Sono descritti protocolli per singolo neurone microfluidica arraying e mascheramento acqua per il patterning plasma in-chip di rivestimenti biomateriale. Co-colture altamente interconnessi possono essere preparati utilizzando gli ingressi di cellule minimali.
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Articolo metodologico
Preparazione della neuronali Co-culture con precisione singola cella
In questo articolo
Sommario
Abstract
Realizzazioni microfluidica della camera Campenot hanno suscitato un grande interesse da parte della comunità neuroscienze. Queste piattaforme di co-coltura interconnessi possono essere utilizzati per indagare su una serie di domande, che coprono neurobiologia dello sviluppo e funzionale alle infezioni e la propagazione della malattia. Tuttavia, i sistemi tradizionali richiedono input significativi cellulari (molte migliaia per compartimento), inadeguati per lo studio delle cellule poco abbondanti, come primaria nigra dopaminergici della substantia, gangli spirale, e Drosophilia neuroni melanogaster, e poco pratico per un throughput elevato sperimentazione. Le colture dense sono impigliati molto localmente, con poche escrescenze (<10%) che interconnettono i due culture. In questo documento sono descritti semplici protocolli di microfluidica e patterning che affrontare tali sfide: (i) una microfluidica singolo neurone metodo arraying, e (ii) un metodo di mascheramento acqua per rivestimenti biomateriale patterning plasma Register neuroni e promuovere conseguenza tra i compartimenti. Neuronali co-colture minimalista sono stati preparati con alto livello (> 85%), la connettività intercompartment e possono essere utilizzati per esperimenti di neurobiologia ad alto rendimento con precisione singola cellula.
Introduzione
Tessuto neuronale è molto complesso; una miscela cellulare eterogenea che è spazialmente ordinato entro livelli e comparti definiti e con connettività di plastica tramite contatti cellulari e soprattutto tramite assoni e dendriti escrescenze. Nuove tecniche sono tenuti a conferire una maggiore libertà di sperimentazione per acquisire conoscenze più profonde e meccanismi a svelare centrali per malattia, lo sviluppo e la funzione sana. La camera Campenot 1,2 e più recentemente microfabricated realizzazioni 3,4 possono essere utilizzati per la preparazione di ex vivo neuronali co-colture in rete con la capacità di perturbare selettivamente le diverse popolazioni somatiche e anche loro escrescenze neuriti. Questi dispositivi microfluidici sono per esempio stati utilizzati per studiare assonale degenerazione e rigenerazione seguenti sostanze chimiche 5,6 o laser assotomia 6-8, tauopathy 9, la diffusione virale 10,11, e mRNA localizzazione in assoni 4.
ent ">Per estendere la portata dei neurobiologi, gli sviluppi tecnologici sono tenute a redigere neuronali co-culture minimalista. Ciò consente disentanglement della rete neuronale per la ricerca del sistema con singola cella e precisione sub-cellulare. Il requisito per il numero di cellule minime apre la possibilità di analizzare tipi di cellule rare, comprese dopaminergici della substantia nigra cellule pertinenti alla malattia di Parkinson, gangli spirale dall'orecchio, neuroni periferici, e cellule staminali. Al di là di questo, economia cellulare è rilevante per l'iniziativa 3R. Utilizzando queste piattaforme microfluidica, schermi di tossicità su larga scala o altro throughput elevato, i dati ricca serie sperimentali che richiedono neuroni di animali può essere considerato.
In questo documento sono descritti protocolli per la fabbricazione e l'uso di un dispositivo microfluidica. Arraying microfluidica in combinazione con un in situ biomateripatterning al metodo può essere utilizzato per la registrazione di co-colture neuronali altamente interconnesse utilizzando il numero di cellule minime. Arraying microfluidica è basato su un approccio differenziale di flusso 12-15, in cui trappole microstrutturata sono posizionati all'interno di un circuito fluidico (illustrato con immagini SEM di Figura 1). Il percorso 0 → 1 ha la resistenza fluida inferiore (R 2> R 1) per il trasporto di neuroni di una schiera lineare di aperture microstrutturati - le insenature ai canali crescita dei neuriti. Occupazione della trappola da una singola cellula impedisce localmente il flusso per deviare le linee di corrente per la cattura di celle successive in trappole vicini. Occupazione completa delle trappole nella matrice commuta il rapporto fluidico (R 1> R 2) per deviare le linee di flusso nel percorso a serpentina (0 → 2) per produrre un bypass di operazione per la rimozione dei neuroni in eccesso.
