La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Sommario

Sono disponibili diversi metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi permettono la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare. Qui, descriviamo in dettaglio una metodologia rapida e accurata per misurare simultaneamente il pH citoplasmatico e vescicolare mediante imaging raziometrico di cellule viventi.

Abstract

Il pH intracellulare è strettamente regolato e sono state riportate differenze di pH tra il citoplasma e gli organelli¹. La regolazione del pH cellulare è fondamentale per il controllo omeostatico dei processi fisiologici che includono: sintesi di proteine, DNA e RNA, traffico vescicolare, crescita cellulare e divisione cellulare. Alterazioni dell'omeostasi del pH cellulare possono portare a cambiamenti funzionali dannosi e promuovere la progressione di varie malattie². Sono disponibili vari metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi consentono la misurazione simultanea del pH nel citoplasma e negli organelli. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo rapido e accurato per la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare utilizzando la microscopia confocale su cellule viventi³. Questo obiettivo viene raggiunto con l'uso di due coloranti raziometrici sensibili al pH che possiedono una partizione selettiva del compartimento cellulare. Ad esempio, SNARF-1 è compartimentalizzato all'interno del citoplasma mentre HPTS è compartimentalizzato all'interno degli organelli endosomiali/lisosomiali. Sebbene l'HPTS sia comunemente usato come indicatore di pH citoplasmatico, questo colorante può marcare in modo specifico le vescicole lungo la via endosomiale-lisosomiale dopo essere stato assorbito dalla pinocitosi^3,4. Utilizzando queste sonde sensibili al pH, è possibile misurare simultaneamente il pH all'interno dei compartimenti endocitico e citoplasmatico. La lunghezza d'onda di eccitazione ottimale dell'HPTS varia a seconda del pH mentre per SNARF-1 è la lunghezza d'onda di emissione ottimale che varia. Dopo il caricamento con SNARF-1 e HPTS, le cellule vengono coltivate in diverse soluzioni calibrate per il pH per costruire una curva standard di pH per ciascuna sonda. L'imaging cellulare mediante microscopia confocale consente l'eliminazione di artefatti e rumore di fondo. A causa delle proprietà spettrali dell'HPTS, questa sonda è più adatta per la misurazione del compartimento endosomiale leggermente acido o per dimostrare l'alcalinizzazione degli organelli endosomiali/lisosomiali. Questo metodo semplifica l'analisi dei dati, migliora l'accuratezza delle misure di pH e può essere utilizzato per affrontare le questioni fondamentali relative alla modulazione del pH durante le risposte delle celle a sfide esterne.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni per cellulare pH Calibrazione

1. Aggiungere i seguenti composti da cinque tubi 50 ml coniche separati per preparare 5 soluzioni da utilizzare per la calibrazione:
   • NaCl (1 ml di 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml di 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • Glucosio (1 ml di 1 M D-glucosio) (1M D-Glucosio = 1,80 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml di 1 M MgSO ₄₎ (1 M MgSO ₄ = 1,20 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • HEPES 20 mM (1 ml di 1M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml....

Risultati

Per la misura simultanea di pH sia intracellulare e compartimenti cellulari endosomal / lisosomiali, sono stati usati i fluorescenti sonde pH-sensing raziometrici Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 è limitata al compartimento citosolico che HPTS permette di misurare raziometrica pH del vano endosomale / lisosomiale. Carico delle cellule con HPTS per 16 ore permette la sua localizzazione selettiva negli endosomi / lisosomi ^4. Un tipico esempio di fluorescenza registrata da cellule HT-1080 caricato con le sonde pH-sensibi.......

Discussione

Misura di pH quantitativa in live-cell imaging di diversi compartimenti cellulari è necessaria per misurare con precisione le variazioni di pH nelle risposte cellulari alle sfide esterne. Tuttavia, uno dei principali ostacoli che rimane è facile e specificamente i compartimenti cellulari. A questo proposito, alcuni studi hanno evidenziato l'uso di HPTS come indicatore di pH intracellulare introdotto in cellule mediante elettroporazione o microiniezione ^8-10. Queste tecniche soffrono di gravi inconvenienti.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzioni per taratura
Cloruro di sodio	Fischer	L-11621
Cloruro di potassio	Fischer	M-12445
D-Glucosio (destrosio)	Fischer	D16-1
Solfato di magnesio	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloruro di calcio diidrato	Fischer	M-1612
Acqua deionizzata	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Tossico per inalazione o a contatto con la pelle
Tenere al riparo dalla luce a 4 gradi; C
Piastre di coltura e vuote; 35 mm	BD Biosciences	354456
sonde
Acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico (HPTS)	Life technologies	H-348	Tenere lontano dalla luce a temperatura ambiente
5-(e-6)-carbossi-carbossi SNARF®-1, acetossimetilestere, acetato	Life technologies	C-1271	Tenere lontano dalla luce e dall'umidità a -20 gradi C
Dimetil Sufoxide (DMSO)	Fischer	BP231-1	nocivo
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 100X
Cloruro di potassio	Fischer	M-12445	20 g
Fosfato di sodio monobasico	Fischer	S369-1	115 g
Fosfato di potassio monobasico	J.T Baker	3246-01	20 g
Acqua deionizzata	N/A	N/A Portare	in autoclave da 1 L
e regolare il pH a 7,4
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Cloruro di sodio	Fischer	L-11621	40,5 g
Acqua deoinizzata	N/A	N/A	Portare a 5 L
modulatori di
Bafilomicina A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-Etil-N-isopropil)amiloride (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Cloruro di ammonio	Fischer	A649-500

per il rilevamento del pHpH