A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

Sommario

La matrice extracellulare subisce sostanziale rimodellamento durante la guarigione delle ferite, l'infiammazione e tumorigenesi. Vi presentiamo un approccio immunofluorescenza intravitale romanzo per visualizzare le dinamiche di fibrillare come pure componenti della matrice maglia-come con alta risoluzione spaziale e temporale con epifluorescenza o microscopia a due fotoni.

Abstract

Oltre ad essere un ponteggio fisico per mantenere la morfologia dei tessuti, la matrice extracellulare (ECM) è attivamente coinvolto nella regolazione della funzione delle cellule e dei tessuti durante lo sviluppo e organo omeostasi. Lo fa agendo attraverso vie di segnalazione biochimica, biomeccanica, e biofisiche, come ad esempio attraverso il rilascio di frammenti proteici ECM bioattivi, che regola la tensione dei tessuti, e fornire percorsi di migrazione delle cellule. La matrice extracellulare del microambiente tumorale subisce rimodellamento sostanziale, caratterizzato dal degrado, deposizione e l'organizzazione della matrice proteine ​​fibrillari e non fibrillari. Stromali irrigidimento del microambiente tumorale può promuovere la crescita del tumore e l'invasione, e causare rimodellamento dei vasi sanguigni e linfatici. Immagini dal vivo di proteine ​​della matrice, però, a questo punto è limitata a collageni fibrillari che possono essere rilevati dai generazione di seconda armonica mediante microscopia multi-fotone, lasciando la maggior parte dei componenti della matrice Largely invisibile. Qui si descrivono le procedure per tumore inoculazione nella cute dell'orecchio dorsale sottile, immunomarcatura di proteine ​​della matrice extracellulare e l'imaging intravitale del tessuto esposto in topi vivi con epifluorescenza e la microscopia a due fotoni. Il nostro metodo di imaging intravitale consente di rilevare direttamente sia fibrillare e proteine ​​della matrice non fibrillari nel contesto di un tumore cutaneo crescente. Mostriamo alcuni esempi di rimodellamento nave causate dalla contrazione matrice locale. Abbiamo anche trovato che matrice fibrillare del tumore rilevato con la generazione di seconda armonica è spazialmente distinte da componenti della matrice appena depositati come tenascin C. Abbiamo anche dimostrato di lunga durata (12 ore) l'imaging di interazione T-cellulare con cellule tumorali e cellule tumorali migrazione lungo il collagene IV della membrana basale. Presi insieme, questo metodo permette unicamente per la rilevazione simultanea di cellule tumorali, la loro microambiente fisica e il tessuto risposta immunitaria endogena nel tempo, che può provide importanti informazioni sui meccanismi sottostanti la progressione del tumore e il successo finale o resistenza alla terapia.

Introduzione

L'imaging intravitale dei processi di rimodellamento infiammatorio, metastatici e matrice è stato un importante settore di ricerca e ha motivato la creazione di numerosi modelli di topo giornalista transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti ^1,2. A causa di segnali fluorescenti out-of-focus, che riducono la qualità dell'immagine e limiti illuminano la penetrazione attraverso il tessuto, tessuto spesso imaging è possibile solo con confocale o microscopia a scansione multi-fotone ^3. Utilizzando più veloce, meno costoso e complesso epifluorescenza è possibile solo con i tessuti quasi bidimensionali, come il corio-allantoideo membrana pollo ⁴ o del mouse derma orecchie ^5. La maggior parte dei sistemi di imaging approfittare di topi transgenici che esprimono diverse proteine ​​fluorescenti in un determinato tipo di cellule di moda. Anche se queste proteine ​​offrono debole fototossicità, inducono la risposta immunitaria ^6. Inoltre, è difficile commutare tra sottotipi cellulari specifici o contrassegnare l'ir basale o stati attivati ​​in quanto tale modifica richiede la preparazione di un nuovo modello genetico. Inoltre, come espressione della proteina fluorescente è generalmente limitata al compartimento intracellulare, non è generalmente possibile a strutture extracellulari di immagine come proteine ​​di membrana basale o depositi chemochine tessuto ^7. Invece, l'etichettatura indiretta con anticorpi contro gli antigeni extracellulari offre flessibilità per qualsiasi tipo cellulare o matrice componente specifico ^8,9. Tuttavia, il principale svantaggio di questo approccio di etichettatura è associato dell'immunotossicità mediata da antigene-anticorpo immunocomplessi che possono innescare complemento tossicità cellulare dipendente dal sistema e fagocitosi di cellule e strutture extracellulari ^10.

