Metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di rifiuti delle cartiere e caratterizzazione del potenziale di biodegradazione dei microbi coltivati

Sommario

I rifiuti industriali possono essere raccolti e modificati per analizzare la crescita microbica. Le tecniche di estrazione della lignocellulosa forniscono componenti per analizzare la capacità di biodegradazione specifica. La gascromatografia-spettrometria di massa identifica i prodotti di fermentazione di microrganismi cresciuti sugli scarti della pasta di legno. Questi metodi determinano la capacità metabolica dei microrganismi di degradare gli scarti della pasta di legno.

Abstract

Il processo kraft viene applicato ai trucioli di legno per la separazione della lignina dai polisaccaridi all'interno della lignocellulosa per la cellulosa che produrrà una carta di alta qualità. Il black liquor è uno scarto di pasta di legno generato dal processo kraft che ha un potenziale di bioconversione a valle. Tuttavia, la natura recalcitrante delle risorse lignocellulosiche, i suoi derivati chimici che costituiscono la maggior parte del carbonio organico disponibile all'interno del black liquor e il suo pH basico presentano sfide per la biodegradazione microbica di questo materiale di scarto. I metodi per la raccolta e la modifica del black liquor per la crescita microbica mirano all'utilizzo di questi scarti di polpa per convertire la lignina, gli acidi organici e i sottoprodotti della degradazione dei polisaccaridi in sostanze chimiche preziose. Le tecniche di estrazione della lignocellulosa presentate forniscono un metodo riproducibile per la preparazione di substrati di crescita della lignocellulosa per comprendere le capacità metaboliche dei microrganismi in coltura. L'uso della gascromatografia-spettrometria di massa consente l'identificazione e la quantificazione dei prodotti di fermentazione derivanti dalla crescita di microrganismi sugli scarti della pasta di legno. Questi metodi, se usati insieme, possono facilitare la determinazione dell'attività metabolica dei microrganismi con il potenziale di produrre prodotti di fermentazione che fornirebbero un valore maggiore al sistema di spappolamento e ridurrebbero gli sprechi di effluenti, aumentando così i potenziali profitti della macinazione della carta e offrendo ulteriori usi per il liquor nero.

Introduzione

La spappolatura del legno è un processo chimicamente intensivo che è stato ottimizzato nel corso di molti anni per creare un sistema con il minimo spreco. Tuttavia, alcuni risultati di questo processo potrebbero essere utilizzati per produrre prodotti di valore superiore. Il liquore nero è uno di questi esempi. Viene generato dal processo kraft, che è il metodo di produzione chimico dominante, che rappresenta l'85% della produzione mondiale di lignina¹. Il processo kraft (Figura 1) utilizza la temperatura (160-200 °C), la pressione (120 psig) e le sostanze chimiche contenute nel liquor bianco (idrossido di sodio e solfuro di sodio) per sciogliere la lignina dalle fibre di legno^2,3. Il liquor nero contiene lignina, acidi organici e sottoprodotti della degradazione dei polisaccaridi⁴. Viene incenerito per produrre vapore e recuperare sostanze chimiche nella caldaia di recupero che fornisce energia termica per i processi di produzione della carta e pasta di legno a valle. Il volume di liscivio nero generato dalla polpa può superare la quantità che la caldaia di recupero può elaborare efficacemente. Smaltire il liquor nero come effluente influisce negativamente sulla flora e la fauna acquatica e quindi non è un'opzione. L'applicazione di organismi microbici che potrebbero utilizzare il black liquor per la crescita sarebbe vantaggiosa in termini di aumento del recupero chimico e della generazione di prodotti a valore aggiunto che migliorerebbero l'analisi complessiva del ciclo di vita del sistema di spappolamento. La conversione chimica e biologica dei monomeri derivati dalla lignina ha prodotto con successo vanillina e acido cinnamico da utilizzare come dolcificanti alimentari e additivi per fragranze, fenolo utilizzato per plastica e resine e cicloesano, che potrebbe essere utilizzato come carburante⁵.

