sulla superficie^{del vetro 11} e per creare un rivestimento omogeneo di fibronectin per l'adesione delle cellule di ^{controllo 12}.

Abbiamo adottato il metodo di preparazione del campione basato sull'adsorbimento PLL-g-PEG sulle superfici di vetro da metodologie di imaging a singola molecola e lo abbiamo applicato all'imaging di singoli virioni del virus della stomatite vescicolare (VSV). Questi virioni singoli sono stati immagini usando la microscopia a forza atomica (AFM). Esperimenti simili sono stati eseguiti anche su perline funzionalizzate come controllo. I virioni sono stati anche immagini dalla microscopia a fluorescenza a super risoluzione, in quanto un anticorpo VSV-G etichettato con Alexa 647 è stato utilizzato per creare un'immagine dell'involucro di singoli virioni. L'imaging fluorescente ad alta risoluzione utilizza la localizzazione di singole molecole per creare^{un'immagine 13-15}. L'imaging bi-planare fPALM consente la localizzazione di singole molecole con 20 nm in piano e risoluzione di 50 nm lungo l'asse^{ottico 15,16}. Questa tecnica bi-planare è stata utilizzata per immagini di immagini fluorescenti a super-risoluzione presenti in questo studio. Una tecnica alternativa che ha risultati simili è STORM^13,17,18.

Sia l'AFM che le immagini fluorescenti a super-risoluzione di VSV ancorate al vetro dalle procedure descritte in questo documento, hanno mostrato un legame specifico dei virioni al vetro con interazioni minime non specifiche¹⁹. Qui presentiamo i protocolli di preparazione del campione per gli esperimenti di imaging fluorescente AFM e super-risoluzione. In breve: le coverlips in vetro pulito sono funzionalizzate adsorbendo una miscela di PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-biotina. È tipico che questo film sottile sia progettato per fornire biotina funzionalizzata tra il 15 e il 25% su una superficie rivestita. Le copertine vengono ulteriormente incubate con avidina tetramerica. Un anticorpo virale biotinilato viene quindi utilizzato per creare un sito di legame unico per i virioni. Il legame dell'anticorpo può essere fatto in due modi.

Il primo metodo è ottimizzato per AFM, tuttavia rimane adatto per l'imaging a fluorescenza a super risoluzione. In questo metodo la superficie rivestita di avidina viene trattata con anticorpi biotinilati prima dell'adesione virale. I virioni immobilizzati vengono trattati con anticorpo etichettato Alexa 647 per coprire l'involucro e consentire l'imaging a fluorescenza a super risoluzione dei virioni.

Il secondo metodo è quello di attaccare il virus in soluzione con l'anticorpo biotinilato e l'anticorpo etichettato Alexa 647 prima di aderire ai virus alla superficie trattata con avidina; questo metodo è ottimizzato per esperimenti di imaging a fluorescenza a super risoluzione in cui il recupero dell'involucro virale è importante. Questo metodo ha il vantaggio di consentire un rivestimento anticorpale uniforme sulla superficie virale. L'anticorpo biotinilato può essere miscelato con anticorpi virali etichettati Alexa 647 in rapporti che consentono un sufficiente adsorbimento del virus alla superficie trattata con avidina mantenendo un'alta concentrazione di etichetta fluorescente all'esterno dell'involucro virale. Questi anticorpi virali etichettati Alexa 647 non sono biotinilati e il loro eccesso può essere risciacquato al fine di ridurre il rumore di fondo.

Protocol

1. Preparazione chimica

1. Preparazione e conservazione di PLL-g-PEG-Biotin e avidina:
   1. Sciogliere il polimero PLL-g-PEG-biotina nel tampone PBS secondo le indicazioni del produttore ad una concentrazione di 1,0 mg/ml.
   2. Aliquota in base alle dimensioni delle copertine (cfr. tabella 1) e conservare a -80 °C per un massimo di un anno.
2. Preparazione e conservazione di Avidin/NeutrAvidin
   1. Sciogliere l'Avidin/NeutrAvidin senza etichetta in tampone PBS secondo le indicazioni del produttore ad una concentrazione di 1,0 mg/ml.
   2. Aliquota in base alle dimensioni delle copertine (cfr. tabella 1) e conservare a -20 °C per un massimo di 3 anni.
3. Preparazione del campione di virus: Preparare campioni di virus in base alle esigenze sperimentali e al protocollo di laboratorio prima di questo test. Utilizzare il passaggio 1.3.1 per il metodo 5A o 1.3.2 per il metodo 5B.
   1. Preparare campioni di virus per il metodo 5A prima della fase 2. Utilizzare campioni virali preparati entro 1-2 giorni dalla preparazione o aliquota in base alle dimensioni dello slittamento di copertura (vedi tabella 1),quindi congelare flash nell'azoto liquido e conservare a -80 °C per un massimo di un anno. Quando viene scongelato, utilizzare immediatamente.
   2. Preparare campioni di virus per il metodo 5B simile al 1.3.1. Scongelare le aliquote del virus prima di 5B e conservare a 4 °C non più di 24 ore prima della miscelazione con anticorpi.
4. Preparare anticorpi biotinilati appropriati per l'esperimento.