La matrice extracellulare del microambiente tumorale, ma anche di tessuto normale durante l'infiammazione o cicatrizzazione, subisce sostanziali rimodellamento. Stromali irrigidimento del microambiente tumorale può promola crescita del tumore te e l'invasione a causa di meccanismi di segnalazione indotte dallo stress e causa rimodellamento di vasi sanguigni e linfatici ^11. Tuttavia, l'imaging dal vivo di proteine ​​della matrice è limitata a collageni fibrillari che possono essere rilevati dalla generazione di seconda armonica mediante microscopia multi-fotone. Recentemente abbiamo pubblicato un metodo di imaging intravitale romanzo che riduce al minimo il rischio di foto-e immuno-tossica danni alle cellule impressi e le strutture del tessuto ^5. In confronto con le tecniche di imaging stabilite in cui il singolo turno di continuo visualizzazione intravitale è in un intervallo di 30 minuti a 2 ore ^12-17, il nostro immunofluorescenza intravital (IF) tecnica ha permesso 12 ore (a lungo termine ⁸⁾ imaging. È importante notare che il tempo di imaging è limitato a 12 ore a causa di limiti definiti nel nostro protocollo animale ma non vi sono controindicazioni tecniche che non può essere prolungata per parametri critici della salute animale, come la pressione sanguigna e del cuorerate sono controllati ^8. Inoltre, utilizzando un stereomicroscopio a fluorescenza automatizzato siamo stati in grado di raccogliere immagini da più campi durante un singolo esperimento e osservato rari processi immunologici e rimodellamento che si sono verificati nel contesto fisiologico della pelle sostenuto da sangue funzionale e vasi linfatici. Poiché la lente stereomicroscopio ha una relativamente grande di 2 cm, distanza di lavoro e in contrasto con due fotoni ottiche microscopiche non richiede vaporizzazione immersione in acqua, imaging a lungo termine è stato eseguito solo sotto stereomicroscopio a fluorescenza. Intravitale se consentito l'etichettatura immunitario e il rilevamento di qualsiasi componente della matrice extracellulare della pelle normale. Il motivo di questa tecnica si basa sul concetto innovativo di usare immunocolorazione per le cellule vive e elementi di matrice del tessuto sul derma topi esposti chirurgicamente senza causare effetti nocivi immunitossici ^5. La procedura chirurgica in sé è sicuro al dermavascolare in quanto si basa solo sulla separazione dei due strati di pelle nell'orecchio che sono innervati indipendente, autonomo alimentato da sangue e drenato da circolazioni linfatiche separati. Il nostro apparato sperimentale permette l'imaging di una serie di importanti eventi fisiopatologiche oltre almeno 12 ore, incluso il traffico dei leucociti tra i vasi sanguigni e linfatici e processi di guarigione delle ferite. Nella pubblicazione originale, abbiamo confrontato la nostra tecnica a state-of-the-art standard in vari campi dell'imaging intravitale. Di conseguenza, abbiamo osservato vasi sanguigni stravaso e eventi intravasation linfatici da vari tipi di leucociti, compresa la visualizzazione unica di cellule immunitarie entrano raccolta invece previsto vasi linfatici iniziali ^15. Inoltre, integrando le osservazioni fatte da altri gruppi ^9,18, abbiamo scoperto che in CCL21 vivo è in grado di formare forti, depositi discontinue sulla raccolta, ma solo di rado su linfatici iniziali.

Qui si descrive un intravital modificato IF tecnica che può essere combinato con microscopia a due fotoni per rilevare rete di collageni fibrillari con generazione di seconda armonica (SHG). Abbiamo dimostrato che questo metodo può essere utilizzato anche per l'invasione delle cellule di cancro imaging contesto del microambiente tumorale dinamico, che comprende molecole della matrice come tenascin C, che sono ampiamente esplorato da tecniche di imaging correnti ^19. Abbiamo trovato che la matrice fibrillare del tumore, rilevato con la generazione di seconda armonica, occupa diverse posizioni del microambiente tumorale rispetto alla matrice appena depositato composto tenascin C. Inoltre, si descrivono esempi di rimodellamento nave causate dalla contrazione matrice locale, lungo termine (12 ore) l'imaging di interazioni T-cellulari con cellule tumorali e migrazione delle cellule tumorali lungo collagene IV della membrana basale. Tali eventi possono essere esposte contemporaneamente la registrazione di parametri fisiologici locali come pe vasi sanguignirmeability e il drenaggio linfatico.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite su animali sono stati in stretta conformità con la Protezione degli Animali legge svizzera, l'ordinanza sulla protezione degli animali e l'ordinanza sulla sperimentazione animale. Confermiamo che la nostra cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC), denominato Commission de Surveillance de l'Etat de Vaud (numero di permesso: 2687), specificamente approvato questo studio.

