La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Sommario

Sono disponibili diversi metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi permettono la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare. Qui, descriviamo in dettaglio una metodologia rapida e accurata per misurare simultaneamente il pH citoplasmatico e vescicolare mediante imaging raziometrico di cellule viventi.

Abstract

Il pH intracellulare è strettamente regolato e sono state riportate differenze di pH tra il citoplasma e gli organelli¹. La regolazione del pH cellulare è fondamentale per il controllo omeostatico dei processi fisiologici che includono: sintesi di proteine, DNA e RNA, traffico vescicolare, crescita cellulare e divisione cellulare. Alterazioni dell'omeostasi del pH cellulare possono portare a cambiamenti funzionali dannosi e promuovere la progressione di varie malattie². Sono disponibili vari metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi consentono la misurazione simultanea del pH nel citoplasma e negli organelli. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo rapido e accurato per la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare utilizzando la microscopia confocale su cellule viventi³. Questo obiettivo viene raggiunto con l'uso di due coloranti raziometrici sensibili al pH che possiedono una partizione selettiva del compartimento cellulare. Ad esempio, SNARF-1 è compartimentalizzato all'interno del citoplasma mentre HPTS è compartimentalizzato all'interno degli organelli endosomiali/lisosomiali. Sebbene l'HPTS sia comunemente usato come indicatore di pH citoplasmatico, questo colorante può marcare in modo specifico le vescicole lungo la via endosomiale-lisosomiale dopo essere stato assorbito dalla pinocitosi^3,4. Utilizzando queste sonde sensibili al pH, è possibile misurare simultaneamente il pH all'interno dei compartimenti endocitico e citoplasmatico. La lunghezza d'onda di eccitazione ottimale dell'HPTS varia a seconda del pH mentre per SNARF-1 è la lunghezza d'onda di emissione ottimale che varia. Dopo il caricamento con SNARF-1 e HPTS, le cellule vengono coltivate in diverse soluzioni calibrate per il pH per costruire una curva standard di pH per ciascuna sonda. L'imaging cellulare mediante microscopia confocale consente l'eliminazione di artefatti e rumore di fondo. A causa delle proprietà spettrali dell'HPTS, questa sonda è più adatta per la misurazione del compartimento endosomiale leggermente acido o per dimostrare l'alcalinizzazione degli organelli endosomiali/lisosomiali. Questo metodo semplifica l'analisi dei dati, migliora l'accuratezza delle misure di pH e può essere utilizzato per affrontare le questioni fondamentali relative alla modulazione del pH durante le risposte delle celle a sfide esterne.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni per cellulare pH Calibrazione

1. Aggiungere i seguenti composti da cinque tubi 50 ml coniche separati per preparare 5 soluzioni da utilizzare per la calibrazione:
   • NaCl (1 ml di 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml di 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • Glucosio (1 ml di 1 M D-glucosio) (1M D-Glucosio = 1,80 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml di 1 M MgSO ₄₎ (1 M MgSO ₄ = 1,20 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • HEPES 20 mM (1 ml di 1M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml di H ₂ 0)
   • CaCl ₂ (0,05 ml di 1M CaCl ₂₎ (1 M CaCl ₂ = 1,47 g in 10 ml di H ₂ 0)
     Preparare tutte le soluzioni a doppia distillata H ₂ O (DDH ₂ O).
2. Completare ogni soluzione con 35 ml di DDH ₂ O e mescolare con un agitatore magnetico fino a tantoluzione è raggiunto.
3. Regolare il pH di ciascuna soluzione con 1 N KOH o 1 N HCl per ottenere valori di pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 e 7.5. Poi, regolare il volume con acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml.
4. Misura 5 mg di nigericin e aggiungerlo a 670 ml di EtOH assoluto per preparare un 10 mM nigericin soluzione stock.
   Attenzione: nigericin è altamente tossico e deve essere maneggiata con molta cura (guanti, occhiali di protezione e maschera). Miscelare la soluzione per inversione fino a quando il nigericin è completamente sciolto.
5. Aggiungere 0,05 ml di nigericin 10 mm (concentrazione finale 10 mM) ad ogni soluzione di taratura. Nigericina è uno ionoforo che aumenta la permeabilità della membrana cellulare e provoca equilibrazione di pH intracellulare ed extracellulare in presenza di una concentrazione depolarizzante di K ⁺ extracellulare.
6. Soluzioni di taratura possono essere memorizzati fino a 1 mese a 4 ° C