Il lavoro precedente sulla biodegradazione di questi scarti di cellulosa si è concentrato sulla depolimerizzazione della lignina. L'International Lignin Institute (ILI) riferisce che ogni anno vengono prodotte tra i 40 e i 50 milioni di tonnellate di lignina (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Solo l'1,5% di quella lignina viene utilizzato per processi industriali commerciali⁶. La depolimerizzazione della lignina da parte degli enzimi laccasi e perossidasi prodotta dai funghi del marciume bianco dei generi Phanerochaete e Trametes è stata studiata a lungo⁷. Anche i batteri del suolo noti per degradare i composti aromatici come Nocardia e Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ e Streptomyces viridosporus T7A¹⁰ hanno dimostrato di essere in grado di degradare la lignina. La degradazione batterica degli scarti della pasta di legno è promettente perché alcuni batteri possono prosperare nelle condizioni saline e alcaline (pH 10-14) che caratterizzano gli effluenti degli scarti della pasta¹¹. Mentre la lignina è il componente principale del liquor nero, i microrganismi possono anche degradare gli altri componenti che compongono il liquor nero. Queste tecniche non identificano esclusivamente i microrganismi che degradano la lignina, ma servono a identificare i microrganismi che possono essere applicati direttamente al liquor nero di scarto della pasta invece dei suoi costituenti ulteriormente lavorati.

Il liquore nero è stato raccolto e modificato per la crescita microbica attraverso la neutralizzazione e la sterilizzazione con filtro. I requisiti di crescita microbica per un isolato microbico ambientale sono stati identificati mediante esperimenti di crescita minima su componenti lignocellulosici prodotti da un nuovo protocollo di estrazione della lignocellulosa. I terreni di crescita sono stati analizzati mediante gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) per determinare i prodotti metabolici dell'isolato microbico ambientale quando coltivato su liscivio nero come unica fonte di carbonio. La combinazione di queste tecniche fornisce uno strumento di valutazione per determinare la capacità metabolica di un microrganismo quando viene coltivato su scarti di cartiera come il liquor nero. L'uso di tali tecniche offre anche informazioni sul valore dell'applicazione di microrganismi specifici ai rifiuti delle cartiere per la generazione di sottoprodotti.

Protocollo

1. Raccolta di liquore nero e preparazione di liquore nero per colture di crescita

1. Raccogliere un campione di liquore nero dalla valvola di uscita collegata al digestore kraft in una bottiglia di vetro sterile e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere con i seguenti passaggi.
   neutralizzazione
2. Aggiungere 100 ml di campione di liquore nero in un becher da 500 ml dotato di una barra di agitazione.
3. Posizionare il bicchiere su una piastra per mescolare e regolare la velocità su media.
4. Aggiungere lentamente gocce di acido fosforico fino a quando il liquor nero diventa viscoso (viscosità simile al glicerolo).
5. Aliquotare tutta la soluzione di liquore nero versandola lentamente in provette coniche da 50 ml e centrifugare a 9,300 x g per 30 minuti.
6. Posizionare il surnatante nel becher e misurare il pH utilizzando i nastri per il test del pH. Il pellet di lignina precipitata può essere scartato e trattato come rifiuto solido non pericoloso.
7. Continuare ad aggiungere acido fosforico e centrifugare la soluzione fino a quando le strisce di pH indicano un pH neutro del surnatante.
   sterilizzazione
8. Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere eventuali batteri contaminanti e posizionare la soluzione filtrata in un contenitore sterile per la conservazione. Conservare a temperatura ambiente.