1. Tumore Semina del Ear

1. Cultura B16-F10-GFP cellule di melanoma in un piatto di 10 centimetri di Petri con DMEM + 10% FBS multimediale.
2. Quando le cellule sono 80-90% confluenti, lavarli con PBS e staccarli per tripsinizzazione. Centrifugare le cellule a 1500 xg per 5 minuti a 4 ° C, risospendere il pellet in 1 ml di soluzione di Ringer e trasferirlo in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Girare nuovamente e rimuovere tutti surnatante tranne uno strato sottile di supporto che rimane sopra il pellet. Risospendere le cellule a finire con un impasto cella di spessore.
3. Anestetizzare il mouse con una miscela di ketamminico / dorbene [medetomidina] (75mg/kg-1mg/kg) e verificare che l'animale sia sufficientemente anestetizzato eseguendo un pizzico punta dolce. Aumentare la concentrazione di isoflurano in passi di 0,1% nei movimenti casi sono rispettate (ad esempio il ritiro della zampa). Tenere mouse su un termistore controllata piastra elettrica retto (37 ° C) durante l'intera procedura e proteggere gli occhi con un appropriato pomata oftalmica.
4. Preparare una siringa Hamilton (33 G ago, 10 ml volume della siringa). Togliere il cappuccio con l'ago e caricare 20 ml di liquame cellule sulla parte superiore della camera di punta. Tirare indietro lo stantuffo fino a quando viene caricato 5 ml liquami all'interno della siringa. Togliere l'impasto in eccesso dalla camera di punta e chiudere il cappuccio.
5. Con nastro adesivo, fissare il bordo prossimale dell'orecchio sulla punta di un dito indice. In un angolo di 45 °, inserire lentamente la siringa Hamilton tra derma dorsale e la cartilagine. Una volta dentro, penetrare l'orecchio prossimale a distale per circa 2-3 mm.
   Nota: la procedura di iniezione di cellule deve essere eseguita da un tecnico qualificato e certificato. Inoltre questo processo deve essere eseguire lentamente e in sequenza: prima l'ago deve essere posizionato orizzontalmente per la pelle dell'orecchio e inserito lentamente nel derma orecchio. Una volta e solo allora l'ago è nella pelle, il pistone deve essere premuto. Premendo dello stantuffo avvierà cellule inoculazione nella pelle. Nella eventualità di ago passando i due strati del derma dell'orecchio, lo strato di cartilagine e entra nella pelle della persona che esegue l'esperimento, il dolore inflitto al dito sperimentatore dovrebbe essere considerato come un segnale allarmante e causare retrazione immediato dell'ago dalla pelle sperimentatore. In tal caso stantuffo non deve essere premuto e pelle deve essere sterilizzato con alcool. In alternativa, oggetto inanimato invece di un dito può essere usato per stabilizzare l'orecchio.
6. Iniettare 3 ml liquami cellulare e lentamente rientrare l'ago dall'orecchio.Lasciato le cellule tumorali formano un tumore solido durante 7-9 giorni e seguono la crescita tumorale utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza.
7. In alternativa, per seguire i primi passi di interazione cellula tumorale con matrice di tessuto, applicare 50 ml di 100.000 cellule tumorali sospese in soluzione di Ringer sul derma orecchio esposto e colorate (dopo la fase 3.3).

2. Chirurgia dell'orecchio

1. Tre giorni prima dell'esperimento, radersi la testa di topo, depilare i capelli intorno alla testa e l'orecchio (10-15 sec) e risciacquare con acqua.
2. Anestetizzare il mouse con una miscela di ossigeno umidificata e isoflurano (3-4% induzione, 1-2% di manutenzione) e verificare che l'animale è anestetizzato sufficientemente eseguendo un pizzico piedi dolce. Aumentare la concentrazione di isoflurano in passi di 0,1% nei movimenti casi sono rispettate (ad esempio il ritiro della zampa). Tenere mouse su un termistore controllata piastra elettrica retto (37 ° C) durante l'intera procedura e proteggere gli occhi con unaopportuno pomata oftalmica.
3. Costruire una piattaforma fatta di 8 incollati vetrini istologici in vetro. Accendere il mouse sulla sua schiena e delicatamente mettere l'orecchio tumore-cuscinetto sulla pila di lastre di vetro. Utilizzare piccole strisce di nastro adesivo per fissare i bordi anteriore e posteriore dell'orecchio alla pila.
4. Tagliare la pelle ventrale dell'orecchio lungo il antelice del padiglione auricolare mouse utilizzando un bisturi. Con l'aiuto di pinzette ricurve, delicatamente staccare il derma ventrali e la cartilagine dal derma dorsali in cui è stato inoculato il tumore. Togliere la pelle ventrale e la cartilagine con pinze curve, esponendo il derma dorsali. NOTA: Se i principali vasi dell'orecchio vengono tagliati o la circolazione del sangue non ritorna al normale flusso entro 15 minuti, l'orecchio non può essere utilizzata per l'imaging. Tenere sempre la pelle dell'orecchio aperto bagnata utilizzando tampone di Ringer e proteggere l'umidità utilizzando un vetrino.
5. Nel caso in cui non vi è sanguinamento persistente vasi forma del tumore, fermare l'emorragia con l'aggiunta di 100 microlitritrombina (5 U / ml) in tampone di Ringer (102 mM NaCl, KCl 5 mM, 2 mM CaCl _2, 28 mM sodio lattato) sopra l'orecchio per 5 min.
6. Lavare l'orecchio due volte con circa 5 ml di tampone di Ringer e rimuovere il liquido in più con salviette sterili. Procedere immediatamente alla fase successiva (non lasciare che l'orecchio aperto asciutto in qualsiasi punto!).

3. Immunofluorescenza

Tampone di utilizzo Ringer supplementato con siero umano (1,10), mouse policlonale anticorpo secondario IgG umana (1:50), e 125 UI / ml (2,5 mg / ml) aprotinina (tampone di bloccaggio) per tutte le fasi di colorazione. Aprotinina inibisce plasmina promuovere la coagulazione di limitare sanguinamento iniziale che può verificarsi dopo l'intervento.

