Articolo metodologico

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

16.7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/51387

⸱

23 aprile 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

In questo articolo

Sommario

Complessi proteici Multi-componenti giocano un ruolo cruciale durante la funzione e lo sviluppo cellulare. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare complessi proteina nativa da embrioni di Drosophila in vivo dopo reticolazione seguita da purificazione dei complessi reticolati per successiva analisi struttura-funzione.

Abstract

Molti processi cellulari sono controllati da complessi proteici multisubunit. Spesso questi complessi formano transitoriamente e richiedono ambiente nativo da montare. Pertanto, per identificare questi complessi proteici funzionali, è importante stabilizzarli in vivo prima lisi cellulare e successiva purificazione. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare grandi complessi proteici in buona fede da embrioni di Drosophila. Questo metodo si basa su embrione permeabilizzazione e stabilizzazione dei complessi all'interno degli embrioni in vivo reticolazione usando una bassa concentrazione di formaldeide, che può facilmente attraversare la membrana cellulare. Successivamente, il complesso proteina di interesse è immunopurified seguita da purificazione gel e analizzato mediante spettrometria di massa. Illustriamo questo metodo utilizzando la purificazione di un complesso proteico Tudor, che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale. Tudor è una grande proteina, che contiene più domini Tudor - piccolomoduli che interagiscono con arginine metilate o lysines delle proteine ​​target. Questo metodo può essere adattato per l'isolamento di complessi proteina nativa da organismi e tessuti differenti.

Introduzione

Isolamento delle assemblee proteine ​​multisubunit e-DNA o RNA-proteina complessi viene effettuata per identificare complessi proteici, loci genomici riconosciuto da proteine ​​regolatrici che legano il DNA o RNA target di proteine ​​leganti RNA. Diversi metodi permettono l'identificazione genoma dei siti del DNA riconosciuti da fattori di trascrizione o proteine ​​della cromatina (ChIP-Seq) 1 e gli obiettivi di RNA associate a un determinato RNA-binding protein (CLIP-ss) 2. Le librerie di cDNA RNA derivati ​​da o bersagli di DNA sono poi profondamente sequenziati. Questi metodi utilizzano chimica o indotto da UV reticolazione a regolarizzare i complessi seguita da immunoprecipitazione (IP) con un anticorpo contro un componente proteica del complesso studiato.

Durante lo sviluppo di un organismo, molti complessi proteici formano transitoriamente. Pertanto, è fondamentale per analizzare la composizione e la funzione di questi complessi in vivo per comprendere i meccanismi molecolari che controllano development. Tale analisi in vivo sarebbe superiore al metodo in vitro dato che è praticamente impossibile riprodurre concentrazioni nativi dei componenti interagenti e ambiente biochimico cellulare in vitro. Qui mostriamo un approccio in vivo che usiamo con successo per isolare grandi complessi proteici da embrioni di Drosophila. In questo metodo, complessi proteici negli embrioni viventi sono reticolati con una bassa concentrazione di formaldeide e successivamente complessi proteici di interesse sono isolati da IP con un anticorpo contro un componente noto dei complessi seguita da purificazione gel dei complessi e analisi di spettrometria di massa a identificare i componenti complessi sconosciuti. Poiché formaldeide è in grado di permeare la membrana cellulare e ha un raggio di reticolazione 2.3-2.7 Å 3, complessi proteici possono essere reticolati in vivo e le componenti complessi sono suscettibili di essere vicini l'uno all'altro. In questo articolodescrivere questo metodo usando l'isolamento di Tudor (Tud) complesso proteico come esempio. Tud è una proteina germinale che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale 4-7. Questa proteina contiene 11 domini Tud noti per interagire con arginines denaturato o lysines di altri polipeptidi 8-10.

In precedenza, abbiamo generato una linea di Drosophila transgenica che esprime HA-tagged funzionale Tud 5 e, quindi, specifici anticorpi anti-HA viene utilizzato per abbattere complesso Tud dopo reticolazione.

Oltre a legami crociati tra proteine, formaldeide può generare acido nucleico reticola-proteina e viene usato in esperimenti di ChIP-seq. Inoltre, in Drosophila, in vivo reticolazione con formaldeide ha permesso l'identificazione di un target di RNA di Vasa RNA elicasi proteine ​​11.

