Mass spettrometria di imaging (MSI) è un potente strumento che può essere utilizzato per scoprire e identificare le varie specie chimiche nei tessuti intatti, preservando i composti nel loro ambiente naturale, in grado di fornire nuove intuizioni in processi biologici. Qui un metodo MSI sviluppato per l'analisi di piccole molecole è descritto.
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Articolo metodologico
MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in
In questo articolo
Sommario
Abstract
La maggior parte delle tecniche utilizzate per studiare piccole molecole, come farmaci o metaboliti endogeni, impiegare estratti tissutali che richiedono l'omogeneizzazione del tessuto di interesse che potrebbe potenzialmente causare variazioni nelle vie metaboliche in fase di studio 1. Mass spettrometria di imaging (MSI) è uno strumento di analisi potente che può fornire informazioni spaziali di analiti all'interno fette intatto di campioni di tessuti biologici 1-5. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare vari tipi di composti tra cui proteine, peptidi, lipidi, e piccole molecole come metaboliti endogeni. Con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI)-MSI, distribuzioni spaziali di più metaboliti possono essere rilevati simultaneamente. Qui, un metodo sviluppato specificamente per lo svolgimento di mirati metabolomica MSI esperimenti sulle radici di legumi e noduli radicali viene presentata, che potrebbe rivelare intuizioni processi biologici che avvengono. Ilmetodo qui presentato mostra un flusso di lavoro tipico MSI, dalla preparazione del campione per l'acquisizione delle immagini, e si concentra sulla fase di applicazione matrice, dimostrando diverse tecniche applicative matrice che sono utili per rilevare piccole molecole. Una volta che vengono generate le immagini MS, l'analisi e l'identificazione dei metaboliti di interesse è discusso e dimostrato. Il flusso di lavoro standard qui presentato può essere facilmente modificato per diversi tipi di tessuto, specie molecolari, e la strumentazione.
Introduzione
Il settore in crescita della metabolomica ha molte importanti applicazioni biologiche, tra cui la scoperta di biomarcatori, decifrando vie metaboliche nelle piante e negli altri sistemi biologici, e tossicologia profiling 4,6-10. Una grande sfida tecnica quando si studiano i sistemi biologici è quello di studiare percorsi metabolomica senza interrompere il loro 11. MALDI-MSI consente per l'analisi diretta dei tessuti intatti che consente il rilevamento sensibile di analiti in singoli organi 12,13 e perfino singole cellule 14,15.
La preparazione del campione è un passo cruciale nella produzio....
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Protocollo
1. Strumentazione
- MALDI-TOF/TOF MSI. Utilizzare uno spettrometro di massa equipaggiati con una sorgente MALDI per l'analisi di piccole molecole (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Effettuare acquisizioni in modalità ione positivo o negativo a seconda degli analiti di interesse. Specificare un intervallo di massa di interesse e raccogliere 500 colpi laser / spot a 50 micron intervalli in entrambe le dimensioni X e Y attraverso la superficie del campione per generare immagini di ioni. La larghezza raster e numero di colpi laser possono essere regolati per ottenere rispettivamente maggiore risoluzione spaziale e l'intensità del....
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Risultati
Una panoramica sperimentale di MSI è mostrato in Figura 1. All'inizio dell'esperimento, preparazione del campione è un passaggio fondamentale. I noduli vengono tagliati dalla radice vegetale e incorporati in gelatina. Il tessuto deve essere appiattita contro la tazza criostato, in assenza di bolle, mentre viene congelato; questo garantirà allineamento facile e corretto del tessuto mentre viene sezionato. Quando il tessuto viene affettato, è importante tagliare il tessuto allo spessore adeguato; .......
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Discussione
Come discusso sopra, la preparazione del campione è la fase più critica del flusso di lavoro MSI. Incorporare il tessuto non uniforme causerà sezionamento essere difficile o impossibile in alcuni casi. La dimensione del vano e adeguato tempo di equilibrio sono cruciali per mantenere l'integrità dei tessuti ed evitando piegatura e lacrime. Selezione di matrice e tecnica di applicazione giocherà un ruolo nella determinazione dei tipi di analiti da rilevare, la risoluzione spaziale, e la riproducibilità dei risultati. .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Jean-Michel Ané presso il Dipartimento di Agronomia a UW-Madison per la fornitura di campioni truncatula Medicago. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation (NSF) concessione CHE-0957784, l'Università del Wisconsin Graduate School e la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) e il programma Romnes Ricerca Faculty Fellowship (LL). EG riconosce un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.256.259).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gelatina | Difco | 214340 | heat per sciogliere |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Vetrini rivestiti di ossido di indio stagno (ITO) | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0,8 mm (larghezza x lunghezza x spessore) |
| Matrice di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Aerografo | Paasche Aerografo Azienda | TG-100D | accoppiato con contenitore in acciaio da 75 ml |
| Sistema di spruzzatura a matrice automatica - TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX. TMSP. H021-U | Istruzioni specifiche per l'avvio e lo spegnimento verranno fornite al momento dell'installazione dello strumento |
| Apparecchio a sublimazione | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Pompa per vuoto- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Pressione finale = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | Un esempio di "software specifico per il venditore" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | Strumento MALDI ad alta risoluzione per misurazioni accurate della massa |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Strumento LC-MS ad alta risoluzione per misurazioni accurate della massa |
Riferimenti
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217....
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Ristampe e permessi