1. Piegare la parte dell'orecchio con il derma aperte nella conca eminentia e asciugare le esterne derma orecchie aperti con panni sterili. Immobilizzare l'orecchio sulla pila di vetrino applicando 0,5 ml di colla chirurgica per anteriore e posteriore Dorsabordi l. Poi, appiattire delicatamente il derma orecchio dorsali sul vetro.
2. Applicare anticorpi primari targeting molecole della matrice extracellulare ad una concentrazione di 10 ug / ml in un volume totale di 100 microlitri di tampone bloccante per l'orecchio esposto. Coprire l'orecchio con un coprioggetto per evitare la soluzione colorante ad asciugare sui bordi dell'orecchio. Incubare per 15 min. Lavare l'orecchio due volte con circa 5 ml di tampone di Ringer.
3. Applicare appropriati anticorpi secondari coniugati o streptavidina (fluorofori con una lunghezza d'onda di eccitazione elevata come 594 nm o 647 nm sono favorevoli per l'imaging intravitale) ad una concentrazione di 10 ug / ml in un volume totale di 100 microlitri di tampone bloccante per l'orecchio esposto. Coprire l'orecchio con un coprioggetto e incubare per 15 min. Lavare l'orecchio due volte con circa 5 ml di tampone di Ringer.

4. Interazione di Splenociti attivati ​​ematica con le cellule tumorali in situ

1. 7 giorni dopo inoculation di GFP-B16-F10 melanoma sulla pelle retro del mouse congenic, eutanasia degli animali e raccogliere milza. Isolare splenociti con rottura meccanica della milza attraverso un colino cella 70 micron.
2. Splenociti etichette per 8 minuti a 37 ° C con macchia citoplasma cellulare Red CMTPX (1 mM in PBS), lavare 4 volte in 15 ml a 4 ° C e iniettare immediatamente con mezzo privo di siero microlitri 200 nella vena della coda del topo cui orecchie erano inoculati con B16-F10-GFP sette giorni prima.

5. Imaging intravitale utilizzando uno stereomicroscopio

1. Per l'imaging a breve termine (fino a 2 ore), aggiungere del buffer di ascorbato-Ringer sterile preparata di recente contenente 140 mm ascorbato di sodio, HEPES 10 mM, KCl 4 mm e 5 mm CaCl _2, ad un pH di 7,5 (buffer di finale di ascorbato-Ringer osmolarità 320 mOsm) sulla parte superiore dell'orecchio immobilizzato. Coprire l'orecchio con un coprioggetto e iniziare immagini utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza con lente 2X.
2. Per l'imaging a lungo termine(Più di 2 ore), posizionare la presa di un ago (collegato ad un serbatoio contenente tampone di ascorbato-Ringer) sotto il coprioggetto, circa 0,5 cm di distanza dall'orecchio. Utilizzare una pompa peristaltica ad una velocità di 1 ml / min per fornire costantemente tampone di ascorbato-Ringer alla camera sotto il coprioggetto.
3. Cambiare la lente 1X (distanza di lavoro 6 cm) a lente 2X (distanza di lavoro 2 cm). Aprire il software di acquisizione e configurare le impostazioni del stereomicroscopio a fluorescenza. A porte chiuse impostazioni scegliete 12 bit come la profondità del colore dell'immagine e regolare la gamma di telecamere di valori in scala di grigi da 0% (minimo) al 5,1% (massimo) e impostare la correzione gamma a 2.
   1. Impostare il guadagno acquisizione a 1 (minimo), intensità di fluorescenza a 1.000 (massimo), l'ingrandimento impostato 280x-320X e regolare il tempo di esposizione di evitare sovra-o sotto-esposizione (tempo di esposizione deve essere inferiore a 1 sec). A seconda del numero di campi di imaging (solitamente da 10 a 20), l'intervallo di tempo per il ciclo di rilevamento deve essere impostato siainterpolare 1-2 min. Abbreviare i tempi possono causare il candeggio e fototossicità.
4. Scegliere parecchi campi che contengono cellule tumorali e anche proteine ​​ECM macchiati (come in figura 3). Utilizzando lo stadio motorizzato, acquisire immagini dei canali fluorescenti appropriati (come GFP e fluoroforo 647 in Figura 3) nel tempo (ad esempio ogni 2 min).
5. Dopo l'esperimento, eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali animali. In questo caso, alla fine dell'esperimento, eutanasia il mouse anestetizzato mediante dislocazione cervicale seguita da dissanguamento (perfusione intracardiaca).

