Articolo metodologico

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

DOI:

10.3791/51408

⸱

29 maggio 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Singolo gene delle cellule saggio di espressione è necessaria per comprendere eterogeneità di cellule staminali.

Abstract

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Eterogeneità della popolazione di cellule staminali ostacola la comprensione dettagliata della biologia delle cellule staminali, come la loro propensione verso la differenziazione diversi lignaggi. Un singolo saggio transcriptome cella può essere un nuovo approccio per sezionare variazioni individuali. Abbiamo sviluppato la singola cellula metodo qRT-PCR, e ha confermato che questo metodo funziona bene in diversi profili di espressione genica. Nel livello di singola cellula, ogni cellula staminali embrionali umane, ordinati per OCT4 :: cellule positive EGFP, ha alta espressione in OCT4, ma un diverso livello di espressione NANOG. Il nostro unico dosaggio di espressione genica delle cellule dovrebbe essere utile per interrogare eterogeneità della popolazione.

Introduzione

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Popolazioni eucariote più elevati sono eterogenei quindi con analisi della popolazione studiata, è spesso difficile interpretare le loro caratteristiche cellulari. Le singole celle all'interno di una popolazione può essere leggermente diversa, e queste differenze possono avere conseguenze importanti per la proprietà e la funzione di tutta la popolazione 1, 2. In particolare, le cellule staminali embrionali umane (hESC) sono noti per essere eterogeneo, che causa diversi livelli di pluripotenza e le diverse potenzialità per specifiche lignaggio in delicatamente modi caratteristici 3, 4. Ad esempio, differenti antigeni di superficie cellulare possono essere usati per classificare le cellule staminali pluripotenti indifferenziate, 5 e il gruppo Austin Smith proposti diversi livelli di pluripotenza in cellule staminali embrionali di topo, in base alla loro morfologia, differenziazione propensione e dipendenza della via di segnalazione 6. Questo fenomeno è stato ipotizzato in embrione umanoLe cellule staminali nic 7. Considerando che gli studi complessivi sono stati eseguiti tra le diverse linee di cellule staminali, non i singoli cellule staminali singoli, potrebbe essere molto interessante per analizzare i diversi livelli di pluripotenza a livello di singola cellula, che interessa potenzialmente le loro capacità di differenziazione verso tutte le linee cellulari somatiche.

Eterogeneità cellulare e molecolare potrebbe essere dettata dalla trascrizione profiling, che si chiama 'trascrittoma cella singola' e sottolinea nuovi approcci per la quantificazione dei livelli di espressione genica 8-10. Per l'analisi dei livelli di espressione genica in cellule singole, abbiamo sviluppato un protocollo semplice, ma robusto di singola cellula RT-PCR quantitativa. Abbiamo confermato l'efficacia e la fattibilità del nostro protocollo confrontando ogni mezzo di lisati cellulari singole e in serie diluiti RNA totali di hESCs, con conseguente varianti tecniche minime e le differenze. Inoltre, abbiamo utilizzato una linea giornalista genetica per isolare omogenea popolazione di hESC utilizzando il sistema di targeting gene. Il vettore dei donatori per il targeting OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro costruire) e un paio di plasmidi Talen sono stati utilizzati 11. Il vettore donatore e un paio di plasmidi Talen sono state introdotte nel hESCs (H9, WA09) utilizzando il nostro nucleofection e il protocollo di selezione clonale e la manutenzione di hESC è stata effettuata sulla base della nostra protocollo di routine 12. Abbiamo confermato questa linea giornalista genetica esprimono EGFP per l'espressione OCT4 in OCT4 :: EGFP hESCs.

Il nostro risultato dimostra che i singoli hESCs (filtrate per OCT4 :: cellule fortemente positivi EGFP) tengono alti livelli di espressione OCT4, ma diversi livelli di espressione NANOG. Quindi, il nostro unico dosaggio di espressione genica delle cellule dovrebbe essere utile per studiare l'eterogeneità della popolazione di cellule staminali pluripotenti.

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Protocollo

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1. Preparazione di una piastra a 96 pozzetti

  1. Mescolare 1 ml di singola cella DNase1 a 9 ml Single Cell Lysis Solution.
  2. Mettere la soluzione miscelata 10 microlitri in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti PCR.