2. Pulizia delle labbra in preparazione al trattamento chimico

1. Posizionare le copertine in un rack di coprilipani in teflon di dimensioni appropriato che le trattiene in orientamento verticale e immergerle in un bicchiere riempito con alcol etilico filtrato (0,2 μm) (190 prove).
2. Sonicare i coprispagini nell'alcol etilico filtrato (190 prove) per 30 minuti.
3. Rimuovere ampiamente i copripasci dall'alcol e sciacquare ampiamente le coperture con acqua ultrapura.
4. Posizionare le copertine risciacquate in un rack in Teflon pulito separato e un becher riempito con 1 M NaOH.
5. Sonicare i copriparsi nel NaOH da 1 M per 30 minuti.
6. Rimuovere i copripasta da NaOH e sciacquarli ampiamente con acqua ultrapura.
7. Asciugare le coperture risciacquate con un flusso di azoto e posizionarle in un rack in teflon pulito e asciutto.
8. Ispezionare le copertine per eventuali pellicole o particelle visibili che rimangono sulla coverlip. Se rimane materiale visibile, il copripava non è stato adeguatamente pulito e risciacquato. Se non correttamente puliti ripetere i passaggi 2.1-2.7.
9. Pulire le coverlips con ossigeno-plasma per 2 min. Questo passaggio è facoltativo ma consigliato.

3. Formazione dello strato di film sottile PLL-g-PEG

1. Immediatamente dopo l'essiccazione nel flusso di azoto (o nel plasma di ossigeno opzionale), posizionare uno coverslip orizzontalmente in una piastra di Petri sterile. Pipetta al centro del coperchio una quantità appropriata di PLL-g-PEG-biotina tamponata PBS scongelata (vedere tabella 1).
2. Posizionare un altro coverslip pulito in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti che questo metodo consiste nel far incubare due coverlips le loro pellicole chimiche orientando le loro "facce attive" trattate chimicamente l'una verso l'altra, separate solo dall'attuale strato chimico. Assicurarsi che vi sia un fluido sufficiente in modo che il volume tra i due copriparsi sia completamente riempito di liquido, ma che non fuoriesi fluidi tra i copripasci (vedere tabella 1). La "faccia attiva" designa d'ora in poi le facce di copra che sono state a contatto con il fluido nella configurazione sandwich.
3. Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min.
4. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e prendere il panino con un paio di pinzette. Fare attenzione a non pizzicare il liquido in eccesso. Utilizzare il pollice e l'indice per pizzicare leggermente il sandwich e far scorrere i copripazzi in direzioni opposte orizzontalmente rispetto all'altro, quindi separare i due copripazzi l'uno dall'altro senza toccare le facce attive.
5. Risciacquare entrambe le facce attive con acqua ultrapura con pipettando 25 ml di acqua ultrapura sulla faccia attiva 2-4x, quindi asciugare le coperture con un flusso di azoto. Assicurarsi di notare quali facce di coprilipano sono attive.
6. Utilizzare immediatamente i copripazzi o conservare O/N con la faccia attiva in una piastra di Petri sterile posta in un ambiente privo di polvere e bassa umidità.

4. Miglioramento dell'associazione Avidin

1. Posizionare un coverslip trattato PLL-g-PEG con faccia attiva in una piastra di Petri sterile.
2. Pipetta una quantità appropriata di avidina scongelata nel tampone (preparata nel passaggio 1.2) al centro della faccia attiva.
3. Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido nel metodo sandwich. Si noti la faccia attiva dei copripaspa. È importante che le facce attive siano a contatto con il fluido durante l'incubazione (vedere fase 3.2).
4. Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 25-30 minuti.
5. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive.
6. Risciacquare entrambe le facce attive con acqua ultrapura con pipettando 25 ml di acqua ultrapura sulla faccia attiva 2-4x e quindi asciugare i copricapo con un flusso di azoto. Si noti la faccia attiva dei copripaspa. Utilizzare immediatamente per la fase successiva.

