Il protocollo qui descritto ha lo scopo di spiegare e abbreviare i numerosi ostacoli nel cammino del percorso intricato portando a nucleosidi trifosfati modificati. Di conseguenza, questo protocollo facilita sia la sintesi di questi blocchi di costruzione attivati e la loro disponibilità per applicazioni pratiche.
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Articolo metodologico
Nucleosidi trifosfati - Dalla sintesi di biochimica Caratterizzazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La strategia tradizionale per l'introduzione di funzionalità chimiche è l'uso di sintesi in fase solida aggiungendo precursori Phosphoramidite opportunamente modificati alla catena nascente. Tuttavia, le condizioni utilizzate durante la sintesi e la restrizione di sequenze piuttosto brevi ostacolano l'applicabilità di questa metodologia. D'altra parte, nucleosidi trifosfati modificati vengono attivati blocchi che sono stati impiegati per l'introduzione mite di numerosi gruppi funzionali in acidi nucleici, una strategia che apre la strada per l'uso di acidi nucleici modificati in una tavolozza ampia di applicazioni pratiche come codifica funzionale e generazione di ribozimi e DNAzymes. Una delle maggiori difficoltà risiede nella complessità della metodologia che porta all'isolamento e caratterizzazione di questi analoghi nucleosidici.
In questo articolo video, presentiamo un protocollo dettagliato per la sintesi di these analoghi modificati utilizzando reagenti a base di fosforo-(III). Inoltre, la procedura per la loro caratterizzazione biochimica di divulgazione, con particolare attenzione alle reazioni del primer e TdT tailing polimerizzazione. Questo protocollo dettagliato sarà di uso per la lavorazione di dNTP modificati e il loro ulteriore utilizzo in biologia chimica.
Introduzione
5'-trifosfato (nucleosidi (d) PTR) rappresentano una classe di biomolecole vitali che sono coinvolti in innumerevoli processi e funzioni che vanno dall'essere la valuta universale di energia regolatori del metabolismo cellulare. Oltre al loro ruolo in queste trasformazioni biologiche fondamentali, loro omologhi modificati hanno avanzato come piattaforma versatile e delicato per l'introduzione di gruppi funzionali in oligonucleotidi, una metodologia che integra piacevolmente la sintesi in fase solida automatizzata che viene solitamente applicato 1,2. Infatti, a condizione che i (d) PTR possono agire come substrati per RNA e DNA polimerasi ....
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Protocollo
1. Sintesi dei nucleosidi trifosfati modificati
L'approccio sintetico prescelto segue la procedura sviluppata da Ludwig e Eckstein poiché questo metodo è generalmente affidabile e porta a pochissimi collaterali prodotti (Figura 1A) 39.
- Coevaporate nucleoside 3'-OAc protetto adeguatamente (tipicamente 0,1 mmol) due volte con piridina anidra (2 ml) e quindi asciugare sotto vuoto durante la notte. Allo stesso tempo, pirofosfato secco tributylammonium (0,13 mmol) sottovuoto durante la notte.
- Sciogliere il nucleoside in un minimo di piridina secca (0,2 ml) e aggiungere diossano secco (0,....
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Risultati
Nucleosidi trifosfati modificati sono seducenti bersagli sintetici in quanto consentono l'introduzione facile di una vasta gamma di gruppi funzionali in acidi nucleici 41. Tuttavia, l'isolamento e la caratterizzazione di questi blocchi attivato viene rivelano spesso ardua. Di conseguenza, i risultati qui indicati sono pensati per fornire una mano per seguire le varie fasi all'interno delle suddette procedure sintetiche e biochimici (Figura 1B).
In part.......
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Discussione
L'inclusione di modifiche in acidi nucleici è di interesse per numerose applicazioni pratiche, tra cui lo sviluppo di agenti antisenso e antigene 42,43, l'etichettatura e tagging funzionale di oligonucleotidi 41, e negli sforzi per espandere l'alfabeto genetico 44-46. Le alterazioni chimiche e gruppi funzionali sono generalmente introdotti in acidi nucleici mediante l'applicazione di protocolli di sintesi in fase solida standard e automatizzati. Tuttavia, i mattoni Phosph.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 e PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann Si ringrazia per la fornitura di spazi e attrezzature di laboratorio, nonché per il suo costante sostegno. La signora Sue Knecht è riconosciuto per le discussioni fruttuose.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pirofosfato di tributilammonio | Sigma Aldrich | P8533 | Solido igroscopico, tenere sotto Ar |
| 2-Cloro-1,3,2-benzodioxafosforina-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Piridina sensibile all'umidità |
| Sigma Aldrich | 82704 | Sotto setacci molecolari | |
| Diossano | Sigma Aldrich | 296309 | Sotto setacci molecolari |
| Dimetilformammide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Sotto setacci molecolari |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | Grado HPLC | |
| Trietilammina | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributilammina | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | acqua deionizzata e purificata, autoclavata in presenza di dietilpirocarbonato (DEPC) | |
| dietilpirocarbonato (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| DNTP naturali | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA polimerasi | NEB | M0257S | |
| DNA polimerasi I, frammento grande (Klenow) | NEB | MO210S | |
| 9° Nm DNA polimerasi | NEB | MO260S | |
| Deossinucleotidiltransferasi terminale (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polimerasi | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrilammide/bisacrilammide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarosio | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter colonna RP-HPLC semipreparativa (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| fiale PCR | Bioconcept | 3220-00 | |
| Sistema HPLC | Amersham Pharmacia Biotech | Ä kta basic 10/100 | |
| Tutti gli oligonucleotidi sono stati acquistati da Microsynth e purificati da PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATGAGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| Ulteriori informazioni sulle procedure sperimentali e sulle attrezzature possono essere trovate nei seguenti articoli: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
Riferimenti
- Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
- Hollenstein, M.
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Ristampe e permessi