Mentre in questo articolo descriviamo un metodo per reticolazione in vivo e purria del complessi proteici da embrioni di Drosophila, questo metodo può essere adattato per altri organismi e tessuti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparare grande mela Piastre Juice-agar

  1. Per fare 4 piastre, aggiungere 375 ml di H 2 O, 11,25 g fly agar e un bar mescolare in un pallone di 1.000 ml. Questo è il Mix A. Autoclave Mix A con il coperchio pallone liberamente ricoperto da un ciclo di 30 min-sterilizzazione per le merci liquide.
  2. Aggiungere 125 ml di succo di mela, 12,5 g di zucchero da tavola e un ancoretta ad un bicchiere da 500 ml. Questo è Mix B. calore Mix B su una piattaforma riscaldata sotto agitazione e mantenere la temperatura a circa 70 ° C fino alla autoclave di Mix A è terminata.
  3. Al completamento di Mix A autoclave, trasferire Mix B Mix A. Continuate a mescolare il composto unito delicatamente e lasciate raffreddare per 15 minuti. Evitare di raffreddamento e la solidificazione agar portato prima dell'aggiunta di conservante.
  4. Prova del 10% (peso / volume) metil 4-idrossibenzoato soluzione in etanolo. Questo agirà come conservante. Aggiungere 3,75 ml della soluzione alla miscela succo-agar mela sopra. Continuate a mescolare per another 5 min.
  5. Versare 125 ml di succo di mela miscela-agar con conservanti in ciascuna di plastica 300 centimetri 2 o lastra di polistirolo. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente e solidificare. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il versamento.
    Nota: Le piastre di agar succo di mela sono pronti per l'uso immediato. Coprire le piastre utilizzate con impacchi chiari e conservare a 4 ° C per un massimo di una settimana.

2. Drosophila Embryo raccolta e il trattamento pre-reticolazione

  1. Caricare una gabbia popolazione con circa 40.000 a 50.000 mosche da cui verranno raccolti embrioni.
  2. Fare due piastre contenenti ciascuno 125 ml di farina di mais-melassa standard, medie 12 e cospargere di circa 4 g di lievito di birra essiccato su ogni piatto. Mettere questi piatti nella gabbia della popolazione in un incubatore a 25 ° C per 48 ore per ingrassare le mosche.
  3. Warm 2 piastre di succo di mela-agar a 25 ° C. Cospargere circa 1 g di lievito di birra essiccato su ognipiatto. Posizionare le 2 piastre nella gabbia popolazione di iniziare a raccogliere 0-1 embrioni hr-old.
  4. Estrarre le piastre alla fine dell'insieme 1 hr. Sostituire con 2 nuove piastre se è necessario un altro giro di raccolta.
  5. Aggiungere acqua sufficiente a coprire le piastre e risospendere gli embrioni delicatamente con un pennello fine. Versare gli embrioni risospeso attraverso un setaccio a doppio strato, fatto di rete metallica in acciaio inox.
    Nota: Lo strato superiore è realizzato in dimensioni medie dei pori (850 micron), maglia che raccoglie gran parte della mosca mentre lascia passare embrioni. Lo strato inferiore è realizzata in maglia fine (75 micron), che raccoglie gli embrioni pur lasciando passare lievito e acqua.
  6. Usare il pennello ammenda di trasferire gli embrioni raccolti in un cestino di raccolta realizzato con un tubo da 50 ml e rete di nylon fine. Sciacquare gli embrioni brevemente con acqua, quindi asciugare la rete su carta assorbente per asciugare.
  7. Immergere gli embrioni nel 50% di candeggina con agitando delicatamente per 3 min. Risciacquare approfonditaly con acqua per rimuovere qualsiasi residuo di candeggina. Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare.
  8. Immergere gli embrioni dechorionated in isopropanolo con leggera agitazione per 15 secondi o fino a quando la ripartizione dei cespi multi-embrione (questo non dovrebbe richiedere più di 30 secondi). Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare completamente.
  9. Immergere gli embrioni in esano per 5 minuti mentre usando una pipetta per lo streaming eptano negli embrioni per tenerli risospeso. Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare.
  10. Lavare gli embrioni con i flussi di Soluzione tampone fosfato, pH 7.4 (PBS) contenente 0,1% Triton X-100 (PBST) per 3 min.
  11. Smontare il cestello di raccolta e trasferire gli embrioni con la maglia di una provetta da 15 ml contenente 10 ml PBST. Capovolgere delicatamente il tubo per lavare gli embrioni fuori la rete.
  12. Rimuovere la maglia dal tubo. Inserire il tubo in posizione verticale e lasciare gli embrioni si depositano sul fondo della provetta per gravità.
    Nota: Circa 100-300microlitri di embrioni è previsto per una raccolta 1 ora da una gabbia.
  13. Rimuovere il PBST e continuare a funzionare reticolazione immediatamente.

3. Nel vivo reticolazione degli embrioni raccolti

  1. Preparare 0,2% di formaldeide in PBST immediatamente prima dell'uso. Aggiungere 10 ml di fissativo formaldeide per gli embrioni e incubare a 25 ° C con agitazione su un agitatore rotante per 10 min. Scartare fissativo inutilizzato alla fine della giornata.
  2. Placare la reazione di reticolazione
    1. Al termine della reticolazione, lasciare che gli embrioni si depositano sul fondo della provetta.
    2. Rimuovere la soluzione di formaldeide. Immediatamente aggiungere 10 ml di 0,25 M glicina in PBST per placare la reazione di reticolazione. Incubare a 25 ° C con agitazione su un agitatore rotante per 5 min.
    3. Affittare gli embrioni si depositano sul fondo della provetta. Rimuovere la soluzione di abbattimento. Lavare gli embrioni con 10 ml di PBST tre volte.
    4. Rimuovere completamente il PSoluzione di lavaggio BST con una pipetta. Conservare embrioni a -80 ° C fino al momento dell'uso.