NOTA IMPORTANTE: Esistono due metodi distinti per completare la preparazione del campione a seconda del tipo di saggio che l'esperimento comporta. Lo sperimentatore deve procedere con lo stadio 5A in cui il virus è ancorato al vetro prima di aggiungere qualsiasi trattamento anticorpale aggiuntivo necessario per l'imaging a super risoluzione. 5B descrive un metodo alternativo per etichettare il virus in soluzione prima di ancorarlo al vetro. I dati rappresentativi di questo manoscritto sono preparati utilizzando il 5A. Un metodo appropriato deve essere selezionato in base al tipo di saggio sperimentale.

5A. Tether anticorpo facciale attivo

1. Immediatamente dopo l'essiccazione con un flusso di azoto nella fase 4.6, posizionare un coverslip trattato con avidina attivo a faccia in su in una piastra di Petri sterile.
2. Pipetta una quantità appropriata di anticorpo biotinilato scongelato in tampone al centro della faccia attiva (vedi tabella 1).
3. Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti la faccia attiva dei copripaspa, è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l'incubazione (vedere fase 3.2.).
4. Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min.
5. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive.
6. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS pipettando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x, non asciugare e utilizzare immediatamente. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive.
7. Posizionare un coverslip attivo trattato con anticorpi a faccia in su in una piastra di Petri sterile e pipettare una quantità appropriata di virus scongelato nel tampone al centro della faccia attiva.
8. Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti la faccia attiva, poiché è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l'incubazione (vedere fase 3.2.).
9. Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min.
10. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive.
11. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS tubazionando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x. Non asciugare i copriletti, invece metterli in un rack in teflon e un becher riempito immediatamente con PBS. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive.
12. Utilizzare immediatamente i campioni preparati o conservare in un buffer appropriato a 4 °C per un massimo di tre giorni senza perdita significativa di integrità.
    
    Nota importante: Se i campioni devono essere utilizzati in un saggio AFM, la preparazione è completa e possono essere utilizzati immediatamente o conservati come descritto nel passaggio 5A.20 - 5A.21. Se i campioni devono essere utilizzati in un saggio di imaging a fluorescenza a super-risoluzione, procedere all'etichettatura degli anticorpi descritta nei passaggi 5A.12 - 5A.19.
13. Posizionare entrambi i coprisci virali attivi a faccia in su in una piastra di Petri sterile e pipettare abbastanza tampone di blocco proteico sui copripavimenti per perline abbastanza volume di fluido da coprire il 95% centrale del coverslip senza scorrere alcun tampone di blocco dal coverslip (in genere 100 - 200 μl.) Incubare a RT per 60-90 min.
14. Rimuovere con cura il tampone di blocco rimuovendo i copriletti uno alla volta dalla piastra di Petri e versando il fluido dal coverslip in un becher di scarto. Fare attenzione a non far cadere il coverslip.
15. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS pipettando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x, non asciugare e utilizzare immediatamente. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive.
16. Posizionare un singolo tampone di blocco trattato coverlip attivo a faccia in su in una piastra di Petri sterile, e pipettare una quantità appropriata di anticorpo virale etichettato fluorescentmente nel tampone al centro del viso attivo.
17. Posizionare un altro copripasto (faccia attiva verso il basso) sopra il fluido in un metodo sandwich. Si noti quale faccia è attiva, è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l'incubazione (vedere fase 3.2).
18. Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul panino con coverlip e incubare a RT per 30 minuti.
19. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive.
20. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS pipettando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x, non asciugare e utilizzare immediatamente. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive.
21. Non asciugare i copricapo, invece metterli in un rack in teflon all'interno di un becher pieno di PBS. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive.
22. Utilizzare immediatamente i campioni preparati o conservare in un buffer appropriato a 4 °C per un massimo di tre giorni senza perdita significativa di integrità.

5B. In soluzione Attacco anticorpale

Questo metodo è un miglioramento opzionale della strategia di etichettatura per l'imaging fluorescente a super risoluzione. Applicando l'attacco in soluzione, è possibile ottenere un migliore rivestimento anticorpale sulla superficie virale.