Figura 1. Microfluidic Circuit. A) Il circuito di resistenza differenziale di fluido per formare gli array singolo neurone, con accompagnamento camere di coltura collegati tra loro da canali crescita dei neuriti. B, immagini C) SEM del doppio strato neurone compartimenti matrice co-coltura con menisco pinning micropillars. Con questo progetto, le strutture neurone di cattura a forma di tridente sono stati utilizzati per promuovere la fascicolazione delle escrescenze neuriti. Figure e leggenda riprodotta con il permesso della Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
La preparazione delle reti neuronali micropatterned su substrati planari può facilmente essere ottenuto (per exampl es dal nostro gruppo, vedere Frimat et al. 16 e Heike et al. 17). Tuttavia, incapsulando materiale modelli bioattive all'interno dei dispositivi PDMS e con l'esigenza di allineamento micrometro scala di questi per i canali microfluidica rappresenta una grande sfida tecnica. Nella sezione 3.1 un protocollo per la a-chip, o in situ, preparazione di modelli biomateriale è presentato. Questi modelli consentono la registrazione dei neuroni durante tempi lunghi della cultura e promuovere escrescenze tra i compartimenti. Microstrutture menisco-pinning sono usati per allineare una cosiddetta maschera acqua con il neurone arraying siti e canali crescita dei neuriti. La maschera d'acqua protegge i rivestimenti molecole di adesione durante il trattamento al plasma, mentre le superfici esposte sono disintegrati per definire il modello di biomateriale. Inoltre, sono disponibili protocolli per colture cellulari e per l'isolamento fluidico necessaria per il trattamento selettivo dei vari comparti co-coltura.
ve_content "> I protocolli sono progettati per sfruttare i principi user-friendly di litografia soft per la replica di poli (dimetilsilossano) (PDMS) dispositivi microfluidici 18. Allo stesso modo, in situ biomateriale patterning è semplice, sfruttando evaporazione e superficiali fenomeni di tensione, e solo richiede una sorgente di plasma portatile poco costoso. Il circuito microfluidica efficace i programmi di carico e vano cella trattamenti specifici che queste operazioni semplicemente di erogazione di materiali nella porta inferiore corretta ed aspirando dall'alto. In questo modo, si intende dare le neurobiologists la libertà di preparare e utilizzare i dispositivi microfluidici nei propri laboratori.Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I protocolli sono intesi per i neuroscienziati, e sono riassunte nella Figura 2. Come tale è consigliabile che microfabbricazione dei SU-8 master utilizzati per la replica PDMS è affidata a strutture commerciali o istituzionali. I due disegni maschera di livello sono liberamente disponibili come informazioni supplementari (ZIP) sul Royal Society of Chemistry sito 12. È importante sottolineare che il primo SU-8 strato deve essere fabbricato ad una profondità di 2,5-3,0 micron, e la seconda ad una profondità di 25-30 micron. Queste sono le dimensioni fondamentali necessarie per un efficace arraying neurone. Il limite di altezza di 3 micron è necessario anche per evitare che i neuroni trasportati o la migrazione tra i due comparti 12.
1. Replica dispositivo Microfluidic in PDMS
- Mescolare il prepolimero PDMS accuratamente con il catalizzatore (184) con un rapporto di 10:1 e degassare la miscela in un essiccatore sotto vuoto per genere 20 min. In alternativa, mettere il mixtura in un tubo da 50 ml Falcon e utilizzare a basso g centrifugazione per degasaggio.
- Posizionare il 2-strato microstrutturato SU-8 wafer su una piastra riscaldante a 80 ° C e allineare cornici polimero a ciascun dispositivo sul wafer. Versare PDMS nei frame per una profondità ≥ 5 mm e lasciarla> 1 hr per garantire completa polimerizzazione termica.
- Una volta indurito, rimuovere la cialda dalla piastra riscaldante e lasciare raffreddare su una superficie piana.
- Indossare occhiali protettivi e di lavoro da un angolo (lontano dalle SU-8 microstrutture) con un bisturi rigida al premio delicatamente il telaio e PDMS dal wafer.
- Rimuovere lo stampo PDMS dal telaio e usare un paio di forbici per tagliare il dispositivo di PDMS eccesso. Questo cosiddetto lampeggio è spesso prodotto quando un film sottile di PDMS estende tra il telaio polimero e la superficie del wafer.
- PDMS rimanenti possono essere applicate all'intero wafer e curati per proteggere il wafer durante la conservazione. Rimuovi questo prima di successivo stampaggio dispositivo, e così facendo rimuovere particolare contaminanti dalla superficie.