2. Preparazione cellulare

1. Sotto un safet biologicoCappa y, cellule seme in 35 millimetri x 10 millimetri piatti di coltura in 2 ml di terreno di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici. Usare la quantità di cellule necessarie per garantire circa il 50% di confluenza dopo 24 ore.
   NOTA: Nei nostri esperimenti, usiamo la linea cellulare HT-1080 e la piastra 1 x 10 ⁵ cellule per capsula di Petri.
2. Determinare il numero di piatti di coltura necessari per l'esperimento e piastra 5 ulteriori piastre di coltura da utilizzare per la calibrazione.
3. Piatti di porre la cultura in un C 5% CO ₂ incubatore 37 ° / per almeno 24 ore.

3. Preparazione di sonde pH-sensing

1. Preparare una soluzione madre 1M della sonda pH fluorescente 8-idrossipirene-1, 3,6 acido trisolfonico, sale trisodico (HPTS / pyranine) in DDH ₂ 0. Questa soluzione deve essere conservato a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.
2. Preparare una soluzione stock di 1 mM 5 - (e-6)-carbossilico seminaphthorhodafluor acetossimetilico estere acetato (C-SNARF-01:00; chiamato thereaopo SNARF-1) sciogliendo 1 mg di SNARF-1 in 1,76 ml di DMSO. Mescolare accuratamente pipettando ripetuta. SNARF-1 soluzione deve essere conservata a -20 ° C e al riparo dalla luce.

4. Etichettatura cellulare

1. Sedici ore prima del live-cell imaging, aggiungere 2 ml di soluzione stock 1M HPTS (concentrazione finale 1 mm) per ogni piatto di coltura contenente 2 ml di terreno completo.
2. Riportare i piatti della cultura per l'incubatore. La sonda HPTS è cell-impermeant, quindi etichetta organelli la sonda deve essere occupato da pinocitosi. Questa condizione richiede che incubazione delle cellule con HPTS vengono eseguite in medium siero supplementato cultura.
3. Dopo l'incubazione con HPTS, lavare le cellule due volte con PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero per almeno 2 ore. Incubazione con SNARF-1 deve essere eseguita in terreno privo di siero perché siero può impedire l'assorbimento della sonda.
4. Aggiungere 10 ml di un SNARF-1 soluzione stock 1 mm per ottenere afconcentrazione inale su 5 micron e consentono alle cellule di incubare per 20 min a 37 ° C, sotto la luce fioca. C-1-SNARF concentrazione e tempo di incubazione può variare a seconda del tipo cellulare.
5. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero.

5. Aggiunta di pH modulatori

1. Per valutare se il metodo può rilevare variazioni di pH nelle cellule, diversi reagenti che modulano pH intracellulare possono essere utilizzati:
   • Bafilomycin A1, un inibitore specifico della V-ATPasi ⁵
   • Na ⁺ / H ⁺ scambiatore isoforma 1 (NHE-1) ⁶
   • NH ₄ Cl, una base debole che aumenta intracellulare pH ⁷
   1. Preparare soluzioni madre dei reattivi di cui sopra:
      • Bafilomycin A1: aggiungere 10 mg di bafilomycin A1 a 160 ml di DMSO per ottenere una soluzione stock di 100 micron
      • EIPA: aggiungere 25 mg di EIPA a 1.67 ml di metanolo per ottenuna concentrazione finale di 50 mM
      • NH ₄ Cl: sciogliere 0,53 g di cloruro di ammonio in 10 ml di DDH ₂ O per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
      
      Nota: Tutte le soluzioni di archivi devono essere conservati a 4 ° C ad eccezione di bafilomycin A1, che deve essere conservato a -20 ° C e al riparo dalla luce.
   2. In piatti della cultura separati, aggiungere uno dei reagenti come descritto di seguito:
      • 2 ml di 100 mM bafilomycin A1 (concentrazione finale 100 nm)
      • 1 ml di 50 mM EIPA (concentrazione finale 25 pm)
      • 40 ml di 1M NH ₄ Cl (concentrazione finale 20 mM)
   3. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C.
2. Procedere alla acquisizione delle immagini.