1. Mescolare le soluzioni anticorpali in rapporti in base alle esigenze degli esperimenti. Il rapporto 1:4 di 0,01 mg/ml di anticorpo biotinilato a 0,01 mg/ml di anticorpo con etichetta fluorescente darà una buona affinità di legame e consentirà un buon recupero dell'involucro in un test di imaging a super risoluzione.
2. Mescolare porzioni uguali delle soluzioni anticorpali e virali preparate rispettivamente in (5B.1) e (1.3). Mescolare delicatamente pipettando su e giù alcune volte nell'aliquota. Questa soluzione risultante può essere conservata fino a quando necessario fino a 24 ore a 4 °C.
3. Al termine del passaggio 4.6, posizionare un coverslip trattato con avidin con faccia attiva in una piastra di Petri sterile.
4. Pipettare una quantità appropriata di virus con soluzione anticorpale (preparata nel passaggio 5B.2) al centro della faccia attiva.
5. Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti la faccia attiva, poiché è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l'incubazione (vedere fase 3.2).
6. Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min.
7. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive.
8. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS tubazionando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x. Non asciugare i copriletti, invece metterli in un rack in teflon e un becher riempito immediatamente con PBS. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive.
9. Utilizzare immediatamente campioni preparati o conservare a 4 °C per un massimo di tre giorni senza perdita significativa di integrità.

6. Misurazione della proprietà del materiale di microscopia a forza atomica

1. Accendere i laser AFM e aprire il software AFM. Selezionare la modalità di scansione appropriata per il saggio desiderato dalla finestra di dialogo di apertura. Tutte le finestre necessarie devono aprirsi per impostazione predefinita; in caso di apertura delle finestre desiderate, se non consultare il manuale dell'utente.
2. Selezionare un sbalzino appropriato alla misurazione desiderata e inserirlo nell'alloggiamento a sbalzi in base alle linee guida del produttore. Esistono una vasta gamma di condizioni e tipi di esperimenti per i quali esistono una varietà di cantilevers. Lo sperimentatore dovrebbe ricercare i cantilevers in base alle loro esigenze.
3. Inserire l'alloggiamento a sbalzi nella testa AFM secondo le linee guida del produttore.
4. Se il campione deve essere utilizzato in condizioni di bagnato, rimuovere il campione dal buffer di archiviazione e procedere al passaggio 6.7.
5. Se il campione deve essere utilizzato in condizioni ambientali (asciutte), rimuovere il campione dal suo tampone di stoccaggio e risciacquarlo brevemente immergersi in un bicchiere di acqua ultrapura. Nota: Questo lascerà un sottile strato di idratazione sul campione che può indurre attrazione capillare con slitti con una bassa costante primaverile.
6. Se il campione deve essere utilizzato in condizioni ambientali (asciutte), asciugare delicatamente il campione con un flusso di azoto.
7. Asciugare delicatamente il lato posteriore del coperchio con una carta filtrante priva di polvere, assicurandosi di non toccare la faccia attiva del campione.
8. Posizionare il campione nel portacampioni AFM appropriato, quindi posizionare il campione sullo stadio AFM.
9. Se il campione deve essere immaginato in condizioni di bagnato, pipettare una piccola quantità di tampone al centro del campione (~10 μl).
10. Posizionare la testa AFM sopra il campione.
11. Se il campione è bagnato, assicurarsi che il sbalzino e la punta AFM penetrino nel livello superficiale e che non vi siano bolle tra l'alloggiamento a sbalzi e a sbalzi.
12. Allineare il laser AFM con il cantilever in conformità con le raccomandazioni del produttore al fine di ottenere il segnale ottimale.
13. Misurare la frequenza risonante a sbalzi e impostare la frequenza di scansione in base al tipo di esperimento.
14. Abbassare la punta AFM sulla superficie e ottimizzare le impostazioni del segnale.
15. Eseguire una scansione AFM quadrata di 20 μm nella modalità di tua scelta. La modalità di maschiatura (CA) è stata utilizzata per generare dati rappresentativi. Identificare i candidati al virus per altezza approssimativa, che in genere può essere vista come punte affilate sulla superficie del vetro.
16. Selezionare un candidato al virus e centrare la testa di scansione sopra di esso.
17. Eseguire una scansione quadrata di 250 nm (o un'analisi di super-risoluzione appropriata) sul virus selezionato per ottenerne la topologia e l'orientamento.
18. Selezionare un punto sul virus per la misurazione della proprietà del materiale(ad esempio il centro di un virus sferico per la misurazione del modulo di un Giovane) ed eseguire la misurazione in base alle indicazioni del produttore.