6. Imaging intravitale utilizzando un microscopio Multiphoton

1. Utilizzando grasso al silicone, costruire un muro circolare di circa 2 cm di diametro e 2-3 mm di altezza intorno all'orecchio, partendo dalla base dell'orecchio. Assicurarsi che non ci siano punti di perdita. Riempire il cerchio con tampone di ascorbato-Ringer.
2. Posto del mousesulla scena e collegare il pad di riscaldamento (37 ° C).
3. Software di acquisizione Aprire e configurare le impostazioni del microscopio multiphoton.
4. Scegliere fino a quattro diversi campi che contengono cellule tumorali e proteine ​​ECM colorate (come in figura 3). In questo esempio, sintonizzare il laser Ti-zaffiro a 850 nm per un successivo segnale GFP singolo fotone 647 per fluoroforo 647 colorazione e visualizza i collageni fibrillari con SHG. Acquisire immagini dei canali fluorescenti appropriati (come GFP e fluoroforo 647 in Figura 3) e generazione di seconda armonica nel tempo, ad esempio ogni 2 min, con immersione in acqua HCX APO 20X con 1,00 NA lente 2 mm distanza di lavoro.
5. Dopo l'esperimento, eutanasia topo anestetizzato con dislocazione cervicale, seguito da dissanguamento (intracardiaca perfusione).

Risultati

Fino ad oggi, immunostaining nel tessuto vivo, non è in genere utilizzato a causa della formazione di complessi immunitari che portano alla colorazione con fondo elevato e immunotossicità ^20. Questo è stato superato da pre-bloccando i recettori Fcy sui macrofagi tissutali, così "accecante" queste cellule per la successiva forte immunoistochimica indiretta. Come l'etichettatura era extracellulare, fototossicità e fluoroforo sbianca potrebbe essere controllato mediante immersione del tessuto in antiossidante naturale tamponata, acido ascorbico isosmotic (Fig. 1A). Dato che la nostra descrizione iniziale di questo metodo ^5, abbiamo migliorato la nostra tecnica di anti-imbianchimento e anti-fototossiche modo che photobleaching può ora essere inibito non solo, ma completamente impedito (Fig. 1B). Questo viene fatto inserendo l'orecchio in un grande volume di antiossidante (100 microlitri) all'interno della camera dove l'orecchio è immobilizzato. Si noti che il tempo di 300 secondi di imaging costante corrisponde a 10 ore di immagini in cui le immagini sonoraccolti per 500 msec intervalli di un minuto (le impostazioni medi di imaging).

Figura 1. Photobleaching e fototossicità è stato fermato sostituendo cloruro con l'ascorbato in tampone di Ringer e incorporare l'orecchio esposto nel volume 100 ml di tale soluzione. (A) Tissue era macchiato prima con un anticorpo biotinilato contro collagene IV, la componente della membrana basale. La colorazione è stata successivamente rilevata con streptavidina-647 (rosso), e quindi costantemente ripreso per 300 secondi in tampone sia normale Ringer (pannello superiore) o ascorbato-Ringer (pannello inferiore) di. Si noti che 300 secondi di tempo di imaging costante corrisponde a 10 ore di immagini quando le immagini vengono raccolti per 500 msec intervalli di un minuto (le impostazioni di imaging normali). La più brillante del 25% di piI valori di intensità Xel sono di colore verde. (B) Quantificazione di immunofluorescenza decadimento (50% vs 0% in Ringer ascorbato-Ringer). I valori sono stati normalizzati alla fluorescenza iniziale. Le immagini raccolte con immunofluorescenza stereomicroscopio. Barra della scala in A, 100 micron. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Indagare l'interazione tra cellule tumorali e metastasi tumorale stroma è cruciale per comprendere il processo di migrazione delle cellule tumorali e immunità tumore. Questo perché lo stroma del tumore-associato compone fino al 90% della massa tumorale e un controllo attivo della crescita tumorale e diffusione metastatica ^21. Tuttavia, la comprensione meccanicistica di come la migrazione unità matrice delle cellule tumorali nei confronti sia linfatica o vasi sanguigni è carente ^22. Questo è in parte dovuto al fatto che im intravitalinvecchiamento di proteine ​​della matrice è limitato alla visualizzazione di fibre maturati di collageni fibrillari utilizzando generazione di seconda armonica in microscopia a due fotoni ^23. Pertanto, abbiamo adattato il nostro metodo per la visualizzazione del microambiente tissutale inclusi sangue e vasi linfatici, periciti, nervi, muscoli e adipociti per includere la visualizzazione diretta dei componenti della matrice extracellulare. Numerose strutture possono essere distinti in base alla loro morfologia dopo immunocolorazione per seminterrato componenti della membrana come il collagene IV o perlecan (Fig. 2A), tuttavia, la colorazione diretta per specifici marcatori di superficie cellulare, ad esempio Lyve1 (Fig. 2B e C) e podoplanin (Fig . 2C), permette inoltre distinguendo iniziali, vasi linfatici capillari (Lyve1 ⁺⁾ da collettori linfatici (Lyve1 ^-). Colorazione per CCL21 matrice rilegato in pelle depositi di questo chemochine rivelato la membrana basale dei collettori linfatici identified con la colorazione per perlecan, il solfato proteoglicani heparan (Fig. 2D).