2. Montaggio del dispositivo e di interconnessione
- Preparare le porte di interfaccia 6 con 3 mm di diametro biopsia. Lavorare su una superficie scura, in buone condizioni di luce e con le caratteristiche microstrutturata rivolti verso l'alto per facilitare l'allineamento delle porte con i canali microfluidica.
- Controllare il dispositivo per il particolato. Elimina questa con del nastro adesivo reversibile.
- Il circuito microfluidica è incapsulato utilizzando uno strato sottile PDMS montato su un vetrino di vetro: Questi sono preparati versando un piccolo volume (~ 0,5 ml) della miscela agente PDMS polimerizzazione (10:1, 601) sulla base di un flessibile, piatto di Petri grado batteriologico. Premere delicatamente il vetrino sullo strato PDMS, posizionare sulla piastra e la cura termicamente per pochi minuti. Rapidamente dopo il raffreddamento, usare un bisturi per tagliare fuori e il premio doppio strato vetrino-PDMS dalla piastra di Petri. Tagliare con le forbici, se necessario.
- Legame plasma il dispositivo PDMSe strato di supporto per produrre una buona tenuta: condizioni ottimali sono specifici dello strumento. Ad esempio, un forno a plasma operante a 70 W e 40 kHz in un'atmosfera 0,2 mbar ossigeno per 40 sec produce un eccellente legame PDMS-PDMS. Una volta che il plasma trattato, premere due parti insieme e lasciare per un minuto pienamente legame.
- Utilizzare tubi in silicone (1,6 mm ID; 3,2 millimetri OD) per interfacciarsi con pompe e siringhe.
3. Biomaterial patterning e microfluidici Operations
I protocolli per in situ biomateriale patterning, cultura neurone e trattamenti fluidici sono illustrati nella Figura 2.
Figura 2. Protocolli microfluidica Illustrated. A) PL e PLL-g-PEG patterning; aggiunta dello strato di adesione cellulare (ad esempio,PL, verde), con l'evaporazione produce la maschera allineato acqua B) trattamento al plasma dell'aria atmosferica del PL esposta.; due perni di antenna sono utilizzati, con l'antenna introduzione plasma illustrato con una stella rosa. C) PBS (blu) lavaggio mediante aspirazione viene utilizzato per evitare di contaminare la regione di plasma trattato con PL. D) consegna del PLL-g-PEG (rosso ) per aspirazione per rivestire le regioni di plasma trattati E) cella di carico.; simultanea arraying microfluidica dei neuroni di entrambi i vani di accompagnamento per aspirazione, F) i media (rosa) perfusione con un flusso idrostatica-driven G) Isolata trattamenti fluidici.; trattamento periferico di un agente di test (nero) fornito dal ingresso inferiore accompagnamento tramite aspirazione e H) Trattamento centrale erogata dalla bocca centrale inferiore per aspirazione. Figure e leggenda riprodotte con il permesso della Royal Society of Chemistry(RSC) 12. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Subito dopo plasma legando i canali microfluidica PDMS sono altamente idrofila (angolo di contatto ≤ 5 °). Tali superfici sono adatte per l'adesione e la coltura di linee cellulari quali cellule simili ai neuroni SH-SY5Y differenziate. Per la coltura ex vivo di neuroni primari e la coltura di linee cellulari neuronali precursore come la linea cellulare Lund mesencefalico umano (LUHMES) un rivestimento poliammine, sia polilisina (PL) o polyornithine (PO), è richiesto come un'ancora elettrostatica. Inoltre proteine di adesione come laminina o fibronectina sono spesso richiesti come rivestimento-integrina interfacciamento. Tuttavia, i rivestimenti PL e PO prontamente legano i neuroni, ostacolando la consegna microfluidica ai siti di matrice e anche imponendo sollecitazioni di taglio indesiderati. Per risolvere questo problema biomateriale in-chippatterning è necessaria per la localizzazione dei materiali di adesione presso i siti trappola e microcanali escrescenza. Questo favorisce anche lo sviluppo di connessioni inter-vano e riduce entanglement locale. Il protocollo prevede anche l'aggiunta di materiali PEG ad aree limitrofe per garantire proteine e neuroni sono limitati ai punti desiderati durante la coltura lunga. Il protocollo che segue è documentato in Figura 3:
Figura 3. Acqua mascheratura di patterning biomateriale da stencil plasma. A) Illustrazione del processo di mascheramento acqua con le PDMS micropillars appuntare le menisco d'acqua sul posto per stencil plasma. Curvatura del menisco nel piano verticale è stata trascurata. B) acqua maschera visualizzata con un colorante rosso e posizionato dal menisco pinning. C) Il rivestimento fantasia PL-FITC ripreso dopo plasma stencil. D) aggiunta di proteine di rigetto e repellente cellulare PLL-g-PEG-TRITC ad un rivestimento PL-FITC plasma fantasia. Questo è stato utilizzato per la registrazione di cellule SH-SY5Y e anche per patterning uno strato fibronectina supplementare per cellule LUHMES. Figure e leggenda riprodotta con il permesso della Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
- Mascheramento Acqua per in situ Biomaterial patterning da Plasma Stenciling
- Poco dopo l'incollaggio plasma pipetta un volume di 0,5 ml di PL o PO (100 pg / ml in PBS 1x) nella porta centrale inferiore. Nel giro di pochi secondi, tutto il circuito microfluidica è riempito per azione capillare. Lasciare agire per qualche minuto a pieno rivestire le superfici PDMS idrofile con l'Polyaminiere.