2. Rimozione hESCs per FACS Purificazione

  1. Staccare OCT4 :: linea di cellule EGFP ES dalla parabola di 60 mm, con 1 ml Accutase per 20 minuti, a 37 ° C, che sono stati neutralizzati con supporto ES umana.
  2. Preparare popolazione di cellule in 1 ml di tampone FACS e regolare la cella a 1 x 10 6 cellule / ml.
  3. Passare il campione cellulare attraverso un colino cellula tubo cap 35 micron.
  4. Conservare la provetta in ghiaccio prima selezione delle cellule.

3. Lisi di FACS-purificato cella singola in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti

  1. Ordinare il campione di cellule positive EGFP su un cell sorter con un operatore qualificato. Mettere la singola cella in cella singola soluzione Lysis/DNase1 in piastra a 96 pozzetti PCR. Se necessario, il 96 pozzetti con campione può essere conservato a -80 ° C congelatore inferiore a un mese.
  2. Incubare i campioni 5 min a RT per lisi cellulare.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di arresto per interrompere la reazione di lisi.
  4. Incubare 2 min a RT.

4. Trascrizione inversa

  1. Aggiungere a ciascuna una aliquota di 0,5 ml di 20 mM SMA-T15, SMA-A.
  2. Aggiungere 4 ml di buffer 5X, 2 microlitri DTT, 1 ml trascrittasi inversa, e 1 ml dNTP a ciascun bene.
  3. Eseguire la trascrizione inversa in un termociclatore.
    1. Impostare il programma termica a 42 ° C × 90 min e inattivare la trascrittasi inversa a 85 ° C × 5 min.

5. Amplificazione

  1. Aggiungere 4 ml di reagente ExoSAP-IT per ogni campione trascritto inverse.
    1. Incubare i campioni a 37 ° C per 15 min e 80 ° C per 15 minuti per inattivare il reagente ExoSAP-IT.
  2. Preparare PCR reazione mix wesima SMA-p2 (2 nm)
  3. Aggiungere 10 ml di miscela di reazione PCR per ciascun campione inverse trascritto.
  4. Eseguire l'amplificazione, composto da 20 cicli di denaturazione (94 ° C per 30 sec), ricottura (57 ° C per 30 sec), e l'estensione (68 ° C per 10 min).

6. QRT-PCR prestazioni

  1. Aggiungere 10 ml di 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ml amplificato cDNA, 2 primer nm e 7 microlitri di acqua a ciascun pozzetto.
    1. Impostare il programma seguito da 95 ° C per 3 sec, 60 ° C per 30 sec x 40 cicli.
  2. Eseguire in duplicato per errori tecnici.

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Risultati

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Efficiente e robusto singola amplificazione RNA cellulare

Per ridurre al minimo la variazione trascrizionale tra hESCs, abbiamo usato OCT4 :: EGFP hESC clone per FACS purificazione. Dopo la cernita Oct4 :: cellule positive EGFP in una piastra a 96 pozzetti, ogni cella viene lisato in tampone di lisi e convertito poli (A) + RNA a piena lunghezza cDNA utilizzando SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer di ancoraggio e con SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG...

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Discussione

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Singolo profiling genica con cellule potrebbe essere un importante strumento per predire la funzionalità di una singola cellula o di un intera popolazione. A causa di limitazioni tecniche, tutta l'analisi del gene profiling è stato limitato alla media della popolazione. Le variazioni nei modelli di espressione genica e di livelli tra le singole cellule e le sottopopolazioni sono state proposte per provocare interpretazioni errate. Tali aspetti cellulari diversi possono essere trovati in hESCs e la loro eterogeneità ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lee per le discussioni importanti sul manoscritto. Il lavoro in laboratorio Lee è stato sostenuto da sovvenzioni dal Robertson Investigator Award of Foundation di New York Stem Cell e dal Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra PCR a 96 pozzettiUSA scientific1402-8900
Kit di lisi cellulare AmbionTechnologies4458235
SMARTScribe Trascrittasi inversaClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNA polimerasi Alta fedeltàInvitrogen11304
10 mM dNTP Mix, PCR GradeInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
tampone45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μ l DNasi, filtro sterilizzato
35 μ tubi con tappo per filtro cellulare mBD Biosciences352235
Life FACS

Riferimenti

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qRT PCR a singola cellulaOrdinamento cellulare attivato da fluorescenzaTrascrizione inversaReazione a catena della polimerasiCellule positive OCT4 EGFPProfilazione dell espressione genicaEterogeneit della popolazioneMarcatori delle cellule staminali

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