2. Estrazione della lignocellulosa

Separazione dei carboidrati

1. Mettere 5 g di panico verga, pino o erba delle Bermuda (macinata con particelle di 1 mm o inferiore) in un pallone di Erlenmeyer da 500 ml. Quindi aggiungere 200 ml di acqua distillata o deionizzata, 7,5 g di NaClO₂, 2,5 ml di acido acetico glaciale e una barra di agitazione al pallone.
2. Immergere il pallone in un bagno d'olio posto sopra una piastra di agitazione a 80 °C per 1 ora. Regolare la velocità della piastra di agitazione su media.
3. Aggiungere altri 7,5 g di NaClO₂ e 2,5 ml di acido acetico glaciale al pallone. Continuare a mescolare a 80 °C nel bagno d'olio per 30 min.
4. Ripetere il passaggio precedente 2 volte (Nota: un totale di 30 g di NaClO₂ e 10 ml di acido acetico glaciale vengono aggiunti al pallone contenente la biomassa lignocellulosica). Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
5. Mettere un foglio di carta da filtro in un imbuto Büchner. Posizionare l'imbuto sopra un pallone a braccio laterale e fissarlo a un aspirapolvere.
6. Versare lentamente la soluzione nell'imbuto.
7. Lavare il materiale solido 3 volte con 100 ml di acqua distillata o deionizzata. Scartare il filtrato dopo aver lavato il materiale solido.
8. Mettere da parte 1 g di materiale solido e posizionarlo su un foglio di carta da filtro pulito.
9. Asciugare questo materiale solido per una notte in un forno a 50 °C. Dopo aver tolto il campione dal forno, metterlo in una fiala con l'etichetta "olocellulosa".
10. Aggiungere il materiale solido rimanente a 250 ml di NaOH al 10% (v/v) in un matraccio di Erlenmeyer da 500 ml. Tappare il pallone con un tappo.
11. Porre la soluzione in un'incubatrice a 70 °C per 1 ora agitando a 250 giri/min.
12. Raffreddare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente.
13. Rimuovere il materiale solido utilizzando carta da filtro e imbuto Büchner fissato a un pallone a braccio laterale.
14. Trasferire il materiale solido su un foglio pulito di carta da filtro in un forno a 50 °C e lasciarlo asciugare per una notte.
15. Dopo che il residuo si è asciugato, metterlo in una fiala di conservazione ed etichettarlo come "cellulosa".
16. Trasferire il filtrato dal punto 2.13 in un matraccio di Erlenmeyer da 500 ml e aggiungere 30 ml di acido acetico e 250 ml di alcol isopropilico. Tappare il pallone e posizionare la soluzione sul piano di lavoro per almeno 8 ore a temperatura ambiente.
17. Trasferire tutta la soluzione in provette coniche da 50 ml e centrifugare la soluzione a 9.300 x g per 30 minuti. Pipettare con cura la soluzione dalla provetta conica e gettarla.
18. Risospendere il pellet in 30 ml di acqua distillata o deionizzata mediante vortex.
19. Ripetere i passaggi 2.17-2.18 15 volte per lavare accuratamente il pellet.
20. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet per la liofilizzazione. Una volta liofilizzato, raccogliere il campione e metterlo in una fiala etichettata "emicellulosa".
    Separazione della lignina
    Protocollo di separazione della lignina basato su Karaaslan et al. ¹²
21. Aggiungere 5 g di panico verga, pino o erba delle Bermuda (macinata a particelle di 1 mm o inferiore) a 500 ml di una soluzione di NaOH 0,25 M e etanolo al 30%. Porre il liquame in un'incubatrice a 75 °C con agitazione a 250 giri/min per 2 ore.
22. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
23. Mettere un foglio di carta da filtro in un imbuto Büchner sopra un pallone a braccio laterale. Collegare a un aspirapolvere e versare lentamente la soluzione nell'imbuto.
24. Scartare il materiale solido.
25. Aggiungere un'ancoretta al pallone contenente il filtrato e posizionare il pallone sopra una piastra di agitazione regolata a velocità media. Aggiungere acido cloridrico concentrato goccia a goccia alla soluzione fino ad ottenere un pH di 2,0 (circa 20 ml).
26. Lasciare riposare la soluzione acidificata per una notte a temperatura ambiente.
27. Centrifugare la soluzione a 9.300 x g per 30 minuti in provette coniche. Pipettare con cura la soluzione dal tubo conico e gettarla.
28. Risospendere il pellet in 30 ml di acqua distillata o deionizzata mediante vortex.
29. Ripetere i passaggi 2.27-2.28 15 volte per lavare accuratamente il pellet.
30. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e conservare il pellet per la liofilizzazione. Una volta liofilizzato, posizionare il campione in una fiala etichettata come "lignina".