7. Metodo di imaging a super risoluzione

1. Aprire il software di imaging a super risoluzione e calibrare il software in base alle linee guida del produttore.
2. Calibrare l'apparecchiatura di imaging a super risoluzione in base alle indicazioni del produttore utilizzando perline fluorescenti.
3. Assemblare il tampone di imaging del campione dalle scorte poco prima dell'imaging combinando 50 μl di 1 M MEA e 100 μl da 10x Gloxy a 850 μl di stock buffer. Mantenere il buffer di imaging sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.
4. Rimuovere un coverslip preparato con il campione dal suo tampone di stoccaggio e risciacquarlo 5 volte immergerlo in un bicchiere di acqua ultrapura.
5. Asciugare la faccia non inattiva delle coperture utilizzando una carta filtrante priva di polvere. Assicurati di non toccare il viso attivo.
6. Inserire in un supporto per campioni del sistema di imaging e aggiungere 250 μl di tampone di imaging al portacampioni. È ragionevole scambiare il buffer di imaging sul campione ogni 2 ore per mantenere risultati coerenti.
7. Coprire il portacampioni con parafilm per ridurre l'interazione atmosferica con l'ambiente della stanza.
8. Posizionare il portacampioni nell'apparecchiatura di imaging per l'imaging.
9. Mettere a fuoco il campione utilizzando le indicazioni del produttore.
10. Immagini il campione in base alla tecnica di super-risoluzione utilizzata. Assicurati di regolare le condizioni di imaging per ottimizzare il segnale riducendo al contempo le attivazioni simultanee dei fluorofori foto commutabili.
    
    NOTA IMPORTANTE: Le condizioni di imaging dipendono dal campione e variano in base alle esigenze sperimentali. Un tipico esperimento che utilizza Alexa 647 inizializzato in modo efficiente sul loro stato scuro nel buffer di imaging può quindi essere attivato dalla foto tramite l'applicazione della luce UV a 405 nm. Le immagini sono ottenute eccitanti da un sottoinsieme sparso di molecole di Alexa 647 all'interno di un campione densamente etichettato e localizzando ogni fluoroforo con una precisione limitata principalmente dal numero di fotoni raccolti. Questa procedura viene iterata ripetutamente dal software fino a quando non si è verificato un numero desiderato di cicli di acquisizione. Lo sperimentatore deve avere questa impostazione correlata a ogni fluoroforo nel campione che è stato foto-sbiancato.
11. Al termine dell'imaging, spegnere l'apparecchiatura di imaging in base alle indicazioni del produttore. Il software può essere lasciato aperto per l'analisi dei dati.
12. L'analisi dei dati dipende fortemente dall'esperimento; tuttavia, in tutti i casi identificare i virus per tutta la loro larghezza alla metà del massimo, che viene confrontato con le dimensioni del virus note, assicurandosi di prendere in considerazione le dimensioni aggiuntive delle etichette fluorescenti.
13. Per una migliore visualizzazione, visualizzare gli esempi utilizzando l'opzione di rendering Isosurface o l'opzione di rendering volumetrico, entrambi in genere presenti nel software di imaging a super risoluzione.

Results

Imaging a virione singolo con AFM:

Il protocollo di preparazione del campione sopra descritto è stato utilizzato per ancorare virioni di tipo selvaggio alla superficie del vetro. I virioni VSV hanno una lunghezza di 180 nm a forma di proiettile e un diametro di 80 nm. Poiché ci sono una varietà di virioni per i quali questa tecnica può essere applicata, il concetto è dimostrato anche qui sulle perline biotinilate a 36 nm. Gli esperimenti AFM risultanti sono riportati nella figura 1. È importante notare che i virioni VSV hanno un modulo di Young inferiore (100 MPa) rispetto ai virus non ineveloped (GPa). Le particolari immagini del vv a virione singolo sono state ottenute in modalità di maschiatura in condizioni ambientali con un rigido sbalzino. Lo scopo è stato quello di deformare il virus al punto che la densità proteica extra all'interno del virus diventa visibile come un urto all'interno dell'immagine AFM. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la densità proteica extra all'interno della cavità del virus¹⁹.

Imaging a super risoluzione virione singola:

Gli anticorpi VSV-G etichettati Alexa 647 sono stati usati per rivestire l'involucro dei singoli virioni VSV per esperimenti di super-risoluzione utilizzando il metodo 5A. Per dimostrare la densità di tethering e la bassa associazione aspecifica, nella figura 2Aviene illustrata una scansione di grandi dimensioni del campione. Il recupero della busta virale su un virione rappresentativo è mostrato nella figura 2B (isosuperficie blu).