- Rimuovere molecole poliammine legati mediante lavaggio aspirazione-driven con PBS 1x (vedere la Figura 2C) per 1 min.
- Rimuovere tutti PBS dai porti e riscaldare il dispositivo di illuminazione con un microscopio. Questo aumenta l'evaporazione dai porti per una rapida formazione di acqua maschera. La maschera acqua (illustrata nella figura 3A e documentato nella Figura 3B) è stabilito all'interno ~ 5 min.
- Controllare il dispositivo mediante microscopia a garantire mascheramento acqua è completa. Notare strutture serbatoio a monte del sito di matrice sono inclusi nella progettazione maschera per prolungare la stabilità della maschera acqua (~ 15 min).
- Inserire perni in acciaio inox nelle porte (Figura 2B). Questi sono utilizzati per accoppiare il plasma generato da una pressione atmosferica portatile corona scarico o generatore Tesla (per esempio, a 2 MHz, segnale 30 kV) 19,20 nei canali microfluidici vacanti. Puntare la punta di tegli plasma originario vicino alla punta di uno spillo e plasma trattare la microcanali per ≤ 1 sec. Utilizzare condizioni di scarsa illuminazione per osservare patterning plasma.
- Rimuovere la maschera acqua con una fase di lavaggio. Utilizzare aspirazione parallelo dalle 3 porte superiori. Utilizzare 4 lunghezze uguali di tubi in silicone collegati da un adattatore a 4 vie per una pompa di aspirazione di raggiungere aspirazione parallelo. Avviare aspirazione e dispensare PBS nel fondo 3 porte per disegnare PBS attraverso il circuito microfluidica. In questo modo un contrasto materiale PDMS-poliammina viene prodotto (vedere la Figura 3C). Evacuare PBS dal circuito microfluidica e lasciar riposare per alcune ore per ripristinare il, stato idrofobo nativo. Questo rende i PDMS completamente non permissiva per l'adesione cellulare.
- Qualora materiali adesione aggiuntive, come laminina o fibronectina, saranno necessari i passi seguenti sono necessari e devono essere eseguite immediatamente dopo aver rimosso la maschera acqua: Pipettare un volume di 10 microlitri dell'innesto copolimero poli-L- Lisina-poli (etilene glicole) (PLL-g-PEG, 100 pg / ml, in PBS) in entrambi i canali peggiori accompagnamento, seguita da aspirazione dai canali di accompagnamento superiori per 2 min.
- Senza interrompere il flusso, rimuovere l'eccesso PLL-g-PEG mediante scambio con un tampone PBS. Questo selettivamente riveste le regioni non poliammine rivestite con la frazione PEG agendo per prevenire delle proteine e adesione delle cellule 17,21.
- Proteine di adesione come laminina o fibronectina possono essere co-localizzati con il rivestimento poli-ammina: Pipettare 10 volumi microlitri di queste proteine ECM (tipicamente 10 pg / ml) in tutte le tre porte peggiori. Aspirare dei primi tre porte fino a quando il dispositivo viene riempito con la soluzione proteica e incubare per 1 ora a produrre un rivestimento di buona qualità.
- Rimuovere le proteine in eccesso aspirando PBS dal fondo 3 porte.
- Microfluidic singolo neurone arraying
- Prime dispositivi con appromangiato media. Aggiungere 20 microlitri volumi sul fondo 3 porte e per aspirazione in parallelo dalle tre porte superiori rapidamente riempire il circuito microfluidica con i media. Utilizzare un connettore tubo a 4 vie per accoppiare le 3 porte superiori con tubo in silicone uguale lunghezza ad una pompa di aspirazione.