3. Preparazione di colture microbiche per la crescita

Piastre di agar

1. Aggiungere lo 0,2% (p/v) di prodotti sterili per l'estrazione della lignocellulosa al terreno minimo M9^{da 13} agar prima di versare le piastre.
2. Piastre solidificate a strisciamento con circa 200 ul di coltura batterica coltivata in terreno minimo M9 con un diametro esterno di circa 2,0.
3. Incubare le piastre a 37 °C e monitorare la crescita.
   Colture liquide
4. Aggiungere 50 ml di terreno sterile Luria-Bertani (LB)¹³ o M9 minimo¹³ in un pallone sterile da 125 ml. Aggiungere liquor nero al 10% (v/v) o allo 0,2% (p/v) di prodotti di estrazione della lignocellulosa.
5. Inoculare il terreno con lo 0,1% (v/v) di una coltura batterica con un O.D. di circa 2,0.
6. Incubare le colture a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
7. Valutare la crescita ogni 6 ore durante il periodo di coltura misurando la densità ottica (λ = 600 nm). Mettere un'aliquota di 1 ml di coltura in una cuvetta. Determinare la densità ottica della coltura oscurata rispetto a terreni non inoculati.
8. Trasferire i batteri in un flacone di siero anaerobico a metà della fase logaritmica.
   1. Per preparare il flacone di siero anaerobico: sigillare il flacone di siero con un tappo di gomma butilica e un tappo a crimpare in alluminio in condizioni aerobiche e in autoclave. Non modificare lo spazio di testa all'interno del flacone del siero dopo la sterilizzazione.
   2. Trasferire l'intera coltura da 50 ml dal pallone da 125 ml nel flacone di siero sterile sigillato utilizzando una siringa.
   3. Incubare a 37 °C agitando a 200 giri/min.

4. Preparazione del campione per GC-MS

Prepara i campioni secondo Raj, Reddy e Chandra¹⁴. Il controllo negativo utilizzato per il confronto è costituito da un terreno minimo M9 con il 10% di liquore nero ed è anche indicato come campione non inoculato.

1. Centrifugare colture batteriche non inoculate e inoculate (50 ml) a 9.300 x g per 30 minuti dopo 450 ore di incubazione.
2. Trasferire 10 ml di surnatante in una provetta di vetro. (Nota: la plastica è incompatibile con le sostanze chimiche nei passaggi seguenti.)
3. Acidificare il surnatante con HCl concentrato a pH 1-2.
4. Aggiungere 3 volumi di acetato di etile (30 ml), tappare il tubo e mescolare capovolgendo 4-6x.
5. Mettere una piccola quantità di Na₂SO₄ anidro (1-2 g) in una provetta di vetro pulita.
6. Raccogliere con cura lo strato organico (in alto) dalla soluzione di acetato di etile pipettandolo con una pipetta monouso in vetro Pasteur.
7. Posizionare lo strato organico nella provetta con Na₂SO₄ anidro.
8. Disidratare lo strato organico su Na₂SO₄ anidro picchiettando delicatamente la provetta per mescolare. Aggiungere gradualmente piccole quantità di Na₂SO₄anidro e mescolare fino a quando non ci sono grossi grumi.
9. Mettere un foglio di carta da filtro in un imbuto Büchner sopra un pallone a braccio laterale fissato a un aspirapolvere.
10. Versare la soluzione nell'imbuto. Scartare il materiale solido.
11. Trasferire la soluzione in un pallone di evaporazione e far evaporare il filtrato utilizzando un evaporatore rotante.
12. Introdurre 3 mg di residuo di estrazione dell'acetato di etile in un flaconcino da 2 ml di cromatografia ambrata.
13. Sciogliere il residuo con l'aggiunta di 100 μl di 1,4-diossano e 10 μl di piridina.
14. Aggiungere 50 μl di N,O-Bis(trimetilsilil) trifluoroacetammide con trimetilcolorsilano 99:1% (BSTFA). Porre quindi in un'incubatrice a 60 °C agitando per 15 min.
15. Conservare i campioni a 4 °C fino al momento dell'uso.