Figura 1. Imaging AFM di perline e VSV sulla superficie PEGG funzionalizzata. Scansione AFM di perline biotinilate a 36 nm (A, B) e un virione VSV (C) ancorato alla superficie con un anticorpo VSVG biotinilato. AFM è stato fatto in modalità di scansione topografica dell'aria CA. Il raggio della punta è < 25 nm e le misurazioni sono state effettuate sotto modulazione di forza e maschiatura della luce. La punta aveva una costante di forza di 3 N/m e una frequenza risonante di 75 kHz con incertezza di 15 kHz. Mentre le perline hanno mantenuto la loro altezza durante la scansione AFM, il virion VSV ha un modulo giovane significativamente più piccolo ed è significativamente deformato in altezza. In questa immagine il virione è stato specificamente immaginato con un cantilever rigido in modalità di maschiatura che ha prodotto una piccola convoluzione xy (utilizzata per determinare la punta rispetto all'estremità smussata del virus) e la differenza di altezza tra la punta e l'estremità smussata del virus viene utilizzata per rilevare una densità proteica extra all'estremità smussata del virus¹⁹.

Figura 2. Imaging basato sulla fluorescenza dei virioni VSV sulla superficie funzionalizzata PEGG. A)virioni VSV ricombinanti immobilizzati sulla superficie PEGG utilizzando un anticorpo anti VSVG biotinilato imageizzato in fluorescenza a campo largo. B) Ricostruzione a fluorescenza ad alta risoluzione dell'involucro di VSV attaccato alla superficie PEGG attraverso un anticorpo anti VSVG biotinilato e decorato con anticorpi anti-VSVG etichettati Alexa 647 (il metodo 5A è stato utilizzato per creare queste immagini). La superficie blu è una proiezione isosuperficie 2D. A sinistra mostra un modello del virus a forma di proiettile. 

Dimensioni delle copertine	fluido
40 mm	65 μl
35 mm	50 μl
30 mm	36 μl
25 mm	25 μl
20 mm	16 μl

La tabella 1. Aliquote fluide in base alle dimensioni delle copertine.

Discussion

L'imaging a virione singolo con AFM e l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione può essere utilizzato come metodologia alternativa alla tomografia CryoEM. Ognuna di queste metodologie ha i suoi punti di forza specifici. Ad esempio AFM può essere fatto su virioni WT senza alcun requisito per etichettare il campione o le proteine virali interne. La posizione delle strutture virali è deconvolta dai loro contributi alle proprietà elastiche del virione.

L'imaging a super-risoluzione virione singola in combinazione con i nuovi approcci genetici inversi virali diventa una tecnica potente per localizzare proteine virali a basso numero di copie²⁰. I virus ricombinanti con la sostituzione delle loro proteine con proteine fuse con proteine fluorescenti possono essere prodotti e purificati utilizzando questi approcci genetici inversi. Sebbene l'imaging a super-risoluzione abbia specificità in parte a causa del tagging genetico, richiede l'uso dei virus mutanti.

AFM e imaging a super risoluzione sono metodi gratuiti che utilizzano preparazioni campione molto simili. I metodi delineati in questo documento, che sono adottati da precedenti test di imaging a singola molecola, consentono l'ancoraggio di singoli virioni con pochi effetti sulla topologia dei virioni.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vetrini coprioggetti in vetro (fPALM)	Servizi di microscopia elettronica	72225-01	Vetrini coprioggetti da 25 mm
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotina (20%)	SuSoS-Stock		: 0,5 mg/ml in PBS
NeutrAvidin proteina legante la biotina	Invitrogen	A2666	Stock: 0,25 mg/ml in PBS
Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG (H+L)	Invitrogen	A21245	1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% glicole, pH 7,2 tampone
α-VSV-G	Invitrogen	ab34774	1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% glicole, tampone pH 7,2
Gluox	Sigma	G2133-250KU	Glucosio ossidasi tipo sette da Aspergillius
Catalasi	Sigma	C40-100mg	Catalasi da fegato bovino
MEA	Sigma	30070-10G	Cisteamina (tampone
			50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10% glucosio
NTE			10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA
Slide-A-Lyzer, mini unità di dialisi	Thermo Scientific		10.000 MW
Vetro di copertura del microscopio: 35 CIRCLE #1	Fisherbrand	35 CIRCLE #1