Figura 2. Esempi di colorazione dal vivo in un normale orecchie del mouse. (A) colorazione per perlecan, un componente di membrana basale, raffigura tutti i vasi sanguigni e linfatici, i nervi, le fibre muscolari e adipociti. (B) Lyve1 colorazione segna la rete iniziale capillare linfatico. (C) Co-colorazione per Lyve1 e podoplanin, un marker pan-linfatica, raffigura reti di vasi linfatici iniziali e di raccolta. Il derma orecchio dorsale può essere ripreso con classico epifluorescenza (senza sezionamento ottico), come il derma dell'orecchio ha un basso numero di adipociti che altrimenti coprire il campo di ripresa. (D) CCL21 Stai ning (verde) sulla membrana basale linfatico colorate per perlecan (rosso). Le immagini raccolte con immunofluorescenza stereomicroscopio. Bar Scala in A e B, a 1 mm; in C, 100 micron e 50 micron di D. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Soprattutto, proteine ​​strutturali che normalmente non possono essere rilevati da SHG, il metodo di rilevamento matrice classico ^23, possono essere visualizzati. Ad esempio, abbiamo scoperto che tenascin C (Fig. 3A), una proteina della matrice che si esprime durante la tumorigenesi, la guarigione delle ferite e l'infiammazione ¹⁹ è depositato in luoghi diversi del tumore stroma di collageni fibrillari (Fig. 3B). Questa eterogeneità matrice potrebbe influenzare la distribuzione delle cellule tumorali e metastasi (Fig. 3C).

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Figura 3. Il derma auricolari dorsale può essere ripreso dal vivo mediante microscopia multi-fotone. Un singolo campo di tumore B16-F10. Tumore stroma è stato marcato con anticorpi tenascin C e la colorazione è stata rilevata con l'anti-capra-594 anticorpo asino. Immunofluorescenza di tenascin C (rossa) della rete viene riportata in A e collageni fibrillari rilevato con la generazione di seconda armonica (SGH) in B. Queste due reti si sovrappongono con le cellule tumorali (ciano) in C (fusa). Matrix nuovo tumore caratterizzato da tenascin C non si sovrappone con collageni fibrillari rilevati con SHG (verde). L'immagine con 44, quattro volte la media z-sezioni con z-passo 1.0 micron è stato acquistato in modalità profondità di colore a 16 bit. Le immagini raccolte con microscopio a due fotoni. Barra della scala, 100 micron.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo la immunomarcatura delle diverse componenti della matrice del tumore (ad es tenascin C e collagene IV) di matrice tumore potremmo identificato limitato e improvvisi eventi di tumore direzionale matrice rimodellamento (Video 1). Forze che si sviluppano all'interno microambiente tumorale possono portare ad espansione o la contrazione della matrice tumore e nel rimodellamento conseguenza e allungamento del sistema vascolare del tumore in misura simile a quanto mostrato in precedenza nel caso di guarigione delle ferite ^11,24.

Video 1. Ampliamento della matrice tumore marcato con il collagene IV (rosso) e tenascin C (ciano) allungare vasi sanguigni (freccia) e passivamente traslocare tre cellule tumorali (verde). La contrazione localizzata di teascin ricchi di C tumore matrice traslocare vaso sanguigno (rosso orientamento orizzontale Structure) di circa 100 pm durante 12 ore di imaging. Le immagini raccolte con immunofluorescenza stereomicroscopio. Clicca qui per vedere il video.

Mediante microscopia multi-fotone con etichettatura fluoroforo è problematica come flusso di fotoni utilizzata in questi esperimenti sarà candeggiare rapidamente coloranti fluorescenti che non sono protetti dall'ossidazione ^25. Qui mostriamo che possiamo eseguire due fotoni microscopia time-lapse e contemporaneamente di imaging matrice immunolabeled tenascin C con una minima photobleaching di fluorofori anche in alta densità di fotoni microscopia a due fotoni (Video 2).

B16-F10-GFP cellule Video 2. Basso livello photobleaching di tenascin C immunofluorescenza (rosso) durante la microscopia a due fotoni. Tumorali (ciano) sono stati ripresi nelle orecchie dorsale aperto nove giorni dopo l'inoculazione. Il segnale fluorescente è stato protetto mediante trattamento con ascorbato-Tampone Ringer sul tessuto ripreso. Generazione di seconda armonica (verde) non si sovrappone con la nuova matrice rappresentata dalla sig.ra C. un'immagine profondità di colore a 16 bit tenascin con 11, quattro volte la media z-sezioni con z-passo 1.9 micron è stata acquisita per 15 min. Le immagini sono state raccolte ogni 1 minuto 5 secondi in 6 z piani raccolti. Clicca qui per vedere il video.

Abbiamo anche ripreso le interazioni immuno-cellulari con cellule tumorali metastatiche. Splenociti CMTPX-etichettati da un mouse tumore-cuscinetto travasato dai vasi sanguigni associati al tumore 8 ore dopo iv trasfusione, invasero la matrice tumore e attivamente interagito con le cellule tumorali formando contatti cellulari di lunga durata (Video 2). Strutture fluoroforo-647-etichettati collagene IV erano resistenti alla photobleaching durante le 12 ore di imaging.

Video 3. Interazione di splenociti CMTPX-etichettati da tumore (B16-F10)-bearing topo con cellule tumorali singole (GFP-B16-F10). Splenociti erano iv trasfuso dopo la colorazione dei tessuti per il collagene IV. Collagene IV-verde (647), splenociti-rosso (CMTPX), B16-F10 ciano (GFP). Le immagini raccolte con immunofluorescenza stereomicroscopio. Durata video 12 ore. Clicca qui per vedere il video.