5. GC-MS

Equipaggia il gascromatografo (GC) interfacciato con uno spettrometro di massa (MS) con una colonna capillare non polare ed elio come gas di trasporto con una portata di 1 ml/min.

1. Dopo che la temperatura del forno si è stabilizzata a 50 °C, iniettare 1 μl di campione con un rapporto di divisione di 1/50.
2. Tenere la colonna a 50 °C per 5 minuti e aumentare a 280 °C a 5 °C/min. Mantenere la temperatura finale di 280 °C per 20 minuti.
3. Mantenere la linea di trasferimento tra il gascromatografo e lo spettrometro di massa a 300 °C.
4. Selezionare un ritardo del solvente di 15 min.
5. Registrare spettri di massa a ionizzazione elettronica compresi tra 10 e 500 (m/z) con un'energia elettronica di 70 eV.
6. Derivatizzare e cromatografare standard come sopra. Identifica i composti confrontando i tempi di conservazione degli standard acquistati o dei dati nel database spettrale di massa del National Institute of Standards and Technology (NIST).

Risultati

La raccolta e la modifica del liquore nero generato nel processo di spappolamento kraft (Figura 1) consentirà di utilizzare questi scarti di pasta per determinare la capacità di biodegradazione di un singolo isolato batterico o di una coltura mista. La Figura 2 mostra la crescita aerobica misurata dalla densità ottica dell'isolato ambientale microbico coltivato in terreno LB da solo e in terreno LB integrato con il 10% di liquor nero neutralizzato. Questi risultati indicano che questo ba...

Discussione

Questo protocollo descrive una combinazione di tecniche che mira a identificare i microrganismi che possono degradare gli scarti della cellulosa, le fonti di carbonio utilizzate durante la crescita sugli scarti della pasta e i prodotti metabolici microbici prodotti quando vengono coltivati sugli scarti della cellulosa. Abbiamo dimostrato il successo di questo protocollo con l'isolato microbico ambientale: un anaerobo facoltativo che può crescere con il 10% di liscivio nero e utilizzare i componenti di estrazione della li...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,4-diossano (certificato ACS)	Fisher	D111	Infiammabile, preossidabile chimico
Black	Liquor Dipartimento di biomateriali forestali presso la North Carolina State University	N/A	pH 12,72, 13,67% di solidi
Etanolo (grado microbiologico)	Fisher	BP2818
Acetato di etile (grado di reagente ACS)	EMD	EX0240-9	Infiammabile
Acido acetico glaciale (Certificato ACS)	EMD	AX0073	Guaiacolo corrosivo
	Sigma Aldrich	PHR1136	Dannoso per ingestione, corrosivo
Colonna capillare HP-5	Agilent	19091J-577	60 m x 0,18 mm diametro interno, 0,18 μ m spessore
Acido cloridrico (certificato ACS)	EMD	HX0603P
N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetammide con trimetilcolorsilano 99:1% (BSTFA)	Fluka	15238	Infiammabile, provoca ustioni cutanee e danni agli occhi con contatto
Na2SO4 (grado FCC)	VWR	BDH8026
NaClO2 (80%)	Sigma Aldrich	244155	Infiammabile, tossico
NaOH (certificato ACS)	EMD	1.06498.1000	Nastri per
il test del pH corrosivo Alkacid		A979
Acido fosforico (certificato ACS)	Spettrometro	A242
Polaris Q	Thermo Electron Corporation
Piridina (99%)	Alfa Aesar	A12005	Infiammabile, tossico a contatto con la pelle
Panico verga	Cherry Research Farm Goldsboro, NC	N/A	Raccolto nell'agosto 2011
Termo Finnigan gascromatografo in tracce	Thermo Electron Corporation
Whatman n. 1 carta da filtro	Whatman	1001-150