- Aggiungere 20 ml di una sospensione di cellule disaggregate (1 x 10 6 cellule / ml) per ciascuna delle porte di ingresso fiancheggianti (0, in figura 1).
- Dotare una pompa di aspirazione con un regolatore di flusso o utilizzare una siringa per dolci aspirazione dai 3 porte superiori. Completa neurone arraying genere richiede 1 min.
- Raccogliere i neuroni in eccesso rimanenti nelle 4 porte che fiancheggiano con una pipetta per arraying nei successivi dispositivi microfluidici.
- Rimuovere il tubo. Riempire tutte le porte con i media e posizionare il dispositivo in incubatrice. Nel giro di poche ore le cellule diventano pienamente aderente sul modello biomateriale.
- Neuron Cultura, Messa Fluidic trattamento, e Immunostaining
- Sostituire la media da parte perfusione periodica con alimenti idrostatica (a 2 millimetri differenza di altezza della colonna è giustamente lenta).
- In alternativa, immergere il dispositivo microfluidica in media, scambiando i media periodicamente (2-3 giorni) come con colture cellulari standard.
- Selective trattamenti fluidici a uno neurone comparto cultura o il compartimento crescita dei neuriti centrale si ottengono come segue: Dispensare 20 l di sostanza in esame nella porta inferiore del canale di interesse, e aspirare dal porto direttamente sopra. Per i trattamenti lunghi riducono la portata utilizzando un regolatore di flusso e riempire la sostanza in esame come richiesto.
- Protocolli Immunostaining variano per ogni bersaglio molecolare e reagenti associati. Per contrastare il potenziale rischio di danni shear-indotta ai neuroni un flusso lento è stato usato. Ciò si traduce in un aumento dei tempi di applicazione di perfusione pienamente il sistema, estendendo normali orari di protocollo. Hyperfusione idrostatica utilizzando le porte con diverse altezze di colonna (ad esempio, da 2 mm) è stato utilizzato per fornire i reagenti. Più rapida aggiunta del reagente e asportazione mediante una pompa possono essere utilizzati per ridurre tempi sperimentali. Collegare una pompa di aspirazione a 3 porte superiori per disegnare i reagenti dal fondo 3 porte.
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Risultati
Exploit di mascheramento delle acque superficiali tensione. La tolleranza di pressione all'interfaccia aria-liquido scale inversamente con il raggio di curvatura [ 
, Producendo interfacce altamente stabili a dimensioni microfluidici. I micropillars ancorano efficacemente l'acqua maschera in luogo. Formazione di acqua maschera è guidato per evaporazione dai porti microfluidica, con il tasso aumentato di riscaldamento. Usando il c...
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Discussione
La tecnica per formare gli array microfluidica è il primo del suo genere che permette precisione un'unica movimentazione neurone per stabilire le culture minimalista. Accoppiato con il metodo in situ patterning biomateriale, un approccio efficace per allineare i modelli di cellulari con le strutture microfluidica, queste culture minimalista hanno livelli di connettività ad alta intercompartment con ridotta entanglement locale. Queste funzioni possono essere utilizzate per lo studio efficace di trasmissione ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Ulrich Marggraf (SISSA) di SU-8 fabbricazione e Maria Becker (SISSA) per l'imaging SEM. La ricerca è stata sostenuta finanziariamente dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), un Bundesministerium für Bildung und Forschung concessione (BMBF 0101-31P6541) e dalla Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf grazie Leibniz Scuola di Dottorato Internazionale "Systems Biology Lab-on-a-Chip" per il sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Vetrini coprioggetti | VWR | 630-1590 | di spessore 130-160 mm |
| Kai | Medical | Impugnare con cura - estremamente affilato | |
| Tubo Tygon | Fisher | Scientific S-50-HL | 1,65 mm ID; 3,35 mm OD |
| 1 ml siringa ( Inkjekt e Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| Connettore per tubi a 4 vie | VWR o Fisher Scientific Regolatore | ||
| flusso | Apparecchio | Harvard 722645 | |
| pin da 0,5 mm Reparti | |||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | La stabilità in stoccaggio può essere un problema |
| poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polilisina-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| Poliornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Laminina | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Microscopio fluorescente invertito | |||
| Esempio di pompa di aspirazione | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Dispositivo portatile a scarica corona | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | Potrebbe non essere conforme agli standard di sicurezza del vostro paese |
| Forno al plasma femto | Diener Essiccatore elettronico | ||
| sottovuoto o centrifuga |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