Cellule tumorali appena isolate sono stati sovrapposti sul derma orecchio esposti pre-colorate per il collagene IV. Potremmo osservato che dopo aderente al tessuto alcuni gruppi di cellule hanno iniziato migrazione collettiva lungo membrana basale dei vasi sanguigni e adipociti.

Le cellule tumorali Video 4. Migrano lungo membrane basali. Pelle orecchio normale macchiato per il collagene IV (647, rosso) è stato sovrapposto con appena diversi passaggi cellule B16-F10-GFP e ripreso per 5 ore. Alcune cellule tumorali che hanno aderito al tessuto iniziato la migrazione collettiva lungomembrana basale dei vasi sanguigni e adipociti. Le immagini raccolte con immunofluorescenza stereomicroscopio. Durata video:. 5 ore Clicca qui per vedere il video.

Inoltre, poiché il derma orecchio è praticamente bidimensionale, potremmo facilmente raccogliamo grandi volumi di dati mediante fluorescenza veloce stereomicroscopia, invece di confocale più lento e più costoso o la microscopia multiphoton. Tuttavia, è anche possibile utilizzare uno qualsiasi dei metodi di microscopia a scansione citati con il nostro intravital IF preparazioni (Fig. 3, Video 1).

Discussione

Significato

Presentiamo qui un approccio microscopia intravitale romanzo che permette alta risoluzione e visualizzazione dinamica dei diversi componenti del microambiente tissutale, incluse fibrillare e proteine ​​della matrice di tipo maglia. Questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto alle attuali tecniche di imaging intravitale: (i) intravitale imaging di fluorescenza è stato utilizzato in studi microcircolazione, ad esempio, per monitorare perdite soluto dal sangue o in linfatici, ma non è stato combinato con immunocolorazione. (Ii) L'uso di topi transgenici geneticamente modificati consente di specifici tipi cellulari per essere ripreso, ma richiede loro disponibilità (o sforzo sostanziale per creare nuove) e limita il numero di interagire tipi di cellule che possono essere studiate. (Iii) La matrice extracellulare può essere ripreso in vivo usando generazione di seconda armonica, ma questa tecnica può rilevare solo collageni fibrosi, lasciando un gran numero di importanti componenti extracellularicome membrane basali, fibronectine, tenascins, fattori di crescita, chemochine e glicosaminoglicani tessuti fuori dalla portata per la ricerca corrente. Il nostro metodo supera queste limitazioni, e permette tecniche di imaging standard per essere incorporati e ulteriormente combinati con immunostainings per altri tipi di cellule, strutture dei tessuti, depositi di eparina solfato di legame dei fattori di crescita (ad esempio VEGF ²⁶⁾ e chemochine (CCL21 ^5,18 e fig. 2D o), proteine ​​della matrice extracellulare mentre simultaneamente rintraccia sangue e / o flussi linfatici.

Limitazioni

La rappresentazione epifluorescenza di intravitale IF è limitata ai lembi di pelle sottili, prive di spessore ipoderma (tessuto adiposo). Mentre abbiamo trovato che il derma orecchio dorsale è ottimale per relativamente innocuo esposizione chirurgica della pelle dell'orecchio, epifluorescenza dotato intravital IF tecnica non è limitata a derma orecchio e potrebbe potenzialmente essere applicate esla pelle esposta delle dita o indietro la pelle del topo neonato. Colorazione anticorpo rapido (15 minuti) in immunofluorescenza SE non dipende diffusione passiva, ma richiede il drenaggio linfatico e funzionale il flusso del fluido interstiziale, quindi nessuna colorazione può essere osservata se i vasi linfatici sono occlusi ^27. In linea con questo, vasi linfatici macchia forte poi perde vasi del sangue (navi feriti, arteriole) ^5. La separazione della dorsale e ventrale lembi cutanei dell'orecchio è una procedura chirurgica lieve ma provoca lesioni ad alcuni capillari e morte cellulare in varie cellule dei tessuti. Questo potrebbe essere un problema quando si ha la necessità di indagare il tessuto completamente intatto, ad esempio guardando la lieve effetto dei farmaci sulla sopravvivenza delle cellule. Anche l'applicazione di antiossidante che serve a proteggere la pelle da fototossicità e photobleaching esclude l'utilizzo di tecniche di immunofluorescenza intravital studiare ad esempio lo stress ossidativo tessuto o ossido nitrico biology.

Infine, accecante di macrofagi residenti tessuto con immunocomplessi può attivare queste cellule e influenza ad esempio lo studio del tessuto risposta immunitaria e l'attivazione delle cellule dendritiche.

