Sono descritti protocolli per singolo neurone microfluidica arraying e mascheramento acqua per il patterning plasma in-chip di rivestimenti biomateriale. Co-colture altamente interconnessi possono essere preparati utilizzando gli ingressi di cellule minimali.
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Articolo metodologico
Preparazione della neuronali Co-culture con precisione singola cella
In questo articolo
Sommario
Abstract
Realizzazioni microfluidica della camera Campenot hanno suscitato un grande interesse da parte della comunità neuroscienze. Queste piattaforme di co-coltura interconnessi possono essere utilizzati per indagare su una serie di domande, che coprono neurobiologia dello sviluppo e funzionale alle infezioni e la propagazione della malattia. Tuttavia, i sistemi tradizionali richiedono input significativi cellulari (molte migliaia per compartimento), inadeguati per lo studio delle cellule poco abbondanti, come primaria nigra dopaminergici della substantia, gangli spirale, e Drosophilia neuroni melanogaster, e poco pratico per un throughput elevato sperimentazione. Le colture dense sono impigliati molto localmente, con poche escrescenze (<10%) che interconnettono i due culture. In questo documento sono descritti semplici protocolli di microfluidica e patterning che affrontare tali sfide: (i) una microfluidica singolo neurone metodo arraying, e (ii) un metodo di mascheramento acqua per rivestimenti biomateriale patterning plasma Register neuroni e promuovere conseguenza tra i compartimenti. Neuronali co-colture minimalista sono stati preparati con alto livello (> 85%), la connettività intercompartment e possono essere utilizzati per esperimenti di neurobiologia ad alto rendimento con precisione singola cellula.
Introduzione
Tessuto neuronale è molto complesso; una miscela cellulare eterogenea che è spazialmente ordinato entro livelli e comparti definiti e con connettività di plastica tramite contatti cellulari e soprattutto tramite assoni e dendriti escrescenze. Nuove tecniche sono tenuti a conferire una maggiore libertà di sperimentazione per acquisire conoscenze più profonde e meccanismi a svelare centrali per malattia, lo sviluppo e la funzione sana. La camera Campenot 1,2 e più recentemente microfabricated realizzazioni 3,4 possono essere utilizzati per la preparazione di ex vivo neuronali co-colture in rete con la capacità di perturbare selettiv....
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Protocollo
I protocolli sono intesi per i neuroscienziati, e sono riassunte nella Figura 2. Come tale è consigliabile che microfabbricazione dei SU-8 master utilizzati per la replica PDMS è affidata a strutture commerciali o istituzionali. I due disegni maschera di livello sono liberamente disponibili come informazioni supplementari (ZIP) sul Royal Society of Chemistry sito 12. È importante sottolineare che il primo SU-8 strato deve essere fabbricato ad una profondità di 2,5-3,0 micron, e la seconda ad una profondità di 25-30 micron. Queste sono le dimensioni fondamentali necessarie per un efficace arraying neurone. Il limite di altezza di 3 micron è....
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Risultati
Exploit di mascheramento delle acque superficiali tensione. La tolleranza di pressione all'interfaccia aria-liquido scale inversamente con il raggio di curvatura [ 
, Producendo interfacce altamente stabili a dimensioni microfluidici. I micropillars ancorano efficacemente l'acqua maschera in luogo. Formazione di acqua maschera è guidato per evaporazione dai porti microfluidica, con il tasso aumentato di riscaldamento. Usando il c.......
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Discussione
La tecnica per formare gli array microfluidica è il primo del suo genere che permette precisione un'unica movimentazione neurone per stabilire le culture minimalista. Accoppiato con il metodo in situ patterning biomateriale, un approccio efficace per allineare i modelli di cellulari con le strutture microfluidica, queste culture minimalista hanno livelli di connettività ad alta intercompartment con ridotta entanglement locale. Queste funzioni possono essere utilizzate per lo studio efficace di trasmissione .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Ulrich Marggraf (SISSA) di SU-8 fabbricazione e Maria Becker (SISSA) per l'imaging SEM. La ricerca è stata sostenuta finanziariamente dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), un Bundesministerium für Bildung und Forschung concessione (BMBF 0101-31P6541) e dalla Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf grazie Leibniz Scuola di Dottorato Internazionale "Systems Biology Lab-on-a-Chip" per il sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Vetrini coprioggetti | VWR | 630-1590 | di spessore 130-160 mm |
| Kai | Medical | Impugnare con cura - estremamente affilato | |
| Tubo Tygon | Fisher | Scientific S-50-HL | 1,65 mm ID; 3,35 mm OD |
| 1 ml siringa ( Inkjekt e Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| Connettore per tubi a 4 vie | VWR o Fisher Scientific Regolatore | ||
| flusso | Apparecchio | Harvard 722645 | |
| pin da 0,5 mm Reparti | |||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | La stabilità in stoccaggio può essere un problema |
| poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polilisina-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| Poliornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Laminina | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Microscopio fluorescente invertito | |||
| Esempio di pompa di aspirazione | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Dispositivo portatile a scarica corona | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | Potrebbe non essere conforme agli standard di sicurezza del vostro paese |
| Forno al plasma femto | Diener Essiccatore elettronico | ||
| sottovuoto o centrifuga |
Riferimenti
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of....
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Ristampe e permessi