6. Specifiche tecniche di imaging microscopio live-cell e impostazioni di acquisizione

1. Eseguire live-cell imaging usando un obiettivo 40X montato su una spettrale invertito confocale a scansione microscope dotato di un palco XY motorizzato, una camera che ospita fondo di vetro piatti della cultura in un (temperatura, umidità, CO ₂₎ fase di incubatore ambiente controllato.
2. Lo strumento confocale (Olympus FV1000) qui usato è dotato di:
   • Un diodo laser 405 nm
   • Un laser ad argon 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)
   • Un laser elio neon (543 nm)
   • Obiettivo Fluorite 10X, NA0.4
   • Un obiettivo LUCPLFLN 40X, NA0.60
   • Un obiettivo olio PLAPONSC PIANO APO 60X, NA1.4
   • Uno specchio dicroico DM 405/458/488/543
   • Un SDM 560 e un SDM 640 filtri dicroici
   • Un filtro barriera BA655-755
   • Un BS20/80 divisore di fascio
   • Software di analisi dei dati per acquisizione ed elaborazione,
3. Una volta che l'incubatore fase si è riscaldata fino a 37 ° C e il microscopio è istituito, mettere un piatto di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1 nella camera di imaging fase confocale.
4. Laopo l'individuazione di una zona di interesse, regolare le impostazioni di acquisizione del software Figura 1.
   • Impostare due set di canali virtuali.
   • Avviare la prima fase che corrisponde al HPTS eccitazione a 405 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 570-600 nm.
   • Avviare la seconda fase che corrisponde alla HPTS eccitazione a 458 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 640-650 nm.
   • L'apertura confocale è impostato a 175 micron per default e apertura ottimale deve essere impostata manualmente a 300 micron.
   • Prendere Immagine impilando seriali sezioni ottiche orizzontali (800 x 800 pixel) da 0,4 micron di spessore.

NOTA: Un obiettivo 40X è utile osservare più celle contemporaneamente e funziona bene per la visualizzazione organello. Tuttavia, la risoluzione spaziale e l'intensità del segnale sono better ottenuto utilizzando un obiettivo 60X olio. Inoltre, non c'è eccitazione o di emissione di diafonia tra i due coloranti.

7. Taratura delle sonde di pH-sensing

1. Prima della taratura, rimuovere terreno dalla piastra di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1, lavare due volte con PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di una delle cinque soluzioni di taratura.
2. Posizionare il piatto cultura nella camera di fase confocale.
3. Procedere al time-lapse acquisizione delle immagini secondo le seguenti impostazioni:
   1. Impostare il numero di immagini e tempi di durata degli intervalli per l'esperimento.
      NOTA: Usiamo tipicamente un intervallo di 1 minuto tra le immagini fino a 30 min.
   2. Programmare l'otturatore per chiudere tra l'acquisizione di ogni immagine.
4. Registrare l'intensità di fluorescenza per min in un foglio elettronico e determinare il momento in cui l'intensità di fluorescenza è costante. PH intracellulare è generalmente stabile dopo 15 - 20 min.
5. Ripetere passaggi 7,1-7,4 utilizzando un nuovo piatto di coltura per ogni soluzione di calibrazione rimanente.

8. Acquisizione dati

1. Una volta che la calibrazione è stato fatto, acquisire dati di esempio 4-5 campi scelti a caso contengono 15-20 cellule per campo. Due immagini sono ottenute per ciascun campo: uno per l'etichettatura HPTS (vescicole) e il secondo per SNARF-1 etichettatura (citosol).
2. Fluorescenza di fondo (zona extracellulare) viene digitalmente sottratto dalle immagini fluorescenti di entrambe le sonde. Vescicole etichettati e citoplasma dei rispettivi immagini memorizzate sono state selezionate usando una maschera binaria. Per ogni sonda pH-sensing, intensità di fluorescenza sono misurati su una scala numerica (0-4,095 scala di livelli di grigio). Una intensità medio per tutti i pixel del organello o citoplasma è calcolato ei valori vengono utilizzati per calcolare i rapporti di fluorescenza.

9. Analisi dei dati

1. I vari pacchetti software sono disponibili in commercio per l'analisi dei dati. EsempioFluoView Software.
2. In un foglio di calcolo, i valori dei record e calcolare rapporti di fluorescenza come segue: Nel caso di HPTS, R = (F _{458 nm} / F _{405 nm)} e, nel caso di SNARF-1, R = (F _{644 nm} / F _{584 nm} ).
3. Tracciare i dati utilizzando software grafici scientifici come GraphPad Prism. La trama dovrebbe ritrarre rapporti di fluorescenza (asse y) in funzione del pH (asse X). Curva di raccordo è realizzato utilizzando la regressione non lineare.
4. Raccogliere intensità di fluorescenza dei campioni come descritto al punto 8.2 e calcolare rapporti di fluorescenza. Usare curve di calibrazione per trasformare i rapporti in valori di pH.

Risultati

Per la misura simultanea di pH sia intracellulare e compartimenti cellulari endosomal / lisosomiali, sono stati usati i fluorescenti sonde pH-sensing raziometrici Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 è limitata al compartimento citosolico che HPTS permette di misurare raziometrica pH del vano endosomale / lisosomiale. Carico delle cellule con HPTS per 16 ore permette la sua localizzazione selettiva negli endosomi / lisosomi ^4. Un tipico esempio di fluorescenza registrata da cellule HT-1080 caricato con le sonde pH-sensibi...

Discussione

Misura di pH quantitativa in live-cell imaging di diversi compartimenti cellulari è necessaria per misurare con precisione le variazioni di pH nelle risposte cellulari alle sfide esterne. Tuttavia, uno dei principali ostacoli che rimane è facile e specificamente i compartimenti cellulari. A questo proposito, alcuni studi hanno evidenziato l'uso di HPTS come indicatore di pH intracellulare introdotto in cellule mediante elettroporazione o microiniezione ^8-10. Queste tecniche soffrono di gravi inconvenienti...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzioni per taratura
Cloruro di sodio	Fischer	L-11621
Cloruro di potassio	Fischer	M-12445
D-Glucosio (destrosio)	Fischer	D16-1
Solfato di magnesio	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloruro di calcio diidrato	Fischer	M-1612
Acqua deionizzata	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Tossico per inalazione o a contatto con la pelle
Tenere al riparo dalla luce a 4 gradi; C
Piastre di coltura e vuote; 35 mm	BD Biosciences	354456
sonde
Acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico (HPTS)	Life technologies	H-348	Tenere lontano dalla luce a temperatura ambiente
5-(e-6)-carbossi-carbossi SNARF®-1, acetossimetilestere, acetato	Life technologies	C-1271	Tenere lontano dalla luce e dall'umidità a -20 gradi C
Dimetil Sufoxide (DMSO)	Fischer	BP231-1	nocivo
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 100X
Cloruro di potassio	Fischer	M-12445	20 g
Fosfato di sodio monobasico	Fischer	S369-1	115 g
Fosfato di potassio monobasico	J.T Baker	3246-01	20 g
Acqua deionizzata	N/A	N/A Portare	in autoclave da 1 L
e regolare il pH a 7,4
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Cloruro di sodio	Fischer	L-11621	40,5 g
Acqua deoinizzata	N/A	N/A	Portare a 5 L
modulatori di
Bafilomicina A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-Etil-N-isopropil)amiloride (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Cloruro di ammonio	Fischer	A649-500

per il rilevamento del pHpH