Modifiche e risoluzione dei problemi

Per studiare stress ossidativo tessuto o ossido nitrico biologia, ascorbato deve essere sostituita con altri mezzi compatibili tessuto che non interferiscono con l'uscita sperimentale. Allo stesso modo, bloccando i recettori Fc sulle cellule immunitarie cutanee dovrebbero essere evitati se l'obiettivo dello studio è la funzione e l'attivazione della risposta immunitaria dei tessuti e l'attivazione delle cellule dendritiche e migrazione. Questo può essere fatto con l'uso di anticorpo secondario con frammento Fc spaccati (F (ab) 2 frammenti anticorpali) o l'uso di anticorpo biotinilato e streptavidina fluorescente come reagenti di rivelazione.

Le applicazioni future

Vi presentiamo un intra romanzo e unicovitale IF tecnica per immagini componenti non fibrillari della matrice extracellulare in tumori della pelle trapiantabili in combinazione con fibrillare SHG-rilevato e collagene maturati usando la microscopia a due fotoni. Uno dei vantaggi di utilizzare multi-fotone (o confocale) microscopia sopra di imaging in epifluorescenza è possibilità z-impilamento e di conseguenza spaziale co-localizzazione di eventi che si verificano all'interno della matrice extracellulare, ad esempio intravasation tumore in linfatica o vaso sanguigno, che nel caso di epifluorescenza standard può essere dedotto solo da variazioni morfologiche della cellula invasore. Questa tecnica ha un potenziale molto più ampia. Ad esempio, abbiamo utilizzato il intravital IF per indagare il meccanismo di occlusione linfatico specifica-linfatico terapia fotodinamica ^27. Altri potenziali applicazioni di questo metodo includono ma non sono limitati a indagine dell'immunità pelle durante l'infiammazione, meccanismo di rifiuto o metodi di sangue e linfa trapianto la crescita dei vasi atic durante la tumorigenesi.

Passaggi critici nella procedura

Il passo più importante che ha implicazioni critiche per sostenere un ambiente tessuto fisiologica è una separazione chirurgica della pelle ventrale e cartilagine dal derma dorsali. Taglio o occludere l'arteria principale o vena porterà ad un eccessivo sanguinamento e ipossia tissutale locale, che interesserà risposta cellulare ai trattamenti e il movimento delle cellule ^8. Immobilizzare l'orecchio con colla chirurgica dovrebbe essere fatto con cura, come si rovescia la colla sulla esporre tessuto causerà un danno permanente al tessuto da occlusione dei vasi sanguigni. La temperatura del mouse deve essere controllata e mantenuta a 37 ° C. Inoltre, ossigeno umidificato deve essere usato per il isoflurano, in modo che gli occhi e polmoni rimanere adeguatamente umidificati durante l'esperimento. Inoltre, ascorbato di sodio deve essere preparata al momento e il suo pH controllato prima dell'uso.

S copi "> In sintesi, questo immunofluorescenza intravital ponti in tempo reale, le misure locali di funzione fisiologica con imaging molecolare di eventi cellulari complessi in pelle mouse. Inoltre, questo metodo ha un grande potenziale in quanto può essere facilmente applicato ad esempio studio post-sviluppo meccanismi di sangue e la linfa-angiogenesi o per visualizzare le prime fasi di infezione della pelle da vari agenti patogeni. Con la sua flessibilità e il potenziale high-throughput, questa tecnica intravital possono contribuire significativamente a molteplici campi della biologia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi Ceppo
Topi BALB/C (8-12 settimane)	Charles River		Orleans,France
C57/Bl6 Topi (8-12 settimane)	Harlan		Carshalton UK
Cell Line
B16 F10 Melanoma che esprime OVA-GFP
Mantenimento dell'anestesia
Isofluorano	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Buffalo, NY
Sistema di consegna umidificato	Rothhacher GmBH		Berna, Svizzera
Sistema di controllo della temperatura CC	FHC Inc		Bowdoin, MA
Stereomicroscopio
Stereomicroscopio a fluorescenza con tavolino motorizzato.	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Germania
Obiettivo 1X (ingrandimento del sistema lineare da 7,5X a 160X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Germania
Obiettivo 2X (ingrandimento del sistema lineare da 15,6X a 320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Germania
Fotocamera DFC 350 FX controllata dal software LAS AF	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Germania
Microscopia multifotone
LEICA SP5, moltiplicatore a due fotoni, stadio motorizzato	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Germania
HCX APO 20X/1.2 immersione in olio
Chameleon Ultra Laser
Tampone di Ringer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM di lattato di sodio)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Germania
Aprotinin	Elastina	AP92	Owensville, MO
Trombina	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, Germania
Ascorbato di sodio	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Germania
Siero di topo contro le IgG umane	Abcam	ab34834	Cambridge, Regno Unito
Collagene IV	Abcam	AB6581	Cambridge, Regno Unito
Perlacan	RnD	ab79465	Minneapolis, MN
Tenascin C	RnD	AF3358	Minneapolis, MN
Podoplanin	RnD	AF3244	Minneapolis, MN
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ttel, Germania
CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Streptavidina Blu Pacifico	Invitrogen	S11222	Grand Island, NY
Streptavidina Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, NY
Streptavidina Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
Asino Anti Capra 594	Invitrogen	A21113	Grand Island, NY
Asino Anti Coniglio 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, California
Histocryl (colla chirurgica)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Germania
Reagenti per colture cellulari
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Siero fetale bovino (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY