Complessi proteici Multi-componenti giocano un ruolo cruciale durante la funzione e lo sviluppo cellulare. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare complessi proteina nativa da embrioni di Drosophila in vivo dopo reticolazione seguita da purificazione dei complessi reticolati per successiva analisi struttura-funzione.
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Articolo metodologico
Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti processi cellulari sono controllati da complessi proteici multisubunit. Spesso questi complessi formano transitoriamente e richiedono ambiente nativo da montare. Pertanto, per identificare questi complessi proteici funzionali, è importante stabilizzarli in vivo prima lisi cellulare e successiva purificazione. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare grandi complessi proteici in buona fede da embrioni di Drosophila. Questo metodo si basa su embrione permeabilizzazione e stabilizzazione dei complessi all'interno degli embrioni in vivo reticolazione usando una bassa concentrazione di formaldeide, che può facilmente attraversare la membrana cellulare. Successivamente, il complesso proteina di interesse è immunopurified seguita da purificazione gel e analizzato mediante spettrometria di massa. Illustriamo questo metodo utilizzando la purificazione di un complesso proteico Tudor, che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale. Tudor è una grande proteina, che contiene più domini Tudor - piccolomoduli che interagiscono con arginine metilate o lysines delle proteine target. Questo metodo può essere adattato per l'isolamento di complessi proteina nativa da organismi e tessuti differenti.
Introduzione
Isolamento delle assemblee proteine multisubunit e-DNA o RNA-proteina complessi viene effettuata per identificare complessi proteici, loci genomici riconosciuto da proteine regolatrici che legano il DNA o RNA target di proteine leganti RNA. Diversi metodi permettono l'identificazione genoma dei siti del DNA riconosciuti da fattori di trascrizione o proteine della cromatina (ChIP-Seq) 1 e gli obiettivi di RNA associate a un determinato RNA-binding protein (CLIP-ss) 2. Le librerie di cDNA RNA derivati da o bersagli di DNA sono poi profondamente sequenziati. Questi metodi utilizzano chimica o indotto da UV reticolazione a regolarizzar....
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Protocollo
1. Preparare grande mela Piastre Juice-agar
- Per fare 4 piastre, aggiungere 375 ml di H 2 O, 11,25 g fly agar e un bar mescolare in un pallone di 1.000 ml. Questo è il Mix A. Autoclave Mix A con il coperchio pallone liberamente ricoperto da un ciclo di 30 min-sterilizzazione per le merci liquide.
- Aggiungere 125 ml di succo di mela, 12,5 g di zucchero da tavola e un ancoretta ad un bicchiere da 500 ml. Questo è Mix B. calore Mix B su una piattaforma riscaldata sotto agitazione e mantenere la temperatura a circa 70 ° C fino alla autoclave di Mix A è terminata.
- Al completamento di Mix A autoclave, trasferire Mix B Mix A. Continua....
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Risultati
L'efficacia della reticolazione e la purificazione successo del reticolato complesso proteico Tud sono stati analizzati mediante SDS-PAGE su un 3% - 7% gel fase (illustrata in figura 1), seguita da Western blot (Figura 2).
Lo scopo di utilizzare il 3% - gel passaggio 7% si basa sulla separazione effettiva del reticolato complesso proteico Tud dalla restante proteina non reticolato Tud e concentrazione del complesso. Nelle nostre condizioni di reticolazio.......
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Discussione
La formaldeide è stato comunemente usato come reagente di reticolazione per identificare proteina-proteina e le interazioni proteina-acido nucleico. La sua buona solubilità e permeabilità della membrana cellulare, unitamente alla compatibilità con valle procedure di spettrometria di massa, rendono formaldeide un agente candidato ideale per applicazioni di reticolazione intracellulari 3,15-17. In particolare, è stato usato con successo per identificare mRNA associati Vasa, un critico elicasi RNA di cellule ger.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng per il loro aiuto tecnico con questo studio. Questo lavoro è stato supportato da NSF Career Grant MCB-1054962 a ALA
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Non sterilizzare in autoclave la miscela di acqua e agar per un periodo di tempo prolungato in quanto causerà la fragilità delle piastre di succo di mela |
| Metil 4-idrossibenzoato | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Altro nome: TEGOSEPT |
| Popolazione gabbia | Flystuff ( http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Rete di nylon fine | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | Quando si realizza il cestello di raccolta, tagliare la maglia leggermente più grande dell'apertura del tappo del tubo del falco per garantire una tenuta ermetica |
| Omogeneizzatore a decca | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Raffreddare l'omogeneizzatore con ghiaccio e prerisciacquare con tampone di lisi fredda prima dell'uso per prevenire la degradazione delle proteine |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS potrebbe essere utilizzato per preparare una soluzione madre concentrata di inibitore della proteasi |
| Perle di agarosio anti-HA | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Il kit include anche il peptide HA e le colonne di spin HA-peptide |
| MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Preparare a 2 mg/ml con PBS | |
| Colonna di centrifuga | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Le colonne di centrifuga sono incluse come parte del kit |
| Isopropanolo | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Eptano | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Diluire da 10X a 1X con acqua nanopura prima dell'uso |
| Formaldeide | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glicina | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Fenilmetanthansulfonilfluoruro Sigma | (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Preparare 200 mM di soluzione madre in isopropanolo, quindi diluire alla concentrazione di lavoro di 2 mM in tampone di lisi |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| Provette da 15 ml | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Candeggina | marca | Diluire con lo stesso volume di acqua nanopura per ottenere il 50% di candeggina | |
| Provette da 50 ml | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Setaccio per lo strato superiore | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Setaccio per lo strato inferiore | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
Riferimenti
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Meth....
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Ristampe e permessi