4. Proteine ​​preparazione del campione e Immunoprecipitation

  1. Omogeneizzare 500 microlitri embrioni reticolati utilizzando un omogeneizzatore Dounce in 2 ml di tampone di lisi (0.5 M urea, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro [PMSF] e cocktail inibitore di proteasi in PBS).
    Nota: Eseguire questa e le seguenti operazioni a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.
  2. Trasferire il lisato a 1,5 ml provette da centrifuga e rock delicatamente su una piattaforma rotante per 15 minuti al fine di garantire lisi approfondita. Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Salvare il surnatante in un ambiente pulito tubo da 15 ml.
  3. Aggiungere 40 microlitri anti-HA agarosio impasto nel surnatante e incubare su piattaforma rotante per 2,5 ore.
  4. Agglomerare le perline per centrifugazione a 2500 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante ma lasciare approximately 250 microlitri nel tubo. Risospendere le sfere nel surnatante rimanente e trasferire in una colonna di spin 1,5 ml con 10 micron di filtro pori.
  5. Centrifugare la colonna di spin a 12.000 xg per 10 secondi e scartare il flusso attraverso.
  6. Lavare le perline aggiungendo 200 microlitri di tampone di lavaggio (0,1 M glicina, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20, in PBS). Centrifugare la colonna a 12.000 xg per 10 secondi e scartare il lavaggio. Ripetere il lavaggio altre due volte.
  7. Aggiungere 40 microlitri tampone di eluizione (2 mg / ml di HA-peptide in PBS) per le perline e incubare a 37 ° C per 15 minuti con agitazione ogni 5 min. Centrifugare la colonna a 12.000 xg per 10 sec e raccogliere l'eluato.
  8. Confermare eluizione del complesso mediante analisi western-blot utilizzando anticorpi anti-HA 13.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

L'efficacia della reticolazione e la purificazione successo del reticolato complesso proteico Tud sono stati analizzati mediante SDS-PAGE su un 3% - 7% gel fase (illustrata in figura 1), seguita da Western blot (Figura 2).

Lo scopo di utilizzare il 3% - gel passaggio 7% si basa sulla separazione effettiva del reticolato complesso proteico Tud dalla restante proteina non reticolato Tud e concentrazione del complesso. Nelle nostre condizioni di reticolazio...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La formaldeide è stato comunemente usato come reagente di reticolazione per identificare proteina-proteina e le interazioni proteina-acido nucleico. La sua buona solubilità e permeabilità della membrana cellulare, unitamente alla compatibilità con valle procedure di spettrometria di massa, rendono formaldeide un agente candidato ideale per applicazioni di reticolazione intracellulari 3,15-17. In particolare, è stato usato con successo per identificare mRNA associati Vasa, un critico elicasi RNA di cellule ger...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng per il loro aiuto tecnico con questo studio. Questo lavoro è stato supportato da NSF Career Grant MCB-1054962 a ALA

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Non sterilizzare in autoclave la miscela di acqua e agar per un periodo di tempo prolungato in quanto causerà la fragilità delle piastre di succo di mela
Metil 4-idrossibenzoatoSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Altro nome: TEGOSEPT
Popolazione gabbiaFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
Rete di nylon fineFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Quando si realizza il cestello di raccolta, tagliare la maglia leggermente più grande dell'apertura del tappo del tubo del falco per garantire una tenuta ermetica
Omogeneizzatore a deccaSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETRaffreddare l'omogeneizzatore con ghiaccio e prerisciacquare con tampone di lisi fredda prima dell'uso per prevenire la degradazione delle proteine
Cocktail di inibitori della proteasiRoche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS potrebbe essere utilizzato per preparare una soluzione madre concentrata di inibitore della proteasi
Perle di agarosio anti-HAMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Il kit include anche il peptide HA e le colonne di spin HA-peptide
MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Preparare a 2 mg/ml con PBS 
Colonna di centrifugaMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Le colonne di centrifuga sono incluse come parte del kit
IsopropanoloFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
Triton X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
EptanoFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Diluire da 10X a 1X con acqua nanopura prima dell'uso
FormaldeideFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
GlicinaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
UreaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
Fenilmetanthansulfonilfluoruro Sigma(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1GPreparare 200 mM di soluzione madre in isopropanolo, quindi diluire alla concentrazione di lavoro di 2 mM in tampone di lisi
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
Provette da 15 mlUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
CandegginamarcaDiluire con lo stesso volume di acqua nanopura per ottenere il 50% di candeggina
Provette da 50 mlBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Setaccio per lo strato superioreFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
Setaccio per lo strato inferioreFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
BP26324 Clorox

Riferimenti

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Isolamento di complessi proteicicross linking con formaldeideimmunoprecipitazioneanalisi Western Blotspettrometria di massapermeabilizzazione dell embrionepurificazione su gelcomplesso proteico Tudor

Articoli correlati